癌症预防研究（Phila）。作者手稿；PMC 2016年9月1日提供。
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美国国立卫生研究院：NIHMS702873
短期1,25-二羟维生素D的影响三埃洛替尼对口腔癌的预防作用
,1 ,1 ,2 ,三 ,4 ,1 ,1和1,三，4,*
阿姆丽塔·苏雷什
三罗斯韦尔公园-马祖达尔-肖癌症中心合作研究项目
Moni A.Kuriakose女士
4口腔医学与头颈外科
穆昆德·塞沙德里
1药理学和治疗学系
三罗斯韦尔公园-马祖达尔-肖癌症中心合作研究项目
4口腔医学与头颈外科
1药理学和治疗学系
2病理学和检验医学系
三罗斯韦尔公园-马祖达尔-肖癌症中心合作研究项目
4口腔医学与头颈外科
*通讯作者：Mukund Seshadri博士，CGP L4-314，Roswell Park Cancer Institute，Elm and Carlton streets，Buffalo，New York 14263，电话：716-845-1552，传真：716-85-8857，gro.krapllewsor@irdahseS.dnukuM公司 - 补充资料
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摘要
表皮生长因子受体（EGFR）通路的激活是头颈部癌变的早期事件。因此，以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）化学预防受到了广泛关注。在本研究中，我们检测了1,25（OH）的影响2D类三是营养补充剂维生素D的活性代谢物，对EGFR抑制剂厄洛替尼对HNSCC的化学预防效果有影响。在患者源性异种移植物（PDX）和4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）致癌物诱导的HNSCC模型中进行了实验研究。1,25（OH）对PDX荷瘤小鼠的短期治疗（4周）2D类三厄洛替尼能显著抑制肿瘤生长。非侵入性磁共振成像（MRI）能够纵向监测4NQO模型中的疾病进展，在24周内100%的对照动物显示出肿瘤病变的证据。在实验组中，采用联合方案治疗的动物的肿瘤发病率和体积下降幅度最大（p<0.05）。联合治疗耐受性良好，与体重无明显变化。组织病理学评估显示，联合治疗后异型增生程度显著降低。全舌提取物的免疫印迹分析显示，与联合方案相比，磷酸-EGFR和磷酸-Akt下调。这些结果突出了1,25（OH）的潜力2D类三增强厄洛替尼对HNSCC的疗效。为了充分发挥这种方法的潜力，必须进一步优化这种联合疗法的时间表和顺序，并调查钙类似物或膳食维生素D的活性。
关键词：维生素D、EGFR、HNSCC、4NQO、埃洛替尼
简介
表皮生长因子受体（EGFR）是一种膜结合受体，属于Erb-B/HER受体家族，在约80-90%的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中过表达(1,2). 临床前研究的令人鼓舞的结果导致临床评估并随后批准了西妥昔单抗（一种抗EGFR的单克隆抗体）用于HNSCC的临床应用(三,4). 另一种EGFR靶向酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼目前正在接受治疗HNSCC的临床评估(5).
