临床投资杂志。2015年2月2日;125(2): 687–698.
丙酮酸羧化酶对非小细胞肺癌的增殖至关重要
,1,2 ,三 ,三,4 ,5 ,1,6,7 ,4 ,4 ,4 ,2 ,7 ,4,6,7和1,4,6,7
凯瑟琳·塞勒斯
1美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学化学系。
2英国伦敦国家医学研究所医学研究委员会生理和代谢司。
Michael Bousamra,二世
三外科,
4詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心,
理查德·东芝
1美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学化学系。
6美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学监管与环境分析代谢组学中心(CREAM)。
7美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学环境与系统生物化学中心马基癌症中心毒理学和癌症生物学系。
Jun Yan先生
4詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心,
玛丽亚·尤尼娃
2英国伦敦国家医学研究所医学研究委员会生理和代谢司。
拉胡尔·德什潘德
7美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学环境与系统生物化学中心马基癌症中心毒理学和癌症生物学系。
安德鲁·莱恩
4詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心,
6美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学监管与环境分析代谢组学中心(CREAM)。
7美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学环境与系统生物化学中心马基癌症中心毒理学和癌症生物学系。
特蕾莎·W·M·范
1美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学化学系。
4詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心,
6美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学监管与环境分析代谢组学中心(CREAM)。
7美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学环境与系统生物化学中心马基癌症中心毒理学和癌症生物学系。
1美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学化学系。
2英国伦敦国家医学研究所医学研究委员会生理和代谢司。
三外科,
4詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心,
5病理学和检验医学系
6美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学监管与环境分析代谢组学中心(CREAM)。
7美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学环境与系统生物化学中心马基癌症中心毒理学和癌症生物学系。
通讯地址:Teresa W.M.Fan或Andrew N.Lane,毒理学研究生中心/马基癌症中心,523 Biopharm Complex,789 S.Limestone St.,University of Kentucky,Lexington,Kentucky 40536,USA电话:859.218.1028转1043;电子邮件:moc.liamg@nafmwt(T.W.M.风扇)。电话:859.218.2868;电子邮件:ude.yku@enal.werdna; (A.N.车道)。 2013年9月3日收到;2014年12月4日验收。
介绍
几十年来,有氧条件下加速糖酵解(“Warburg效应”)一直是癌症的标志(1). 现在人们认识到癌细胞必须经历许多其他的代谢重编程(2)以满足日益增长的合成代谢和能量需求(三,4). 也越来越清楚的是,不同的癌症类型可能利用各种依赖于环境的代谢适应(5–11)与代谢改变是癌症的标志这一概念相称(12). 葡萄糖摄取增强和有氧糖酵解产生能量(即ATP)和分子前体,用于合成复杂碳水化合物、糖核苷酸、脂类、蛋白质和核酸(三,13,14). 然而,仅仅增加糖酵解不足以满足增殖癌细胞的总代谢需求。克雷布斯循环也是丙酮酸、脂肪酸氧化的能量来源(15)以及谷氨酰胺等氨基酸(10,16,17). 此外,一些克雷布斯循环中间产物对合成代谢和谷胱甘肽代谢至关重要,包括柠檬酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸().
PC在人类NSCLC肿瘤中被激活。(A类)PC和GLS1催化Krebs循环中的主要合成补体输入(蓝色),以支持生物合成的合成代谢需求(绿色)。还显示了13C来自13C类6-葡萄糖通过糖酵解并通过PC进入Krebs循环(红色)。(B类)人类NC肺(N)和NSCLC(C)组织中PC和GLS1蛋白表达水平的代表性Western blots。(C类)成对PC和GLS1表达(n个=86)归一化为α-微管蛋白并绘制为对数10CA/NC组织比率。对于PC,几乎所有的对数比率都是阳性的(86个中有82个),聚集在0.5–1的范围内(即,肿瘤组织中的表达通常是正常的3到10倍;Wilcoxon试验,P(P)< 0.0001). 相反,GLS1表达在阳性和阴性对数之间几乎均匀分布10并且在CA和NC组织之间没有显示出统计学上显著的差异(Wilcoxon检验,P(P)= 0.213). 水平条表示中间值。(D类)与配对NC肺组织相比,CA组织中的体内PC活性增强(n个=34)从相同的人类患者中切除13C类6-肿瘤切除前2.5~3小时血糖。PC活性根据13C类三-柠檬酸盐(Cit+3),13C类5-Cit(Cit+5),13C类三-苹果酸(Mal+3),以及13C类三-GC-MS测定的天冬氨酸(Asp+3)*P(P)<0.05和**P(P)<0.01(按配对学生)t吨测试。误差条代表SEM。
克雷布斯循环的持续运作需要补充被转移用于合成代谢或谷胱甘肽合成的中间产物。这一补充过程或回补是通过两条主要途径完成的:谷氨酰胺水解(谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶[GLS]脱酰胺,再加上谷氨酸转氨成α-酮戊二酸)(18,19)以及丙酮酸通过依赖ATP的丙酮酸羧化酶(PC)羧化为草酰乙酸(EC 6.4.1.1)(参考文献。三,20,21、和). 这些途径的相对重要性可能取决于癌症的性质及其特定的代谢适应,包括对微环境的代谢适应(20,22).
