代谢编程和PDHK1控制CD4⁺T细胞亚群与炎症

Teffs和Tregs利用不同的代谢途径，具有不同的燃料容量。

尽管之前的研究(13,14)和体内分析（图​（图1）1)已经确定了Teffs（Th1和Th17）和Tregs之间的基本代谢差异，即CD4的潜在代谢特征⁺T细胞亚群不确定。检测CD4的详细代谢表型⁺在体外对T细胞亚群、Teffs和Tregs进行分化，并使用细胞外代谢通量分析仪测量耗氧量和乳酸生成量。细胞在没有葡萄糖、谷氨酰胺或脂质的情况下培养，细胞外酸化率（ECAR）是乳酸产生的一种测量方法，在葡萄糖还原后测定（图​（图2A）。2A） ●●●●。所有CD4⁺添加葡萄糖后，T细胞亚群的ECAR增加，尽管Th1和Treg的增加幅度小于Th17细胞。然后添加寡霉素以阻止线粒体ATP生成并促进最大糖酵解速率。重要的是，寡霉素处理后Th1和Th17细胞的ECAR均显著增加，但Tregs基本不变。这些数据表明，添加葡萄糖后，Tregs以最大速率进行糖酵解，并且增加该途径的能力有限。相反，Teffs可以高速生成乳酸，并且在需要生成ATP时可以进一步提高糖酵解速率。与Th1和Th17细胞相比，Tregs的糖酵解能力和糖酵化储备都严重受损（图​（图2，2、B和C）。因此，当葡萄糖是唯一可用的燃料时，Teffs有效地进行糖酵解，而Tregs无法增加其糖酵分解能力。

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图2

Teffs和Tregs利用不同的代谢途径，具有不同的燃料容量。

CD4细胞⁺CD25型^–T细胞在体外极化3天，分裂成1:2，与IL-2单独培养2天，以产生诱导的Th1或Th17细胞或Tregs。(A类–C类)T细胞在不含葡萄糖或谷氨酰胺的基础DMEM培养基中培养。在添加25 mM葡萄糖（gluc）以及代谢抑制剂寡霉素（oligomycin）和2DG后评估ECAR。显示的是(A类)时间进程和计算(B类)糖酵解能力和(C类)糖酵解储备。(D类和E类)T细胞在含有25 mM葡萄糖的DMEM培养基中培养。根据线粒体抑制剂寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A（Rot/AntiA）对OCR进行基本评估。显示的是(D类)时间进程和(E类)计算SRC。(F类)测量T细胞亚群中的葡萄糖氧化，并绘制葡萄糖氧化与糖酵解的比率。数据显示为三份样品的平均值±SD(B类,C类,E类、和F类)，所有数据均代表至少3个独立实验*P（P）< 0.05.

线粒体和氧化代谢在支持T细胞活化和增殖中起关键作用(22,23). 而Tregs的脂质氧化率很高(13)丙酮酸的线粒体氧化以前没有被检测过。因此，在每个CD4中测量线粒体耗氧量（OCR）⁺含有葡萄糖的培养基中的亚群。在添加代谢抑制剂之前，与Teffs相比，Tregs的耗氧量处于中等水平，Th17细胞的基本耗氧量最高（图​（图2D）。2D） ●●●●。抑制线粒体ATP生成的寡霉素处理将每个亚群的耗氧量抑制到相当低的水平，表明耗氧量与所有T细胞亚群的ATP生成紧密耦合。在添加原核羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯基腙（FCCP）以将氧化磷酸化与电子传输解耦并允许最大呼吸时，Tregs和Th17极大地上调了耗氧量。与基本耗氧量相比，这些数据表明，Tregs具有子集中最大的备用呼吸容量（SRC）（图​（图2E）。2E） ●●●●。因此，Tregs的乳酸糖酵解生成量较低，不能进一步提升该途径，但当葡萄糖是唯一可用的燃料时，其线粒体氧化能力最强。