EGFR的激活被认为是HNSCC发生的早期事件(6,7). 据报道，可能是由于“局部癌变”导致的原发性或继发性头颈癌风险患者的组织学正常粘膜中EGFR mRNA的生成增加(6). 陶迪·本切克罗恩等研究表明，EGFR的表达和基因拷贝数可以预测癌前病变向口腔鳞癌的进展(7). 这些观察结果导致了EGFR作为化学预防靶点的研究。埃洛替尼目前正在对其在头颈癌患者中的化学预防潜力进行临床评估(8,9). 增强埃洛替尼化学预防效果的新型联合方法也在研究中(10,11). 在这方面，具有良好安全性的天然化合物或营养补充剂具有吸引力，可作为潜在的“生物佐剂”用于癌症预防(10,11). 在本研究中，我们检测了1,25-二羟维生素D的影响三[1,25（OH）2D类三]是营养补充剂维生素D的活性代谢物，作为生物佐剂，对埃洛替尼对HNSCC的化学预防效果有影响。
维生素D是一种调节钙和磷代谢的secosteroid pro-hormone体内通过对肾脏、肠道和骨骼的作用(12). 流行病学研究表明，维生素D可能是癌症的潜在风险调节因子(13,14). 维生素D可以从饮食中获得，也可以在紫外线照射下从皮肤中的7-脱氢胆固醇合成。它最初被运输到肝脏，在那里羟基化为25-羟基维生素D三然后在肾脏中进一步水解为1,25（OH）2D类三(12). 临床前研究表明，1,25（OH）2D类三在纳米摩尔浓度下可以抑制SCC细胞的生长和增殖(15,16). 1,25（OH）的抗肿瘤活性2D类三被认为是一系列机制的结果，从细胞周期阻滞到诱导凋亡和抑制血管生成(16–18). EGFR的激活导致下游PI3K-AKT信号的激活，该信号参与细胞生存、增殖和血管生成(19). 1,25（OH）2D类三已经证明可以减少Erk和Akt的磷酸化，这是它们活化所必需的(20). 基于这一知识，我们假设使用1,25（OH）靶向这些相互作用途径2D类三联合厄洛替尼可能是预防HNSCC的有效策略。为了验证这一假设，在患者源性异种移植物（PDX）和致癌诱导的HNSCC模型中进行了实验研究。进行非侵入性成像结合组织学和分子分析，以检查这种联合策略对HNSCC的安全性和有效性。
材料和方法
肿瘤模型
使用严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（实验动物资源，RPCI）和C57Bl/6小鼠（马里兰州罗克维尔国家癌症研究所）中建立的患者源性HNSCC异种移植物进行实验研究，这些小鼠暴露于饮用水中的致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO；西格玛，圣路易斯，密苏里州）。动物被安置在空调和灯光控制室（12小时循环）层流装置中的微隔离笼中。我们之前描述了HNSCC的PDX模型的建立(21). 简单地说，通过在暂时吸入麻醉（2–3%异氟烷）下皮下手术移植肿瘤块，在SCID小鼠中建立异种移植物。将致癌物4NQO以50 mg/ml溶解在丙二醇中，并以最终浓度100μg/ml添加到饮用水中。在动物饮用水中给予4NQ0 14周。水被换了随意每7-10天。在14周致癌物暴露期结束后，提供常规高压水。对照动物始终接受高压灭菌水。致癌物暴露方案是根据已发表的报告选择的，这些报告表明，在该模型中，在致癌的不同阶段，病变的形成是一致的(22,23). 所有实验程序均按照RPCI动物护理和使用机构委员会（IACUC）批准的方案进行。
研究设计
PDX-HNSCC研究
PDX模型中的研究示意图如所示植入后一周，雌性SCID小鼠（体重约20 g）皮下移植HNSCC，随机分为4组：对照组、厄洛替尼组、1,25（OH）组2D类三单独或联合用药（每组n=6–10）。动物接受厄洛替尼（Selleck Chemicals，德克萨斯州休斯顿），剂量为25 mg/kg（每周5天）。1,25（OH）2D类三（Hoffman-La Roche，Inc.，Nutley，NJ）在100%乙醇和磷酸盐缓冲盐水中重新配制，并以0.1μg的剂量给药（i.p.3天/周，MWF 4周）。在30天内测量肿瘤生长动力学和体重变化。