例如,在胶质瘤细胞系SF188中,谷氨酰胺水解被激活,而PC活性缺失(17)尽管正常星形胶质细胞中存在高PC活性(23,24). 然而,SF188细胞使用PC来补偿GLS1抑制或谷氨酰胺限制(20),而PC,而不是GLS1,被证明是小鼠原发性神经胶质瘤异种移植物中Krebs循环的主要再疏松输入(22). 目前还不清楚PC和GLS1在其他癌症细胞类型中的相对重要性,或者最相关的是在人体原位肿瘤组织中。我们从5例非小细胞肺癌(NSCLC)患者中获得的初步证据表明,与成对的非癌(NC)肺组织相比,癌(CA)组织中PC的表达和活性上调(21)尽管尚不清楚PC激活是否适用于更大的非小细胞肺癌队列,或者PC表达是否与癌症和/或基质细胞相关。PC激活和谷氨酰胺酶状态之间的关系在人类患者研究中也没有探索过。此外,PC在细胞生存和增殖中的作用,以及谷氨酰胺水解能否在PC抑制下补偿肺癌细胞中的这种作用,尚不清楚。
在这里,我们大大扩展了我们以前的发现(21)在更大的队列中(n个=86),通过评估谷氨酰胺酶1(GLS1)状态并详细分析NSCLC中PC抑制的生化和表型后果。我们发现癌性(CA)肺组织中PC活性和蛋白表达水平平均分别比从NSCLC患者切除的成对NC肺组织高100%和5-10倍,而GLS1表达无明显趋势。我们还将稳定同位素解析代谢组学(SIRM)分析应用于培养中的配对新鲜切除的CA和NC肺组织切片(类似于Warburg切片;参考文献。25)使用[U-13C] 葡萄糖或[U-13C、,15N] 谷氨酰胺作为示踪剂。这种新的方法提供了有关肿瘤代谢途径和动力学的信息,而没有体内全身代谢的并发症。我们使用免疫组织化学分析来验证PC在肿瘤组织内癌细胞中的特异性定位。我们使用shRNA进一步确定了PC在NSCLC细胞系中的功能作用,这表明PC活性的减弱抑制了小鼠异种移植瘤中的细胞增殖、集落形成和肿瘤生长,同时降低了细胞淬灭氧自由基的能力。这些表型效应可能与体外和体内培养的肺腺癌A549细胞系中PC抑制的几个重要代谢结果有关,包括脂质和核苷酸生物合成减少以及谷胱甘肽稳态改变。
结果
PC的表达和活性,但谷氨酰胺酶的表达在恶性NSCLC肿瘤的早期阶段显著增强。
PC蛋白在原发性非小细胞肺癌组织中的表达显著高于成对相邻的NC肺组织(n个= 86,P(P)<0.0001,Wilcoxon检验)(). 肿瘤中PC的表达中位数是肿瘤中PC表达的7倍,肿瘤中最可能的(模态)过度表达大约是肿瘤中的3倍(参见补充表1; 本文的在线补充材料;数字对象标识:10.1172/JCI72873DS1). 我们发现,86例患者中有82例在肿瘤组织中的PC表达也高于在NC组织中检测到的PC表达。相反,GLS1在肿瘤和NC组织中的表达没有显著差异(P(P)=0.213,Wilcoxon检验)(和补充表1).
为了评估体内PC活性13C类三-Asp来自13C类6-葡萄糖()通过气相色谱-质谱(GC-MS)检测注入非小细胞肺癌患者体内的药物。一次10克的团注13C类6-50ml生理盐水中的葡萄糖平均占44%13输注后立即在血糖中富集C(补充表2). 由于在输液和肿瘤切除之间大约2.5小时内,标记的葡萄糖被各种组织吸收,因此血糖浓度下降到17%(补充表2). CA和NC肺组织中的标记葡萄糖被代谢为标记乳酸盐,但这种情况在CA组织中发生的程度要大得多(补充图1A)表明这些组织中的糖酵解加速。
浓缩13C类三-Asp(PC标记,)平均增长117%(n个= 34,P(P)<0.005)在非小细胞肺癌肿瘤中比在NC肺组织中().13C类三-在克雷布斯循环的第二轮之后,也可以通过以下方式生产天冬氨酸13C类4-柠檬酸盐,它是13C类2-乙酰辅酶A和13C类2-草酰乙酸(OAA)。自从13C的富集13C类4-柠檬酸盐前体低于13C类三-Asp产品(补充图1、B和C、和)它反对这条路线对13C类三-天冬氨酸富集。我们还通过分数13C其他标记物富集,13C类三-柠檬酸盐,13C类5-柠檬酸盐,以及13C类三-CA肺组织中苹果酸含量分别比NC肺组织高27%、88%和113%(). 我们还观察到13C类三-柠檬酸盐在分步富集中比13C类5-柠檬酸盐适用于CA和NC肺。这可能归因于预期的低水平13丙酮酸和乙酰辅酶a因大量稀释13人体中的C-葡萄糖示踪剂,导致13C类三-OAA与13C类2-乙酰辅酶A比未标记的乙酰辅酶a产生更少13C类5-柠檬酸盐比13C类三-柠檬酸盐。此外13C类三-NC肺CA中的柠檬酸盐低于13C类5-柠檬酸盐(). 这可能是由于与NC肺相比,CA肺中丙酮酸脱氢酶启动(PDH-启动)的Krebs循环反应的通量增加,这可以从以下方面得到证明:13C类2CA与NC肺Krebs循环代谢物的同位素(补充图1B). 这反过来可能导致相对较高的13C类2-乙酰辅酶A及其产物(13C类5-柠檬酸盐)与13C类三-CA肺OAA与NC肺OAA的比较。总之,这些PC标记物的部分富集显著增加反映了癌症组织中PC活性的增加(我们在这里提到)。
除了增强标记PC标记的产生,我们还观察到在13C类2-克雷布斯循环代谢物(柠檬酸+2、谷氨酸+2,琥珀酸+2和富马酸+2)、苹果酸+2以及天冬氨酸+2的同位素补充图1B)NSCLC肿瘤中的葡萄糖氧化水平高于NC肺组织,这表明通过PDH在Krebs循环中葡萄糖氧化水平增强。