这些数据表明，Teffs和Tregs可能对葡萄糖有不同的利用，其中Teffs优先将葡萄糖衍生的丙酮酸转化为乳酸，而Tregs则氧化线粒体中的这种燃料。我们之前已经证明，Tregs优先氧化脂质，但T细胞亚群中的相对葡萄糖氧化速率尚未直接测试(13). 测量糖酵解酶衍生丙酮酸CD4的去向⁺T细胞亚群由放射性标记的葡萄糖提供，糖酵解通量通过磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶的生成和葡萄糖氧化为CO来测量₂。Tregs中葡萄糖氧化与糖酵解通量的比率较高，支持这一结论，即该亚群优先氧化葡萄糖，而不是将丙酮酸转化为乳酸（图​（图2F）。2F） ●●●●。总之，这些数据表明Tregs利用线粒体氧化途径使用两种脂质(13)而Teffs的线粒体氧化代谢水平较低，主要进行有氧糖酵解，将丙酮酸转化为乳酸。

抑制糖酵解或线粒体氧化选择性地影响Teff或Treg的增殖、分化和存活。

尽管细胞外通量分析表明，Teffs和Tregs通过不同的糖酵解或线粒体氧化代谢途径利用丙酮酸，但这些亚群对每种代谢模式的依赖性尚不清楚。确定每个CD4⁺子集需要这些程序，CD4⁺用增殖指示剂CellTrace Violet（CTV）标记T细胞亚群，在体外进行分化，并分别用低剂量2-脱氧葡萄糖（2DG）或鱼藤酮处理以抑制糖酵解或电子传递（图​（图3A三A和补充图1A；本文在线提供的补充材料；数字对象标识：10.1172/JCI76012DS1号机组). 2DG治疗抑制了每个Teff亚群的增殖，反而增加了Treg增殖（图​（图3B）。三B） ●●●●。相反，鱼藤酮不影响Teffs，但显著降低Treg增殖。

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图3

糖酵解或线粒体电子传递的抑制选择性地影响Teff或Treg的存活、增殖和功能。

(A类)药物治疗示意图B类和C类. (B类和C类)CD4细胞⁺CD25型^–用CTV标记T细胞，并在体外极化3天，以生成Th1或Th17细胞或Tregs。用250μM 2DG或5 nM鱼藤酮处理细胞(B类)扩散或(C类)72小时后用流式细胞仪检测转录因子染色。(D类)药物治疗示意图E类和F类. (E类和F类)CD4细胞⁺CD25型^–T细胞在体外极化3天，分裂成1:2，与IL-2单独培养2天，然后与(E类)250μM 2DG或(F类)5 nM鱼藤酮；存活率是通过排除碘化丙啶（propidium-idide）来确定的。(G公司)CD4细胞⁺CD25型⁺用CTV标记天然Tregs，并在250μM 2DG或5 nM鱼藤酮存在下激活，通过CTV稀释评估增殖。数据显示为三份样品的平均值±SD(B类,E类、和F类)，所有数据均代表至少3个独立实验*P（P）< 0.05.

每个CD4的分化⁺T细胞亚群的特征是在细胞进行DNA复制和分裂时诱导特定转录因子(1). 鉴于Teffs依赖于糖酵解，Tregs依赖于线粒体代谢以促进增殖，因此亚群表达这些转录因子的能力也可能对代谢敏感。与这一概念一致，2DG治疗抑制了Th1条件下培养的细胞中Th1特异性转录因子T-bet的诱导，以及Th17条件下培养T细胞中Th17所需的维甲酸相关孤儿受体γT细胞（RORγT）（图​（图3C）。三C） ●●●●。重要的是，这种效应并不依赖于细胞分裂，因为T-bet和RORγT在每个等效细胞周期分裂时都受到抑制。同样，在每个等效细胞分裂处，T-bet和RORγT转录靶点IFN-γ和IL-17的表达也被2DG抑制（补充图1B）。先前研究表明，活化T细胞中最大IFN-γ产生需要有氧糖酵解(22)，2DG还抑制了IFN-γ的产生和在没有倾斜条件下激活的T细胞的增殖（补充图2A）。然而，2DG不影响Treg转录因子FoxP3的诱导。相反，电子传递抑制剂鱼藤酮在每个等效细胞分裂时选择性地降低Tregs中FoxP3的表达，并且Th1和Th17细胞仅轻微抑制T-bet和RORγT的表达（图​（图3C）三C） 或活化T细胞的IFN-γ产生或增殖（补充图2A）。福克斯P3⁺鱼藤酮治疗后，从脾细胞分离出的天然Tregs（nTregs）降低了增殖，但没有降低细胞存活率（补充图2、B和C）。重要的是，分化后的Teff不受2DG和鱼藤酮的影响，这表明2DG主要在早期激活和子集规范期间影响Teff的分化和细胞因子的产生（补充图3、A和B）。同样，鱼藤酮对分化Tregs中FoxP3表达没有影响。