研究设计和实验队列患者衍生异种移植模型的实验设计总体方案和研究终点（A）和4NQO诱导的HNSCC模型（B）如图所示。
4NQO模型
4NQO模型中研究的研究设计如所示在暴露于4NQO 14周后，动物被随机分为对照组，厄洛替尼，1,25（OH）2D类三或组合臂（n=每臂12–13）。药物剂量和治疗持续时间与PDX研究相同。在第14周（致癌物暴露后和开始治疗前）、第18周（治疗4周后）和治疗结束后第22、24和26周进行纵向磁共振成像（MRI）检查。暴露于常规饮用水的幼稚动物（n=3）在第0周和第26周也接受了MRI检查。在整个研究期间，每隔两天在白光下对动物口腔进行一次目视检查，以监测肿瘤生长情况。在第26周进行组织病理学评估（每组7–9例）。通过干预期间和干预后每周三次的体重测量来评估全身毒性。当发现体重持续下降（≥初始体重的20%）时，对动物进行人道安乐死。在第18周和第26周对部分动物（每组3只）进行免疫印迹分析。
肿瘤生长测量
对于皮下移植HNSCC的动物，进行卡尺测量以计算肿瘤体积（mm三)使用公式，V=½（L×W2)，其中L是最长轴，W轴垂直于L。每周进行2-3次测量，并绘制肿瘤体积变化图（肿瘤体积分数）。当肿瘤负担达到机构协议规定的安乐死阈值时，对动物实施安乐死。
体内成像
实验MRI检查使用4.7T/33-cm水平孔磁铁（GE NMR Instruments，Fremont，CA）结合AVANCE数字电子（Bruker Biospec with Paravision 3.0.2；Bruker Medical Inc.，Billerica，MA）进行。在成像之前和成像期间，使用2.5%异氟醚（Benson Medical Industries，Markham，ON，Canada）麻醉动物。将小鼠固定在配备有温度和呼吸监测传感器的形状适合的MR兼容雪橇（Dazai Research Instruments，Toronto，Canada）中。雪橇连同一个含有0.15 mM钆喷替酸二甲葡胺（Gd-DTPA；Magnevist，Berlex Laboratories，Wayne，NJ）的幻影一起放置在扫描仪内，使用塑料输送管。在成像过程中，使用空气加热器系统（SA Instruments Inc.，Stony Brook，NY）将动物体温保持在37°C，并通过雪橇中的热电偶以及加热器附带的计算机软件启动自动温度反馈。使用以下参数采集每只小鼠的轴向多层T2加权自旋回波图像，其中包含RARE（松弛增强快速采集）编码：矩阵尺寸256×192，TE/TR=41/2500 ms，切片厚度1 mm，视野（FOV）：3.2×3.2 cm，切片数量=20。MR图像采集后，将原始图像集传输到处理工作站并转换为分析™格式（AnalyzeDirect，7.0版；美国堪萨斯州Overland Park）。在整个肿瘤周围追踪感兴趣区域（ROI）并保存为对象图。通过测量包含肿瘤的每个切片的横截面积，并将总和乘以切片厚度，计算肿瘤体积。
免疫染色和组织病理学评估
将整个舌标本固定在10%中性缓冲福尔马林（Sigma，CA）中进行免疫染色和组织学检查。如前所述，使用单克隆抗体9A7（MA1-710；伊利诺伊州罗克福德的Thermo Fisher Scientific Pierce抗体产品）对整个舌头切片进行维生素D受体（VDR）的免疫染色(24). 将切割为4μm的石蜡包埋切片置于带电载玻片上，并在60°C下干燥1 h。将去石蜡的载玻片装入Dako自动染色机（丹麦Dakocytomation）进行免疫染色(24). 用哈里斯苏木精（Poly Scientific，Bayshore，NY）对载玻片进行反染色。使用Scanscope XT系统（Aperio、Vista、CA）对幻灯片进行扫描和数字化，并使用ImageScope软件捕获图像。舌的苏木精和伊红染色切片由一名认证的病理学家进行检查，其临床实践重点是头颈癌，对治疗臂、影像学发现和结果一无所知。角化过度（角化层增厚）、异型增生分级（报告为每个标本确定的最差分级；结构紊乱、核质比增加、核染色过深、核分裂象增加或异常）和浸润性癌（直接侵犯结缔组织基质）的组织学评估如前所述进行(25).