新鲜组织(Warburg)切片证实非小细胞肺癌中PC和Krebs循环活动增强。
为了进一步评估人类肺组织中PC活性与GLS1活性的相关性,将13例人类非小细胞肺癌患者新鲜切除的配对CA和NC肺组织薄片(<1mm厚)培养于13C类6-葡萄糖或13C类5,15N个2-谷氨酰胺24小时。这些组织在培养条件下至少24小时保持生化活性和组织完整性(,补充图2,A和B、和参考。26). 当组织与13C类6-葡萄糖、CA切片显示糖酵解富集的百分比明显更高13C类三-乳酸(3英寸)与NC切片相比,这表明了Warburg效应。此外,CA组织中的13C类4-,13C类5-、和13C类6-柠檬酸盐(柠檬酸盐分别为4、5和6,in)而非癌组织。这些异构体需要PDH、PC和Krebs循环的多个循环的联合作用(). 与标记的柠檬酸盐数据一致13C类三-,13C类4-、和13C类5-谷氨酸(在)CA组织中的Krebs循环和PC活性增强。
与成对NC肺切片相比,体外CA肺组织切片通过糖酵解和Krebs循环(有或无PC输入)增强了葡萄糖氧化。将13例人类非小细胞肺癌患者新鲜切除的CA和NC肺组织薄片与13C类6-方法中所述的24小时葡萄糖。通过GC-MS测定乳酸、柠檬酸、谷氨酸和天冬氨酸的富集百分比(A类)1H(H){13C} HSQC NMR显示标记的乳酸、谷氨酸和天冬氨酸增加。此外,CA组织升高13腺嘌呤核苷酸(1′-AXP)核糖部分的C丰度表明组织是活的,核苷酸合成能力增强。(B类)CA组织切片(n个=13)通过糖酵解增加了葡萄糖代谢,这是基于13C类三-乳酸(“3”),通过Krebs循环13C类4–6-柠檬酸盐(“4-6”)和13C类3–5-谷氨酸(“3-5”)(参见13C命运追踪C类). *P(P)<0.05和**P(P)<0.01(按配对学生)t吨测试。误差条代表SEM(C类)原子解析图说明了PC、PDH和2圈Krebs循环活动如何产生13柠檬酸和谷氨酸的C同位素B类其在CA组织切片中的富集显著增强。
当组织切片与13C类5,15N个2-谷氨酰胺,13C类5,15N个1-谷氨酸(6个谷氨酸补充图2C)CA和NC组织中均产生谷氨酰胺酶,表明谷氨酰胺酶活性(见下文)。此外13C类4-琥珀酸、富马酸、苹果酸和柠檬酸的同位素(补充图2C)被检测到,这证实了谷氨酰胺酶的作用。然而,Krebs循环中间产物除1个同位素外的所有同位素的富集模式都来源于13C类5,15N个2-谷氨酰胺在CA和NC组织中具有可比性(补充图2C). 这些数据以及GLS1表达数据()表明GLS1是活跃的,并且可能在两种组织的克雷布斯循环恢复中起重要作用。但与PC不同,相对于NC肺组织,GLS1在NSCLC肿瘤中没有显著激活。
PC位于非小细胞肺癌肿瘤的癌细胞中。
非小细胞肺癌肿瘤是一种异质性很强的肿瘤,由多种细胞类型组成,包括癌上皮细胞、肺细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞,如巨噬细胞。为了确定PC是否在癌细胞中特异性表达,我们对9例患者样本的配对CA和NC组织进行了免疫组织化学分析。和补充图3与配对NC肺组织中的PC水平相比,4例NSCLC肿瘤中的PC水平升高,这在其他5对样本中也很明显(数据未显示),并且与Western印迹数据一致(). 此外,PC定位于癌上皮细胞的核周区域,而不是肿瘤组织中的基质细胞(、左下面板和补充图3D). 这种核周染色模式与PC在线粒体中的定位一致,这得到了PC核周共染色和NSCLC A549细胞线粒体标记物的支持(补充图3、C和D).
肺组织中PC的免疫组织化学定位。用抗PC抗体对非小细胞肺癌患者的CA和NC组织进行染色。所示为1名患者的典型显微照片。原始放大倍数,×400(顶部面板)和×600(底部面板)。补充图3提供了其他患者数据。在CA组织中,活的癌细胞对PC染色强烈,而巨噬细胞染色较弱,其他基质细胞对PC没有染色。在邻近的NC组织中,巨噬细胞对PC染色较强,而肺细胞对蛋白质染色很弱。
相反,在NC肺组织中,只有巨噬细胞在PC中富集,而其他细胞类型中的PC染色较弱或缺失(和补充图3). 因此,PC优先定位于异质性肺癌组织的癌细胞中。
shRNA对肺癌细胞中PC的抑制导致生长停滞,并降低体内肿瘤负担。
为了评估PC在肺癌细胞生存和生长中的作用,我们使用PC特异性shRNA来抑制个人计算机人A549腺癌细胞的mRNA表达。如所示补充图4A,载体shPC54将PC蛋白水平降低到对照水平的20%,而在用shPC55转导的细胞中几乎没有检测到PC表达。为了验证细胞中PC活性的抑制,我们将空载体(shEV)、shPC54和shPC55转导的A549细胞培养在13C类6-葡萄糖24小时,用GC-MS测定PC活性标记物(). 的级别13C类三-柠檬酸盐,13C类三-天冬氨酸,以及13C类三-两种结构均能降低苹果酸;然而,shPC55比shPC54更有效(补充图4B). 值得注意的是,PC活性的增加可能发生在其他不相关的转化细胞系中(三,27). PC敲除减缓细胞生长,shPC55再次比shPC54更有效(补充图4C). 这证实了shPC55在更大程度上击倒了PC(补充图4A). 此外,PC敲除大大减少了软琼脂中形成的菌落数(补充图4D),细胞活力降低(补充图4E)和改变的形态(补充图4F).