CD4细胞⁺亚群可能依赖于特定的代谢程序，不仅是为了增殖和分化，也是为了生存。因此，在体外建立了Teff和Treg亚群，并在分化后用2DG或鱼藤酮处理（图​（图3D）。三D） ●●●●。如碘化丙啶排除法所测，Tregs在2DG存在下存活良好，仅受到糖酵解抑制的中度影响（图​（图3E）。三E） ●●●●。相反，Th1和Th17对2DG治疗敏感，并显示细胞死亡增加（图​（图3E三E和补充图3C）。Teffs对鱼藤酮相对不敏感，鱼藤酮反而增强了Th17相对于载体（图​（图3F）。三F） ●●●●。然而，Tregs对鱼藤酮治疗敏感，生存能力降低（图​（图3F三F和补充图3C）。这种效应并不是诱导的Tregs所特有的，因为在鱼藤酮处理的天然Tregs中也观察到增殖减少（图​（图3G）。三G） ●●●●。总的来说，这些数据表明Teffs和Tregs的特定代谢程序与CD4密切相关⁺T细胞增殖、分化和存活。

Th17细胞和Tregs具有不同的代谢表型。

Teffs和Tregs的不同代谢依赖性表明详细的代谢谱可以揭示CD4的关键调控点⁺T细胞亚群。因此，我们详细检查了Th1、Th17细胞和Tregs的代谢产物水平和代谢基因表达，因为这些亚型的平衡在各种炎症环境中至关重要。通过高分辨率非靶向Q精确质谱（QE-MS）代谢组学测量的约400种代谢物稳态水平的无监督聚类(24)表明Teffs和Tregs具有广泛的代谢差异（图​（图4A4A和补充表1）。重要的是，Tregs与聚集在一起的Th1和Th17细胞不同。对大约200种代谢物进行的单独液相色谱/气相色谱-质谱（LC/GC-MS）分析发现了类似的结果（补充图4和补充表2）。Th17细胞和Tregs最为明显，Th17细胞具有高水平的早期糖酵解和戊糖磷酸途径中间产物（图​（图4B）。4B） ●●●●。晚期糖酵解中间产物更为相似，尽管Th17具有较高的丙酮酸和较高的乳酸水平，表明丙酮酸优先转化为乳酸。尽管丙酮酸水平较低，但Tregs的TCA循环中间产物相当于Th17细胞的TCA周期中间产物，直至α-酮戊二酸，这可能表明Tregs中的丙酮酸优先氧化和Th17对谷氨酰胺的氧化。

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图4

CD4代谢组学分析⁺各亚群表现出不同的代谢特征。

天真的CD4⁺CD25型^–在体外收集或极化T细胞3天，1:2分裂，并与IL-2单独培养2天，以生成Th1、Th17或Tregs。从3个生物复制样品中提取T细胞亚群裂解物，并使用高分辨率LC-QE-MS分析细胞代谢物。(A类)热图显示了每种代谢物的相对水平，以及来自独立生物复制的无监督分级聚类。(B类)显示了糖酵解和TCA循环途径中每种代谢物的相对水平。样本归一化为原始T细胞，如红线所示。数据显示为三份样品的平均值±SD。

接下来检查Th17细胞和Treg亚群的氨基酸和酰基肉碱水平，这是反映脂质氧化产物和可用线粒体燃料的中间产物。与Th17相比，除了Tregs的天冬氨酸水平升高外，在氨基酸水平方面没有观察到明确的T细胞亚型模式（补充图5A）。酰基肉碱在Th17细胞和Tregs之间存在差异，与Th17相比，Tregs增加了C2和C4-OH肉碱水平（补充图5、B和C）。这些代谢物分别与乙酰基和β-羟丁基辅酶A物种平衡并反映其性质。我们还观察到油基肉碱（C18:1）下降。长链酰基肉碱的下降与C4-OH（羟基丁酰肉碱）的增加相一致，这与脂肪酸氧化增加相一致(25)并支持Tregs对脂肪酸的利用程度高于Th17的模型。总之，这些代谢数据表明每个CD4⁺T细胞亚群具有独特的代谢表型，表明Treg和Teff亚群在燃料消耗模式和依赖性方面存在特定的代谢差异。