免疫印迹法
通过使用针对这些标记物的一级抗体对全舌提取物进行免疫印迹，测定组织中EGFR、VDR和磷酸化形式的EGFR和Akt的表达水平。使用以下主要抗体进行Western blot：多克隆兔抗EGFR（1005；德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯）、单克隆大鼠抗VDR（克隆号：9A7；马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科学公司）、单抗兔抗磷酸化-EGFR（磷酸化Y1092；abcam，剑桥，马萨诸塞）、多克隆兔抗磷酸化-AKT1（磷酸化S473；马萨诸塞州剑桥市abcam）。使用抗狂犬病和抗鼠辣根过氧化物酶结合二级抗体（GE Healthcare，Pittsburgh，PA），并使用增强化学发光法进行印迹。每次实验中都使用Actin（I-19；德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯）作为负荷控制。为了评估蛋白质表达的差异，使用UN-SCAN-IT程序（Silk Scientific，Inc.，Orem，UT）分析了蛋白质印迹膜。在每个表达带周围安装大小相等的感兴趣区域（ROI）以测量总像素。使用从印迹中获得的总像素和从相应的肌动蛋白印迹中获取的总像素，获得标准化表达值[（抗体总像素/肌动蛋白总像素）/平均对照组织表达]。
统计考虑因素
所有测量值均报告为平均值的平均值±标准误差。所有统计分析均使用Graph Pad Prism 6.00 for Windows（Graph Pad-Software，加利福尼亚州拉霍亚；网址：www.graphpad.com). 根据肿瘤体积（肿瘤体积分数）随时间的变化，使用指数增长方程计算肿瘤加倍时间（PDX模型）。疾病进展被定义为PDX模型中达到3倍初始肿瘤体积的时间。无进展生存期的Kaplan-Meier生存曲线由肿瘤体积分数的变化和使用log-rank检验分析的生存差异生成。使用双尾非配对分析MRI计算的肿瘤体积差异t吨测试。采用双尾Fisher精确检验分析MRI和组织学上病变发生率的差异。使用双尾t检验分析各组之间的蛋白质表达差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
联合治疗对PDX-HNSCC肿瘤生长的影响
我们检查了我们的联合方案对患者肿瘤来源的HNSCC异种移植物的疗效。给患有皮下肿瘤的小鼠单独服用厄洛替尼，1,25（OH）2D类三单独或联合用药4周。显示了对照组动物个体肿瘤体积的变化()仅厄洛替尼()，1,25（OH）2D类三独自一人()和组合组(). 作为单一制剂，厄洛替尼和1,25（OH）2D类三对肿瘤生长影响最小。然而，联合治疗抑制了肿瘤生长，导致肿瘤倍增时间显著增加（p<0.05）()与对照组和单药治疗组相比。Kaplan-Meier生存曲线()与对照组和厄洛替尼或1,25（OH）相比，联合治疗可显著提高肿瘤体积的变化所产生的生存率2D类三独自一人。
1,25（OH）的功效2D类三在HNSCC的PDX模型中与厄洛替尼联合应用单个动物肿瘤体积的变化（A）控制（n=10），（B）仅厄洛替尼（n=6），（C）1,25（OH）2D类三仅（n=10）和（D）联合治疗（n=6）组。（E）条形图显示了根据生长曲线计算出的所有组肿瘤的倍增时间。（F）所有四组动物的Kaplan-Meier生存曲线显示，与对照组和单药治疗组相比，联合治疗组动物的生存效益显著*表示p<0.05。
维生素D受体在4NQO模型中的表达
1,25（OH）的影响2D类三通过与维生素D受体（VDR）的相互作用介导。因此，在检查联合方案的疗效之前，我们对幼年和4NQO暴露小鼠的舌切片进行了VDR免疫染色。中显示的图像面板表示从naive获得的舌VDR染色部分的显微照片()和4NQO处理小鼠(). 相应的苏木精和伊红（H&E）染色切片()和4NQO处理的舌头也显示出来(). 暴露于4NQO的舌中可见VDR表达增加()特别是在表现出增生和异常增生变化的区域()，与天真的舌头的正常上皮相比(). 在4NQO治疗的侵袭性鳞状细胞癌舌区也观察到VDR的高表达()与未经治疗的幼稚舌头相比().