由于shPC55是抑制PC表达和活性的更有效构建体,我们用它来探测PC抑制对额外的NSCLC腺癌细胞系H1299、H2030、HCC827和PC9的影响。PC敲除抑制了所有测试细胞系的净生长(). HCC827和PC9细胞对PC敲除的敏感性高于A549、H2030或H1299细胞。HCC827和PC9细胞也比A549和H1299表达更多PC(补充图5A). 集落形成试验表明,PC敲除显著抑制A549和PC9细胞在软琼脂中形成集落的能力(). 尽管PC抑制并没有减少H1299细胞产生的菌落总数(),它极大地影响了每个群体的规模(补充图5B)这与细胞生长较慢一致(). 此外,前列腺癌抑制细胞变大且多核,多核程度随时间增加(补充图6,A–C).
通过shRNA抑制PC抑制体外和体内人类NSCLC细胞系的增殖和致瘤性。用嘌呤霉素进行转导和筛选后1周开始进行增殖和克隆形成试验。转导后8天在NSG小鼠中进行A549异种移植*P(P)< 0.01, **P(P)< 0.001, ***P(P)<0.0001,以及****P(P)<0.00001(学生)t吨检验,假设方差不相等。误差条代表SEM(A类)用shPC55或shEV转导NSCLC细胞系。增殖试验(n个=6)在相对较长的潜伏期后,所有5个细胞系中的PC敲除均显示出显著的生长抑制。(B类)集落形成分析表明,PC敲除降低了A549和PC9细胞在软琼脂中形成集落的能力(n个= 3). (C类)shPC55转导A549细胞的肿瘤异种移植的生长速度比对照shEV肿瘤慢2倍(P(P)<0.001由未配对的韦尔奇版本t吨测试)。肿瘤大小计算为πab/4,其中a和b是x,y直径。每个点代表平均6只小鼠。实线是非线性回归拟合方程:尺寸=a+bt吨2,如方法中所述。(D类)小鼠异种移植中PC基因敲除的程度(n个=6)比细胞培养中的小,导致PC表达减弱(对照组的30%–60%)和生长抑制减少。此外,根据皮尔逊相关系数,切除肿瘤中PC的表达与个体生长率相关。
然后,我们确定了PC-抑制的A549细胞在免疫缺陷小鼠的肿瘤生长中是否受到损害。我们观察了用空载体(shEV)或shPC55(shPC)转导的A549细胞注射NSG小鼠后的肿瘤生长率。PC基因敲除导致肿瘤生长速度减慢2倍(P(P)=0.001),如通过肿瘤生长动力学的二次曲线拟合所评估的(和补充表3). 我们发现,到第14天,肿瘤生长减少的情况已经很明显(P(P)= 0.009). 此外,肿瘤重量的终点分析显示,shPC55异种移植中的肿瘤比shEV异种移植小30%(P(P)= 0.0073). 然而,体内敲除并不像细胞培养中那样有效。我们发现,36天后,敲除肿瘤中PC的表达增加到使用对照空载体的肿瘤中PC表达的30%至60%(补充图7A). 有趣的是,单个肿瘤的生长速度显著相关(P(P)=0.006)及其PC表达水平(). 因此,残留的PC表达可能是shPC55肿瘤生长能力有限的原因。总之,这些数据表明PC的表达对体内肿瘤的生长很重要。
PC基因敲除扰乱了克雷布斯循环活动、细胞合成代谢能力和谷胱甘肽稳态。
为了研究PC敲除的代谢后果,A549细胞被shPC55转导,生长于13C类6-葡萄糖或13C类5,15N个2-此外,将shPC55或shEV转导的A549细胞植入小鼠体内,注射13C类6-葡萄糖。利用葡萄糖示踪剂,我们没有发现PC影响有氧糖酵解的证据,因为PC敲除细胞在培养基中有相似的葡萄糖消耗和总乳酸和标记乳酸的产生(补充图7B). 此外,释放到培养基中的乳酸在PC-敲除细胞和对照细胞中具有相同的富集模式百分比(补充图7C). 同样,携带shEV或shPC55的小鼠肿瘤的总乳酸浓度相当,标记的乳酸来源于13C类6-葡萄糖(补充图7D)和乳酸富集模式的百分比(补充图7E).