接下来在Th17细胞和Tregs中测定代谢基因和选择蛋白的表达。基因聚类分析表明，Th17的葡萄糖代谢基因表达普遍较高，其次是Tregs和原始T细胞（图​（图5A，5A、 补充图6和补充表3和4）。具体而言，与Tregs相比，Th17的许多糖酵解基因的表达水平更高（图​（图5B）。5B） ●●●●。有趣的是，CD4⁺T细胞优先表达每个糖酵解基因的单一亚型（图​（图5B）。5B） ●●●●。此外，CD4⁺T细胞表达多种葡萄糖转运蛋白，包括GLUT1和GLUT3。与Tregs相比，Th17中GLUT1蛋白的表达升高，Tregs未表达可检测到的GLUT3水平（图​（图5C5C和补充图6和7）。葡萄糖在摄取后被己糖激酶（HK）磷酸化，其中有4种亚型。令人惊讶的是，Tregs主要表达HK1蛋白，而Th17主要表达HK2和HK3（图​（图5C5C和补充图7）。有趣的是，尽管Tregs中HK1蛋白水平升高，但HK1–3的RNA水平相对于Th17降低（图​（图5C5C和补充图7）。线粒体基因的无监督聚类显示，Th17细胞和Tregs表达的线粒体代谢基因水平高于原始T细胞（图​（图5D，5D、 补充图6和补充表4和5）。在Th17细胞和Tregs之间，与TCA循环和电子传递相关的基因表达相似（图​（图5E）。5E） ●●●●。此外，Tregs的许多电子转运链蛋白水平升高，脂肪酸转运蛋白CPT1A和电子转运链组分细胞色素水平升高c（c）与Th17相比（图​（图5F5F和补充图7）。总之，这些数据显示出明显的遗传和代谢差异，这些差异可能介导了Teffs和Tregs的特定代谢程序和依赖性。

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图5

Th17细胞和Tregs具有不同的代谢基因和蛋白表达。

CD4细胞⁺CD25型^–T细胞在体外极化3天，分裂成1:2，与IL-2单独培养2天，以产生Th17或Tregs(A类,B类,D类、和E类)实时PCR或(C类和F类)免疫印迹。(A类,B类,D类、和E类)所示数据为3个生物复制品的平均值±SD，如2所示^ΔCT归一化为参考基因的几何平均值Tbp公司和Bgu公司数据代表2(A类,B类,D类、和E类)或2(香港3号), 3 (葡萄糖转运蛋白1,谷氨酸3,香港1号,香港2号,氧磷化合物), 4 (细胞c)，或5(Cpt1a型) (C类和F类)独立实验*P（P）< 0.05.

体外Th17（而非Treg）功能需要PDHK。

不同底物利用模式的发现表明，丙酮酸转化为乳酸或通过线粒体氧化的PDH复合物转化为乙酰辅酶A的分叉点可能是Th17和Treg CD4的重要调节节点⁺子集。为了测量丙酮酸通过PDH的流量，向Th17细胞和Tregs提供放射性标记的丙酮酸及其氧化为CO₂已测量。Tregs中丙酮酸的氧化程度更高，表明Tregs优先将丙酮酸导向线粒体代谢（图​（图6A）。6A） ●●●●。PDH是一种高度调控的多亚单位复合物，部分由PDHK控制，PDHK磷酸化并抑制PDH将丙酮酸直接转化为乳酸，而不是乙酰辅酶a。4的表达普德克因此在CD4中检测了亚型⁺T细胞亚群。T细胞表达Pdhk1号机组和巴基斯坦电力公司3，使用Pdhk1号机组是主要的同种型（图​（图6B）。6B） ●●●●。在RNA和蛋白质水平上，Th17表达最高水平的PDHK1，其次是Tregs，而Th1几乎没有PDHK1表达（图​（图6C6C和补充图8A）。因此，PDHK1在CD4细胞中差异表达⁺T细胞亚群和可能在控制T细胞代谢中发挥作用。