维生素D受体在4NQO模型中的表达新生儿免疫染色切片（A）和4NQO暴露舌头（B、C）在第26周检测维生素D受体（VDR）。幼稚舌的相应H&E染色部分（D），4NQO治疗舌（E、F）也显示了。放大棒，100μm。
口腔癌变的体内无创成像
我们利用非侵入性MRI监测4NQO模型中的口腔癌变。显示了一只4NQO治疗动物在14周、18周和26周时的轴向T2加权MR图像。与天真的控制相比()，接触4NQO()导致口腔形态发生变化，包括舌头变厚，尤其是舌侧缘(轮廓为白色)提示背部表面增生和外生损伤的发展(,箭头).显示MR图像以及相应的体内和体外研究结束时（第26周）的数字图像，以及幼稚舌和4NQO治疗舌的整个舌H&E切片。与影像学数据一致，4NQO治疗的舌头的组织学评估证实了异型增生和局灶浸润性鳞癌()第26周。
4NQO诱发口腔癌的MRI研究体内（A）研究开始时（第0周）和结束时（第26周），一只幼稚C57Bl/6小鼠的T2加权轴位图像。此外，还显示了小鼠的照片以及获取的MRI切片的横切面，以便于定位。（B）接触致癌物4NQO 14周后不同时间点C57Bl/6小鼠的T2加权轴位图像。箭头指向肿瘤的位置，舌头外侧边缘的增厚区域用白色勾勒出来。（C）第26周，一只幼稚小鼠和一只4NQO治疗小鼠的T2加权轴向MRI图像。对应的舌头数字图像(体内和体外)连同组织切片一起显示。（D）单用厄洛替尼（25 mg/kg p.o，5天/周，共4周）和联合1,25（OH）短期治疗后4NQO模型MRI可见病变的发生率2D类三（0.1μg静脉注射，每周3天，连续4周）。暴露14周后，将动物随机分为对照组或治疗组。在第26周（治疗结束后8周）进行MRI检查。
放射和病理反应评估
我们使用MRI检查了我们的预防性干预措施对4NQO模型中肿瘤发病率的影响。如。如所示，在接触致癌物4NQO的对照组中，100%的动物在26周时的MRI上显示出肿瘤。作为单一试剂，1,25（OH）2D类三对肿瘤发病率的影响最小，而厄洛替尼单独使用可使肿瘤发病率降低33%。仅暴露于厄洛替尼和1,25（OH）组合的动物2D类三MRI显示肿瘤发病率下降最大且具有统计学意义（~40%，p<0.05）。单用埃洛替尼组和联合用药组在MRI上可见病变的发生率差异无统计学意义。对一组动物进行纵向MRI检查（每组5–6只；). MRI检查显示，早在第15周，对照组的肿瘤就开始生长。此时，T2加权MRI显示存在一个大肿瘤（约220 mm三)对照组1/6只动物舌背周围肌肉和骨骼广泛浸润(补充图S1).显示了每组动物的纵向T2加权MR图像。在第18周（治疗4周后），对照组剩余5只动物中的4只和1,25（OH）组的3/5只2D类三单独组在MRI上显示出肿瘤生长的迹象。而单独用厄洛替尼治疗的1/5动物显示出肿瘤存在，而联合组的动物（0/5）在MRI上没有显示肿瘤生长的证据。到第24周，对照组的动物100%在MRI上表现出肿瘤生长。各组动物的单个肿瘤体积如所示补充图S2和数字化体外动物舌头的图像显示在补充图S3.对照组1个肿瘤，1,25（OH）组1个2D类三被确定为统计异常值(图S2)并被排除在分析之外。对照组和1,25（OH）之间的平均肿瘤体积2D类三单独组具有可比性(). 在所有组中，联合组的动物肿瘤体积最低（与对照组相比p<0.05；). 对整个舌组织进行组织病理学评估，以确定预防性干预对癌前病变和肿瘤病变的影响。对照舌（7/7）组织学检查显示中度-重度异型增生(和补充图S4). 1,25（OH）处理2D类三或埃洛替尼导致发育不良程度的最低程度降低(). 相比之下，联合治疗可显著（p<0.05）降低异型增生的严重程度，其中5/9（~56%）只动物表现出轻度异型增生。对照舌的侵袭性SCC发生率最高（71.4%），而1,25（OH）单剂治疗的侵袭性SCC发生率最高2D类三厄洛替尼与鳞状细胞癌的发病率分别约为38%和63%。联合用药组动物的侵袭性鳞状细胞癌发病率下降幅度最大（约33%；与对照组相比p<0.05）。在整个研究过程中进行体重测量，以衡量治疗的安全性和耐受性。在4NQO暴露和厄洛替尼1,25（OH）治疗期间，任何组的体重均无显著变化2D类三或组合().