相比之下,PC敲低降低了13C类6-葡萄糖通过克雷布斯循环。如预期,糖酵解进入13C类三-丙酮酸通过PC进入克雷布斯循环受到抑制,这表明13C类三同位素和13C类5-柠檬酸盐(以蓝色圆圈突出显示). 有趣的是,丙酮酸通过PDH进入也受到PC击倒的阻碍(在). 我们在由PC-敲除细胞引发的小鼠肿瘤中观察到了相同的趋势(补充图8)尽管其影响不如细胞培养中的严重。这再次与体内PC敲除的A549细胞能够在一定程度上恢复PC表达的发现相一致(补充图7A). 通过细胞和肿瘤中的Krebs循环还观察到葡萄糖氧化减少1H(H)-{13C} 异核单量子相干(HSQC)核磁共振(补充图9,A和C),这表明13C从葡萄糖示踪剂转化为柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酸残基的谷胱甘肽。
PC敲低扰乱了整个Krebs循环中的葡萄糖和谷氨酰胺流量。13C同位素浓度通过GC-MS测定(n个= 3). 值表示三倍的平均值,带有标准误差*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001,以及****P(P)<0.0001(学生)t吨检验,假设方差不相等。实验重复3次。(A类)用shPC55转导A549细胞10天,然后用13C类6-葡萄糖24小时。正如预期的那样13通过PC和Krebs循环活性产生的Krebs周期代谢物的C同位素在PC-deficient细胞中耗尽(由原子分辨图中的蓝点和条形图中的蓝色圆圈跟踪;另请参见图2C)。此外,13C类6-通过PDH的葡萄糖代谢也受到干扰(用红色圆点表示)。(B类)用13C类5,15N个2-谷氨酰胺表明,通过GLS的回补输入并不能补偿PC活性的损失,因为GLS活性减弱,正如活性标记(用红点和圆圈表示)所推断的那样。苹果酸酶(ME)对谷氨酰胺衍生苹果酸的脱羧作用以及谷氨酰胺衍生丙酮酸通过PC或PDH重新进入Krebs循环(分别以蓝色和绿色显示)也有所减弱。紫色钻石表示15N;黑钻石表示14N。
由于谷氨酰胺水解是另一个主要的补体途径,我们询问该途径是否可以弥补NSCLC细胞中PC缺乏。shPC55或shEV转导的A549细胞与13C类5,15N个2-谷氨酰胺追踪谷氨酰胺水解。如所示,GLS1活性可产生13C类5,15N个1-谷氨酸盐(6)来自13C类5,15N个2-谷氨酰胺(7),随后进入克雷布斯循环以生成13C类4-琥珀酸盐(4),13C类4- (4)或13C类4,15N个1-天冬氨酸(5)、和13C类4-柠檬酸盐(4). A549细胞容易吸收和代谢13C类5,15N个2-谷氨酰胺进入这些标记代谢物。然而,所有这些标记同位素的水平在PC-敲除细胞中都显著降低(在),这与GLS活性降低一致。GLS活性的降低在1H(H)-{13C} HSQC光谱显示,PC-抑制细胞在谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸中加入较少的谷氨酰胺碳(补充图9B). 应该注意的是,酰胺转移酶的活性也有助于生产和补充图9B然而,酰胺转移酶活性的变化不太可能解释所观察到的由PC敲除诱导的Gln代谢受阻。这是因为A549细胞或小鼠异种移植物中PC的敲除导致GLS1表达受到抑制(补充图10A). 此外,A549细胞在细胞裂解液中表现出较高的GLS1表达和GLS活性,表明GLS1的表达对A549细胞的生长很重要(见下文)。
为了进一步探讨谷氨酰胺在前列腺癌抑制细胞中利用的重要性,用2或0.2 mM谷氨酰胺培养A549细胞。我们发现谷氨酰胺限制使对照细胞的生长速度显著降低约30%,但对PC-敲除细胞没有影响(补充图10、B和C). 因此,谷氨酰胺水解不能补偿PC作为NSCLC细胞中Krebs循环中间产物前体的补体供应商的损失。
除了提供还原当量和能量(ATP和GTP)外,克雷布斯循环还为合成代谢提供各种前体。例如,柠檬酸盐从线粒体输出,为脂肪酸合成提供乙酰辅酶A;OAA转氨基为天冬氨酸,用于嘧啶生物合成;α-酮戊二酸胺化为谷氨酸,用于从头合成谷胱甘肽;苹果酸脱羧生成丙酮酸,为脂质生物合成和谷胱甘肽还原提供NADPH(). 为了确定PC抑制对Krebs循环的扰动如何影响这些合成代谢途径,我们使用SIRM跟踪生长在13C类6-葡萄糖或13C类5-谷氨酰胺示踪剂。
PC敲除降低了细胞培养和体内尿嘧啶和腺嘌呤核苷酸的水平(补充图11,A和B). 这些变化至少部分归因于PC敲除减弱了这些核苷酸的生物合成,HSQC NMR分析中观察到的标记葡萄糖与C1′核糖碳的结合减少证明了这一点1H(H){13抄送}(补充图9A和补充图11A). 这可以解释为尿嘧啶和胞嘧啶环的生成减少,这是由于细胞内葡萄糖和谷氨酰胺合成其前体天冬氨酸减少所致()和体内(补充图8). 通过傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR-MS)分析,我们观察到UTP和CTP环中葡萄糖和谷氨酰胺碳的掺入较少().