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图6

体外Th17（而非Treg）功能需要PDHK。

CD4细胞⁺CD25型^–T细胞在体外极化3天，分裂成1:2，与IL-2单独培养2天，以产生Th1、Th17或Tregs。(A类)显示丙酮酸不同命运和DCA抑制机制的示意图以及¹⁴Th17细胞和Tregs中的C-丙酮酸氧化。(B类)实时PCR和(C类)免疫印迹显示了4个独立实验的代表性。(D类–F类)用10 mM DCA处理细胞，然后产生细胞因子(D类)和转录因子染色(E类)流式细胞术检测。(F类)通过体外Treg抑制试验评估Treg功能。(G公司和H（H）)T细胞极化并感染表达PDHK1 shRNA的慢病毒(G公司)FoxP3和RORγT的转录因子染色或(H（H）)对IL-17进行细胞内细胞因子染色。数据显示为三份样品的平均值±SD(A类,B类、和H（H）)，所有数据均代表至少3个独立实验*P（P）< 0.05.

PDHK是抑制剂化合物DCA的靶点（图​（图6A6A和参考。26)之前已经证明它会影响细胞因子的产生和Tregs(19–21). 测定PDHK抑制对CD4的影响⁺T细胞命运和功能，CD4⁺T细胞在DCA存在下在体外分化或在分化3天后用DCA处理。DCA治疗并不影响Th1分化或功能，因为无论治疗如何，IFN-γ的产生和T-bet的表达都是相似的（图​（图6，6，D和E，以及补充图8，B–D）。相反，DCA抑制在Th17倾斜条件下培养的细胞中IL-17的产生，并抑制Th17转录因子RORγT的表达（图​（图6，6，D和E，以及补充图8，B–D）。相反，与载体相比，DCA治疗Tregs增加了FoxP3的表达，并维持或潜在增加了Tregs的体外抑制能力（图​（图6，6、D–F和补充图8E）。我们下一步的基因目标Pdhk1号机组使用3种不同的慢病毒shRNA结构（补充图9A）。Pdhk1号机组缺乏抑制Th17细胞中RORγT和IL-17的表达，增加FoxP3的表达，与DCA的体外效应相似（图​（图6，6、G和H以及补充图9、B和C）。慢病毒转导本身对代谢没有影响（补充图9、D和E）。这些数据表明丙酮酸代谢和PDHK1在调节Th17细胞和Tregs中起着关键作用。

DCA治疗促进丙酮酸氧化的一个结果是ROS生成的潜在增加。事实上，DCA可以抑制癌细胞的有氧糖酵解并刺激ROS生成，从而导致癌细胞衰老(15,18). 先前的文献也表明，Teffs可能比Tregs对ROS应激更敏感(27–29). 因此，在T细胞亚群中检测ROS水平。活性氧指示剂染料DCFDA显示，Tregs的活性氧水平高于Teff亚群（图​（图7A）。7A） ●●●●。与活性氧应激相一致，与Th1和Th17相比，Tregs还具有大量的还原性谷胱甘肽（GSH）储备库以及高水平的氧化性谷胱甘肽（GSSG）（图​（图7B）。7B） ●●●●。这表明Tregs比Teffs有更大的能力处理ROS，并在更大程度上利用GSH池。Treg还被证明具有较高水平的抗氧化剂硫氧还蛋白-1，也有助于调节Treg氧化还原(30). 为了确定DCA是否通过ROS生成发挥部分作用，对已建立的Th17和Treg培养物进行DCA急性治疗。在这两种情况下，DCA增加了DCFDA染色，表明ROS的产生（图​（图7C）。7C） ●●●●。接下来，我们通过用DCA和抗氧化剂NAC共同处理Th17细胞和Tregs来测试DCA诱导的活性氧的作用，以防止活性氧积聚。用DCA治疗的分化T细胞显示出与急性DCA治疗相似的ROS积累水平（补充图10A），1 mM NAC足以部分挽救DCA治疗后的ROS积聚（图10A​（图7C7C和补充图10B）。DCA单独治疗抑制IL-17的产生；然而，NAC的联合治疗阻止了IL-17的下降（图​（图7D）。7D） ●●●●。相反，虽然DCA促进Tregs的增加，但NAC的联合治疗阻止了Tregs增加。这些数据表明，DCA可以驱动Tregs计划管理的葡萄糖氧化和ROS生成。