厄洛替尼-1,25（OH）的化学预防效果和毒性2D类三4NQO模型中的组合处理（A）图像组表示每个实验组第18、22和26周的小鼠的轴向T2加权MR图像。暴露于4NQO 14周后，动物被随机分为对照组（无治疗）、厄洛替尼组（25 mg/kg p.o，5天/周，共4周）、1,25（OH）2D类三（0.1μg静脉注射，每周3天，连续4周）或联合用药。箭头指向舌头上肿瘤的位置。（B）显示了根据不同时间的多层T2加权图像计算的肿瘤体积（每组5个）。（C）根据组织学评估，所有4个实验组动物的癌前病变（异型增生）和肿瘤病变发生率。也从只接触饮用水的动物身上获得舌头（第5组；n=3）。（D）在26周内对所有4个实验组的动物进行了体重测量（每组5只）。
相互作用机制
为了研究这两种药物之间相互作用的潜在机制，我们检测了厄洛替尼和1,25（OH）的作用2D类三治疗结束后（第18周）和停止治疗后8周（第26周）EGFR、磷酸化EGFR、AKT和VDR水平。1,25（OH）处理2D类三导致EGFR增加()与厄洛替尼治疗相比，对p-EGFR水平没有任何影响(). 联合治疗与EGFR显著增加相关，但与18周时p-EGFR显著降低相关()和第26周(). 值得注意的是，与单独埃洛替尼或1,25（OH）相比，联合治疗后全舌提取物的免疫印迹显示p-EGFR和p-AKT显著降低2D类三第26周独自一人(). 18周时，所有治疗组的VDR水平均低于对照组(). 在第26周，与单药厄洛替尼治疗相比，联合治疗导致VDR表达显著降低().