PC抑制阻碍了Krebs循环驱动的生物合成。(A类)13C原子分解嘧啶生物合成13C类6-葡萄糖和13C类5-谷氨酰胺用一个13C类5-通过磷酸戊糖途径(PPP)产生的核糖部分(红点)和13C类1-3尿嘧啶环(蓝点)来源于13C类2-4-通过克雷布斯循环或ME和PC的联合作用产生的天冬氨酸(蓝色圆点)。用shPC55或shEV转导的A549细胞与13C类6-葡萄糖或13C类5-谷氨酰胺24小时。来自极性细胞提取物的FT-ICR-MS分析的UTP和CTP等位异构体的部分富集显示13C类6-葡萄糖衍生13C类5-核糖(5同位素)和13C类6-葡萄糖–或13C类5-谷氨酰胺衍生13C类1-3-嘧啶环(“6–8”或“1–3”同位素,用绿色虚线矩形突出显示;对于“6-8”同位素,513Cs来自核糖和1-313C来自环)(10,45)。这些数据表明,PC敲除抑制葡萄糖和谷氨酰胺从头合成嘧啶。(B类)葡萄糖和谷氨酰胺碳通过柠檬酸盐进入脂肪酸。对非极性细胞提取物标记脂质的FT-ICR-MS分析表明,PC敲低严重抑制了葡萄糖和谷氨酰胺碳进入磷脂酰胆碱脂质的脂肪酰基链(偶数)和脂肪酰基链加甘油主链(奇数>3)。然而,合成13C类三-甘油骨架(“3”同位素)或其前体13C类三-α-甘油-3-磷酸(αG3P,m+3)来自13C类6-PC基因敲除增强而非抑制葡萄糖。这些数据表明,PC抑制特别阻碍A549细胞中脂肪酸的合成。值表示三倍的平均值(n个=3),标准误差*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001(学生)t吨检验,假设方差不相等。
通过FT-ICR-MS评估同一细胞提取物的非极性组分中的脂质生物合成,该方法可以分解大量完整的脂质并测定其含量13甘油和脂肪酰基成分中的C富集(28). PC敲除大大抑制了葡萄糖和谷氨酰胺示踪剂中主要细胞膜成分磷脂酰胆碱的合成(). 使用13C类6-葡萄糖作为示踪剂,13丙三醇骨架(313C原子)、脂肪酰基链(甚至13C) 和甘油加脂肪酰基残基(奇数>313C) shEV控制单元中(28). 随着PC抑制,几乎所有磷脂酰胆碱物种要么未标记(作为0),要么仅在甘油主链标记(作为3),而13反映葡萄糖合成脂肪酰基的C同位素(偶数和奇数>3)在A549细胞中显著减少。此外,甘油骨架前体α-甘油-3-磷酸(αG3P)(如13C类三-αG3P源自13C类6-葡萄糖)积聚在PC-敲除细胞中(). 同样,脂肪酰基的合成13C类5-谷氨酰胺(“偶数”)通过谷氨酰胺水解,PC-抑制细胞的Krebs循环大大减弱。综上所述,这些结果表明,PC敲除通过阻断脂肪酰基成分的生物合成而不是葡萄糖衍生的甘油骨架,从而严重抑制脂质生成。这与克雷布斯循环活动减少一致(),这反过来又减少了线粒体的柠檬酸盐输出,从而在细胞质中提供脂肪酸前体乙酰辅酶A。
最后,通过以下方法分析了谷胱甘肽的从头合成1H(H){13C} HSQC核磁共振。PC敲除抑制了葡萄糖和谷氨酰胺合成谷胱甘肽(补充图9,A和B). 减少从头合成导致还原型谷胱甘肽(GSH;补充图12,A和B). 同时,PC-敲除细胞积累的氧化谷胱甘肽(GSSG;补充图12,A和B)导致细胞培养和体内GSH/GSSG比率显著降低(补充图12C). 为了确定谷胱甘肽稳态的这种扰动是否会损害PC-抑制细胞处理氧化应激的能力,我们通过DCFDA荧光测定了ROS的生成。PC-敲除细胞的基础活性氧比对照细胞多70%以上(0 mM H2O(运行)2;补充图12D). 当细胞暴露于浓度不断增加的H时2O(运行)2,敲除细胞对活性氧的淬灭能力较差,因为它们产生的活性氧比对照细胞多300%(补充图12D). 然而,N个-10 mM的乙酰半胱氨酸(NAC)不能拯救PC-敲除细胞的生长,这表明这种生长效应不仅仅与GSSG不能再生GSH有关。总之,这些结果表明,PC抑制会破坏Krebs循环的补体输入,从而降低Krebs周期的活性,同时限制A549细胞合成核苷酸、脂质和谷胱甘肽的能力。当比较shPC55转导的A549细胞与用打乱载体(shScr)转导的C549细胞的代谢时,PC敲除的这些下游效应也很明显(补充图13)这表明它们是PC击倒的目标效应。
谷氨酰胺分解也是非小细胞肺癌(NSCLC)充盈的重要功能来源。
为了确定GLS1对非小细胞肺癌细胞的功能是否重要,我们通过shRNA抑制了A549和H1299中GLS1的表达,这导致两个细胞的生长速度降低(补充图14,A和B). 经BPTES(一种已知的GLS抑制剂)治疗后,A549、H1299和PC9细胞的生长也下降(补充图14C). 此外,13将这3个细胞系与13C类5,15N个2-Gln表明他们使用谷氨酰胺作为克雷布斯循环的重要碳源(补充图14D). 因此,GLS1和PC对支持NSCLC细胞的增殖和Krebs循环活性都很重要。13C类5,15N个2-人类组织切片数据中还概括了Gln作为克雷布斯循环的重要碳源(补充图2C). 然而,与基于PC的修复不同()CA和NC组织切片中GLS驱动的回补活性具有可比性(补充图2C)这与大块CA和NC组织中GLS1蛋白表达缺乏明显差异一致().