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图7

DCA治疗产生ROS，对Th17产生负面影响。

CD4细胞⁺CD25型^–T细胞在体外极化3天，分裂成1:2，与IL-2单独培养2天，以产生Th1、Th17或Tregs。(A类)使用指示染料DCFDA通过流式细胞术测量ROS的产生。(B类)使用LC/MS测量T细胞亚群中的相对谷胱甘肽水平(C类)使用DCFDA测量经载体、DCA或DCA/NAC处理的Th17细胞和Tregs的ROS生成。(D类和E类)用10 mM DCA、1 mM NAC或两者联合处理Tregs和Th17细胞，以及(D类)3天后检测IL-17的产生和FoxP3的表达。数据显示为三份样品的平均值±SD(A类,B类、和D类)，所有数据均代表至少2个独立实验*P（P）< 0.05.

T细胞分离和分化。

天真的CD4⁺CD25型^–体外分离T细胞，如前所述生成T辅助细胞亚群(13). 简单地说，CD4⁺CD25型^–在补充有10%FBS、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、HEPES和β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中，用2.5μg/ml的抗CD3抗体以5:1的比例在辐照（30Gy）的脾细胞上培养T细胞。添加以下细胞因子以产生每个亚群：Th1、10 ng/ml IL-12（R&D Systems）、10μg/ml抗IL-4（eBioscience，克隆11B11）、1μg/ml对抗IFN-γ（eBioscience）；Th17，20 ng/ml IL-6（研发系统），2.5 ng/ml TGF-β（研发系统；Tregs，3 ng/ml TGF-β。在刺激后第3天，细胞以1:2的比例分裂，并在分析前用20 ng/ml IL-2单独替换2天。在一些实验中，根据制造商的说明，用5 nM鱼藤酮或250μM 2DG处理细胞，或用CTV（Invitrogen）标记细胞，以评估细胞增殖。

qRT-PCR。

按照制造商的说明，使用RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN）从原始（Th0）、Th1或Th17细胞或Tregs中分离RNA。1μg总RNA通过RT进行单链cDNA合成²第一股套件（QIAGEN）。在某些实验中，根据制造商的说明（QIAGEN）在线粒体能量代谢和葡萄糖代谢SuperArray RT中使用cDNA²Profiler PCR阵列或定制阵列，设计用于在T细胞激活的重要途径中包含代谢基因（QIAGEN，CAPM1256）。PCR阵列在ViiA 7实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行分析。使用RT分析数据²QIAGEN提供的并归一化为参考基因TATA盒结合蛋白的Profiler程序(Tbp公司)和β-葡萄糖醛酸酶(Bgu公司)，由GeNorm稳定性分析确定。

免疫印迹。

如前所述测量蛋白质表达(13). 简言之，在含有Triton X-100和SDS以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液中裂解细胞。使用了以下抗体：GLUT1（ab652，Abcam）、GLUT3（密理博）、HK1（密理博尔）、HK2（密理伯）、HK3（Abcamc（c）（BD Biosciences）、肌动蛋白（Abcam）和PDHK1（Abcam）。

代谢组学和酰基肉碱。

使用LC-QE-MS（Thermo Scientific）进行非靶向代谢组学分析(24). 使用GC/MS和LC/MS/MS平台（Metabolon Inc.）进行额外的代谢组学分析，以测定细胞代谢物。然后使用MetaboAnalyst软件通过无监督聚类对数据进行分组。使用Bradford蛋白质浓度对样品进行标准化，并重新缩放，以将中位数设置为1。缺失值用最小值进行插补。如前所述，通过靶向流动注射-MS/MS测量酰基鸟氨酸(43).

代谢分析。

利用XF24细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）对T细胞进行分化，并对OCR和ECAR进行分析。OCR和ECAR值归一化为细胞数。糖酵解能力被定义为注射1μM寡霉素（Seahorse Bioscience）后的ECAR与基础ECAR读数（在不添加葡萄糖或谷氨酰胺的碱性DMEM中培养的T细胞）之间的差异。糖酵解储备被定义为葡萄糖和寡霉素注射液的ECAR差异。SRC被定义为初始基础读数（在添加25 mM葡萄糖的碱性DMEM中培养的T细胞）与注入500 nM离子载体FCCP（Seahorse Bioscience）解偶联氧化磷酸化和电子传递之间OCR的百分比增加。在一些实验中，在鱼藤酮（5 nM）和2DG（250μM）存在下测量OCR和ECAR。如前所述测量糖酵解通量以及葡萄糖和丙酮酸盐的氧化(44). 简单地说，糖酵解通量是通过测量[^三H] -葡萄糖。葡萄糖和丙酮酸氧化通过U-¹⁴C葡萄糖或U-¹⁴丙酮酸C用于测量¹⁴一氧化碳₂.