免疫印迹分析联合治疗的分子变化EGFR、p-EGFR、p-AKT和VDR在从未治疗的对照动物和单独用厄洛替尼治疗的动物获得的全舌提取物（每组n=3）中的表达水平，1,25（OH）2D类三在第18周单独或组合（A）（4周治疗方案完成后24小时）和第26周（B）如图所示。*表示p<0.05。
讨论
头颈部癌症是局部侵袭性肿瘤，会导致患者功能和审美能力下降(26). 确定新的预防策略可能会对这些患者的生活质量和生存率产生重大影响。关于1,25（OH）活性的大量文献2D类三对抗乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和皮肤癌(16,27和中的引用）。1,25（OH）2D类三已经证明可以抑制口腔鳞状细胞癌细胞系的生长在体外在生理和超生理浓度(28). 迈尔等。已经证明给药1,25（OH）2D类三抑制金黄地鼠颊袋模型癌变(29). 在本研究中，我们研究了短期1,25（OH）的疗效2D类三联合EGFR抑制剂厄洛替尼治疗HNSCC。在PDX荷瘤小鼠中进行的研究结果显示，联合治疗可显著抑制肿瘤生长。为了研究这种联合方法对整个致癌谱的影响，我们在一个经过验证的致癌诱导HNSCC模型中进行了临床前研究。这些研究表明，联合治疗具有良好的耐受性，并且与体重的任何显著变化无关。病理学评估显示，与单药治疗相比，联合治疗显著降低了异型增生的严重程度。
活检标本的组织病理学确认仍然是检测患者口腔癌的金标准。然而，该技术的侵入性排除了对致癌作用的系列评估体内为了克服这一局限性，我们采用了一种基于MRI的非侵入性成像方法来纵向表征4NQO模型中的口腔癌变。MRI无需使用电离辐射或放射性示踪剂，即可提供极好的软组织对比度和良好的空间分辨率。在实验组中，接受联合方案治疗的动物肿瘤发病率和体积下降幅度最大。虽然联合治疗组在MRI和组织学检查中可见病变的发生率最低，但与单药厄洛替尼相比，联合治疗4周后肿瘤发生率的降低没有显著差异。这些观察结果表明1,25（OH）2D类三对疾病进展的影响比侵袭性癌症的发病率更大。然而，为了更好地理解这一问题，需要在更长的治疗时间（10-12周）内对这种联合方案的疗效进行调查。
1,25（OH）的生物活性2D类三通过维生素D受体（VDR）介导，维生素D受体是一种高亲和力、低容量的受体蛋白，主要位于细胞核中，作为配体依赖性转录因子，与维生素D反应元件结合，从而激活或抑制靶基因(16,17). VDR存在于肠道、肾脏、骨骼以及多种癌症中，包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌(24,30). 在我们的研究中，我们观察到，与原始舌组织相比，接触致癌物的舌中VDR染色增加。这一观察与袁最近的一份报告一致等。与正常口腔粘膜相比，人口腔鳞癌中VDR免疫反应增强(31). 在同一研究中，与4NQO治疗的小鼠的正常口腔粘膜相比，在小鼠口腔鳞癌病变中也观察到VDR免疫染色增强。据报道，VDR在人类癌前病变和口腔鳞状细胞癌患者中的表达增加(32).
确定1,25（OH）之间相互作用的潜在机制2D类三和埃洛替尼，我们检测了两种药物EGFR和VDR途径的作用。我们观察到1,25（OH）治疗后EGFR增加2D类三这与Desprez之前的观察结果一致等在乳腺癌中(33). 有趣的是，在乳腺癌细胞系中也有EGFR表达降低的报道(34). 用钳子钳起等研究表明，表皮生长因子和1,25（OH）对结肠癌细胞的生长调节2D类三由受体表达的相互调节介导。具体来说，用1,25（OH）处理2D类三最小化配体占用EGFR而EGF抑制Caco-2结肠腺癌细胞中VDR的表达(35). 在我们的研究中，western blot分析显示，与对照组和单药治疗相比，联合治疗后p-EGFR表达显著降低。用1,25（OH）下调p-EGFR表达2D类三即使在停止治疗后（第26周相当于停止治疗后的8周），也似乎持续存在。同样，与对照组相比，我们在第18周治疗后观察到VDR下调。虽然这种降低在统计上并不显著，但在第26周，与单独使用厄洛替尼相比，联合治疗组VDR显著降低。