讨论
在我们之前的报告之前(21)非小细胞肺癌中PC的上调是一种未被证实的现象。大多数关于癌细胞回补的研究都集中于通过GLS1在已建立的细胞系中上调谷氨酰胺代谢,这不能概括肿瘤微环境的影响(17,29–32). 为了深入了解人类癌症中的代谢重编程,必须在原位研究人类肿瘤,并比较同一患者的配对CA和周围NC组织,以避免细胞培养伪影,同时消除混淆的固有遗传和生理变量。实施快速、一致的液体N也很重要2–淬火方案,以减少手术切除后组织采样过程中的代谢伪影。
通过解决我们研究的两个方面,我们发现尽管肺组织中PC的表达和活性因患者而异,但94%的非小细胞肺癌肿瘤(86例中的82例)过度表达PC,73%(34例中的25例)的体内PC活性相对于其配对NC肺组织中的PC活性升高。这与CA和NC组织中GLS1表达的微小差异形成对比(). PC仅在早期NSCLC肿瘤组织的癌细胞中高度表达。相反,PC在肺细胞中不表达,但在配对NC组织的巨噬细胞中表达明显(和补充图3). 我们推测后者可能与炎症有关,炎症在非小细胞肺癌患者的肺部很常见。
PC对几个肺癌细胞株中非小细胞肺癌增殖和肿瘤发生的需求通过PC抑制得到证实()和体内A549细胞()使用特定的shRNAs。mRNA敲除与表型效应之间的长潜伏期()可能与PC的长半衰期有关(1–2天,参考。33). PC的细胞内水平可能需要几次细胞分裂才能充分减弱,从而影响再生,从而导致细胞增殖减少。我们已经证实,PC抑制对细胞增殖的抑制伴随着进入Krebs循环的回补输入的减少()核苷酸的减少(,补充图11A、和补充图13C)和脂质生物合成(和补充图13D). 这些代谢效应的严重程度与体内外细胞增殖抑制和敲除效率的相关性(和补充图4)这与PC基因敲除是减少增殖的重要因素一致。虽然我们已经清楚地证明了PC对癌细胞增殖的重要性,并且酶活性是PC作用的一个重要方面,但我们不能排除蛋白质在细胞中具有替代非酶功能的可能性,正如其他几种代谢酶所观察到的那样(34).
此外,A549细胞中PC的敲除大大耗尽了GSH库并扰乱了谷胱甘肽的体内平衡(补充图12C)阻断从头合成谷胱甘肽(补充图12B和补充图13B)这可能会导致ROS产量增加(补充图12D)以及抵抗氧化应激的能力受损。在某些情况下,外源性还原剂(如NAC)可以将细胞GSSG还原为GSH,但NAC无法克服PC-抑制细胞中耗尽的GSH池,因此NAC无法将PC-抑制的细胞从生长抑制中拯救出来(补充图12E).
虽然活化,但谷氨酰胺复性水解不能弥补A549细胞中失去的基于PC的复性(和补充图10)尽管谷氨酰胺供应充足。这可能是由于GLS1在PC敲低细胞或异种移植物肿瘤中的表达减少(补充图10A). 此外,我们注意到,在PC低表达的人类NSCLC肿瘤中,GLS1也低表达。这些结果表明,与某些胶质瘤细胞相比,PC和GLS1在人类非小细胞肺癌中的功能不是代偿性的(20).
最后,Warburg组织切片的改进变体(25)我们介绍的方法可以对患者特定的肿瘤代谢进行详细的体外分析(和补充图2)同时保持了大部分组织微环境和细胞异质性,没有血液供应引起的系统并发症。该体外系统还提供了与纯细胞培养系统类似的实验操作(例如,示踪剂选择或药物治疗)的多功能性。在我们的案例中,体内PC活性增强()通过相应的离体示踪剂研究证实了在人类NSCLC肿瘤组织中(). 同样重要的是,体外系统能够使用标记的谷氨酰胺示踪剂明确测定补充谷氨酰胺水解(补充图2C)从而证实GLS1在人体肿瘤组织中缺乏体内上调(). 由于成本考虑,这在人体患者体内很难证明。因此,体外组织培养系统可以补充现有的模型系统,尤其是以个体化的方式,将患者从工作台到床边进行理解(26).
总之,我们对原发性人类肺癌和体外组织切片的研究结果表明,与同一患者的NC组织相比,PC蛋白在人类NSCLC肿瘤组织的早期表达和活性增强,并且PC蛋白定位于肿瘤组织内的癌细胞中。沉默PC的表达和活性会损害NSCLC细胞的生长、致瘤性和抗氧化能力。PC抑制的这些表型效应与非小细胞肺癌中PC的重要代谢功能有关,包括维持线粒体Krebs循环活性、核苷酸和脂质生物合成以及氧化还原稳态。
方法
患者应计费用。
根据手术资格招募了86名疑似原发性肺癌但未确诊糖尿病的患者。然后将患者随机分为2组。在第一组中,患者在服用10克均匀标签的前一晚(>8小时)禁食13如前所述,在电视辅助胸腔镜手术(VATS)楔形切除术前2.8±0.5小时静脉注射C葡萄糖并再次注射(35),以跟踪代谢途径(21,36–38). 第二组患者没有接受葡萄糖注射。我们和其他人之前已经讨论过丸注与慢注射方案的相对优势(21,36–41). 团注导致最初的血糖浓度较高,然后降至基线水平,从而限制了有效标记的时间长度,但更接近于初始速率条件。相比之下,长时间缓慢注入可导致更高程度的同位素标记并接近同位素稳态条件,但这是一个更复杂的过程,真正的同位素稳态可能很难实现,而且成本高昂。
手术范围由外科医生根据临床标准确定。大多数标本是通过楔形切除获得的,以减少手术时间,而其余标本是在肺静脉被夹闭后不到5分钟内获得的;这两种做法都有助于避免切除组织出现严重缺血。切除后立即横切肿瘤,CA组织切片和距肿瘤至少2 cm的NC肺组织周围切片在液态N中通过闪冰进行生化猝灭2(36,38). 外科医生最初通过目视检查评估肿瘤边缘。将平行组织样本发送给现场病理学家,以确认诊断和无癌边缘。剩下的标本保存在缓冲福尔马林中进行详细的病理检查。