活性和细胞内染色。

使用以下抗体：大鼠抗小鼠CD4⁺太平洋蓝、IL-2藻红蛋白（PE）、IL-17 PE、IFN-γAPC、T-bet PE、RORγT PE、FoxP3 PE和山羊抗兔PE（均来自eBioscience）。通过排除1μg/ml碘化丙啶来测量细胞死亡。为了测量细胞内细胞因子，在GolgiPlug（IL-2，IFN-γ，IL-17）或GolgiStop（IL-17。使用小鼠调节性T细胞染色试剂盒（eBioscience）进行转录因子染色，并对T-bet、RORγT或FoxP3进行细胞内染色。如前所述，对GLUT1和HK2进行细胞内染色(13). 数据在MacsQuant分析仪（Miltenyi Biotec）上采集，并使用FlowJo（TreeStar软件）进行分析。

慢病毒PDHK1 shRNA。

PDHK1 shRNA-表达和对照慢病毒购自Sigma-Aldrich（嘌呤霉素抗性）或Origene（GFP-表达）。CD4细胞⁺如上所述分离和分化T细胞，并在激活24小时后感染PDHK1 shRNA或控制慢病毒。添加聚溴乙烯（8μg/ml）以促进感染，并在750℃下离心细胞90分钟克如有指示，2天后将细胞以1:2的比例分裂，并用2μg/ml嘌呤霉素处理2天，以选择受感染的细胞。

结肠炎的T细胞转移模型。

野生型CD4⁺如上所述分离T细胞，以及初始效应物（CD4⁺CD25型^–CD45RB^你好)对T细胞进行分类（FACSVantage，BD Bioscience）。将Naive Teffs静脉注射到6至8周龄的C57BL/6中抹布1^–/–收件人（Jackson Laboratories）（4×10⁵单元格/鼠标）。在整个实验过程中，给小鼠饮用普通水或饮用2 g/l DCA。T细胞移植两周后，给小鼠服用200 ppm吡罗昔康（Sigma-Aldrich）的鼠食粉，为期5天，以破坏肠道屏障并引发疾病(31).

EAE公司。

如前所述诱发EAE(45). 简单地说，向野生型小鼠注射100 ng MOG_35–55与CFA混合的肽（新英格兰肽），包括热杀肽结核分枝杆菌（Sigma-Aldrich），然后在第0天和第2天通过静脉注射给予200 ng百日咳毒素。在小鼠饮用水中给予溶媒或DCA（2 g/l）。根据以下评分评估EAE的临床症状：0分，无疾病迹象；1、尾部语调丧失；2、后肢麻痹；3、后肢瘫痪；4、四肢瘫痪。如前所述，在H&E和LFB染色的小鼠脊髓切片中评估淋巴细胞浸润和脊髓脱髓鞘(46). 在选定的实验中，用20μg/ml MOG肽和0.5 ng/ml IL-12在体外刺激具有MOG特异性TCR转基因T细胞的2D2小鼠脾细胞48小时，然后将其转移到抹布1^–/–受体诱导EAE。然后从脊髓中分离T细胞进行qRT-PCR。

统计。

使用双尾学生的t吨测试，以及P（P）<0.05被认为是显著的。对于EAE模型，采用双向方差分析法对溶媒和DCA治疗的小鼠进行分析P（P）<0.05被认为是显著的。

我们要感谢Rathmell实验室成员的支持和有益的讨论，以及Marshall Nichols的技术援助。这项工作得到了肯尼思·雷宁基金会（J.C.Rathmell）、白血病和淋巴瘤学会（J.C.Rathmell）、美国克罗恩和结肠炎基金会（J C.Rathmel高级研究奖；A.N.Macintyre博士后奖学金284879）的资助，狼疮研究联盟（向J.C.Rathmell提供狼疮靶点识别）和国家多发性硬化学会（RG4536-A-1向M.L.Shinohara提供），并由NIH向J.C.Rathmell提供R01HL108006、R56AI102074、R00CA168997和R01AI110613（向J.W.Locasale提供）。