西加特（Segaert）等.，之前已经表明角质形成细胞中VDR的表达仅限于活跃的循环细胞(36). 因此，联合治疗后观察到的VDR降低可能反映了细胞增殖的潜在下降。联合1,25（OH）也观察到p-AKT显著下调2D类三和厄罗替尼与对照组比较。与此一致，科德罗等。，表明用1,25（OH）处理2D类三抑制表皮样癌细胞中EGFR的配体依赖性磷酸化和下调EGFR-生长信号(37). 总之，这些观察结果表明EGFR和VDR信号通路之间的相互作用是复杂的，并且不同类型的癌细胞之间的串扰性质不同。此外，Lathers等。已经证明给药1,25（OH）2D类三可以通过减少免疫抑制CD34（+）细胞的存在来提高HNSCC患者的免疫能力(38). 1,25（OH）治疗HNSCC患者2D类三在手术前3周，也有证据表明可以刺激免疫细胞渗入肿瘤并延迟复发时间(39). 鉴于这些结果，研究1,25（OH）的潜在免疫和抗炎作用2D类三也会提供有价值的机械洞察力。虽然这两种药物之间的相互作用机制需要进一步研究，但我们的结果表明，联合治疗可以持续抑制EGFR下游的多种信号通路。
任何组合方法的临床成功实施都需要证明其安全性和耐受性，因为任何预防性干预的关键要求是“首先不造成伤害”(40). 在这方面，几项临床试验表明，服用1,25（OH）2D类三是安全可行的(41,42). 1,25（OH）的易用性2D类三其多样的生物效应有力地支持了其作为化学预防剂的用途。在我们的研究中，1,25（OH）2D类三给药剂量为0.1μg（i.p.），每周3天（MWF），持续4周。小鼠的药代动力学分析表明，该剂量下的峰值血浆浓度为12ng/ml(43)这是一种可以在人体内安全达到的浓度。另一方面，厄洛替尼是一种口服活性药物，患者可以在不去化疗输液诊所和有输液相关过敏反应风险的情况下服用。已发表的厄洛替尼临床前研究报告了50 mg/kg或更高剂量对小鼠的疗效(44,45). 我们观察到25 mg/kg剂量的厄洛替尼抑制肿瘤生长的证据（5天/周，共4周）。基于体表面积归一化方法(46)，这相当于人体每天约122毫克的剂量。然而，罗森塔尔最近的一项研究等强调了接受手术的头颈癌患者长期服用150毫克埃洛替尼（每日）作为佐剂的耐受性较差(9). 在这项研究的31名患者中，只有8名患者完成了为期12个月的150毫克厄洛替尼治疗疗程（每周5天）。由于对长期治疗的不耐受，导致治疗中断和剂量减少。虽然我们在研究中没有观察到任何毒性证据，但未来的研究应调查低剂量长期厄洛替尼治疗的疗效和毒性。
我们认识到我们研究的局限性。鉴于该工作的主要目标是检查1,25（OH）短期联合治疗的影响2D类三而厄洛替尼，我们使用了预先定义的26周的终点进行评估（基于已发表的文献）。因此，这些研究并不能检验长期治疗对生存率（牺牲时间）的影响。其次，我们的研究是使用两种药物的单一给药方案进行的。因此，不同治疗方案和/或持续时间对疗效的影响仍有待解决。考虑到EGFR和VDR途径之间的相互影响，有理由推测，使用这两种药物优化剂量、顺序、暴露时间和干预时机（癌前vs.早期疾病vs.已确诊疾病）可能是疗效的关键决定因素。最后，1,25（OH）引起高钙血症的潜在风险2D类三使其临床翻译复杂化。为了克服这一点，未来的研究应该调查维生素D的低钙类似物对抗HNSCC的潜力。膳食维生素D也可以作为一种安全的方法来促进局部组织产生1,25（OH）2D类三饮食补充的方便性使其对临床翻译特别有吸引力。我们已经开始在实验室中解决其中一些问题，并将在未来报告我们的发现。
致谢
财务支持：这项工作得到了罗斯韦尔公园联盟基金会（M.Seshadri，P.A.Hershberger）和国家卫生研究院（P30CA06156，C.S.Johnson）的资助。
作者感谢Margaret Folaron、Steve Turowski（小动物生物成像资源）以及罗斯韦尔公园癌症研究所（RPCI）的实验动物资源、病理资源网络和小鼠肿瘤模型资源的工作人员提供的技术援助。
工具书类
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