样品制备。
将冷冻组织样品在液态N中粉碎至小于10μm的粒径2使用Spex冷冻磨机(Spex)。从地面组织中提取极性和非极性代谢物,也会产生不溶性蛋白质残留物(21,42). 通过在2%SDS、62.5 mM Tris和1 mM DTT缓冲液中均质提取蛋白质残留物,以使用Pierce BCA方法(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白质。
电泳、蛋白质印迹、免疫组织化学、细胞增殖和克隆形成分析。
补充方法中描述了详细的方案。
shRNA敲除肺癌细胞中的PC。
NSCLC细胞系和从ATCC获得的HEK 293T细胞在含有0.45%葡萄糖和4mM谷氨酰胺的DMEM培养基中生长,培养温度为37℃,相对湿度为95%,CO为5%2用携带病毒包装(gag、pol、rev)和包膜(VSV-G)基因的pCMV和pMD2.G载体以及含有shRNA对抗PC(shPC54或shPC55)、shEV或shScr(Mission shRNA;Sigma-Aldrich)的质粒转染HEK 293T细胞。使用的抗PC序列为:shPC54:CCGGGCCCAGTTATGGTCAGAATCTCGAGATCTCGATCCATAACTGGTTTTG;shPC55:CCGGGCCAAGGAACAACGTATCGATCTACGTACTTGTTCTCCTTGGCTTTTG。
48小时后,收集转染细胞的培养基,过滤,补充16μg/ml聚brene,并将其添加到等体积的DMEM培养基中的NSCLC细胞系中。将新鲜培养基添加到293T细胞中,24小时后,重复NSCLC细胞的转导。使用1μg/ml嘌呤霉素筛选得到的带有嘌呤霉素抗性基因质粒的NSCLC细胞。
细胞培养中的示踪研究。
用shEV、shScr、shPC54或shPC55转导的细胞在10 mM存在的DMEM中培养13C类6-葡萄糖或2 mM13C类5,15N个2-谷氨酰胺24小时,在冷乙腈中淬火,并在乙腈/水/氯仿(v/v 2:1.5:1)中萃取,如前所述(10).
小鼠PC-敲除细胞异种移植的示踪研究。
评估PC-敲低A549细胞、6周龄雌性NOD/SCIDγ(NSG)小鼠的肿瘤生长(n个=6只小鼠/组)(杰克逊实验室)皮下注射8×106含有shEV或shPC55与Matrigel(BD Biosciences)混合的细胞。每周用卡尺测量肿瘤直径3次。肿瘤大小计算为πab/4,其中a和b是最大和最小尺寸的长度。36天后,通过尾静脉向小鼠注射100μl 1.075 M[U-13C] -每隔15分钟葡萄糖3次。首次注射后立即在眶内采集血样,60分钟后在处死时采集血样。在液体N中闪速冷冻之前,立即切除肿瘤并称重2。代谢物按上述方法提取(43).
体外组织切片示踪研究。
这些实验是在单个患者切除的成对肿瘤和非肿瘤肺组织的新鲜切片上进行的(26). 肺切除后,在手术室使用Weck切片机切下薄片(0.5–1 mm厚)组织。立即将这些切片放入含有DMEM和适当示踪剂(10 mM[U-13C] -葡萄糖或2 mM[U-13C、,15N] -谷氨酰胺),然后转移到CO2培养箱设置为37°C和5%CO2。连续摇晃烧瓶24小时,以通风,并保持组织表面的恒定营养供应,同时避免酸等废物局部堆积。然后将切片放入冷PBS中清洗,并在N液体中冷冻2如上所述粉碎,提取极性和非极性代谢物和蛋白质,用于细胞培养。
SIRM分析。
如前所述,通过GC-MS、NMR和FT-ICR-MS分析来自细胞、患者组织和小鼠肿瘤的极性代谢物组分(10,42). 如前所述,通过FT-ICR-MS分析非极性组分的脂质(10,28).13计算代谢物同位素的C分数富集度(13不同原子位置的C)和异拓扑(不同数量的13C原子)作为给定同位素或同位素的水平除以所有同位素或同位素水平的总和。通过将代谢物摩尔数归一化为可提取蛋白质含量,获得标记代谢物的绝对水平。
统计。
使用SPSS19.0(IBM-Somers)和Kaleidrograph(Synergy Software)进行统计分析。采用双尾学生配对Wilcoxon检验评估患者队列之间的差异t吨测试数值的对数(即分数差),并检查平均值、中值和模态值的分布项。PC或GLS的表达比率(CA/NC)高度非正态分布,并相应计算平均值、中位数和模态值。模态值是根据频率-相对频率直方图中的最大值估计的,因此受到箱大小的轻微影响。
使用未配对的Welch版本的t吨测试(44). 首先,在注射后的每个时间点评估其显著性。其次,所有的增长曲线都被拟合到不同的模型中,包括指数增长、幂增长和二次增长,并且最佳拟合参数和相关的标准偏差都服从Welch的t吨测试。给出良好拟合统计数据的最简单形式是一个简单的二次方程:size=a+bt吨2在这种形式中,a是初始肿瘤大小t吨=0,b为具体增长率。第三,将尸检时的肿瘤重量作为两组进行比较。shEV组和shPC组之间在增殖和代谢物方面的差异的显著性是用Welch的t吨测试。在所有分析中P(P)小于0.05的值被认为是显著的。
研究批准。
这项研究得到路易斯维尔大学IRB的批准。在纳入本研究之前,已获得所有受试者的书面知情同意书。小鼠肿瘤方案的实施符合所有相关法律和机构指南,并得到路易斯维尔大学IACUC的批准。