结果和讨论
mTORC1通路调节GLS1
mTORC1正向调节进入TCA循环的谷氨酰胺净流量，因此表明GLS可能受mTORC2调节[三]. 为了测试这种可能性，我们评估了mTORC1激活条件下的GLS蛋白水平。我们发现了Tsc2型-小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的缺陷或Rheb WT或活性突变体（S16H）的稳定表达导致GLS蛋白水平升高，mTORC1抑制后GLS蛋白降低(). 雷帕霉素在治疗6小时后有效降低GLS水平()，与同一时间点减少谷氨酰胺消耗量一致(). 测试的mTOR催化抑制剂包括LY294002和BEZ235，也导致MEF中GLS蛋白水平降低(). 与mTOR抑制剂类似，敲低mTORC1通路的成分，包括猛禽、瑞b、RagA和mTOR本身，导致GLS蛋白水平降低(图S1A).
mTORC1通路调节GLS1（A-C、E）全细胞裂解物中的GLS蛋白水平来自：（A）
Tsc2型WT和Tsc2型雷帕霉素处理−/−MEF 8h；（B）稳定表达Rheb WT、突变体S16H Rheb或空载体（EV）的HEK293T细胞，用雷帕霉素处理24h；（C）
Tsc2型在指定的时间点用雷帕霉素处理−/−MEF；（E）
Tsc2型WT和Tsc2型−/−用指定化合物处理8小时的MEFs。化合物的浓度为：雷帕霉素20ng/mL；LY294002 20μM和BEZ235 10μM。
（D）谷氨酰胺消耗的时间进程Tsc2−/−MEF与或不与20ng/mL雷帕霉素孵育24小时。每个时间数据点是三次重复实验的平均值。
（F）细胞内谷氨酰胺水平Tsc2型雷帕霉素处理−/−MEF 24小时。
（G）谷氨酰胺通量Tsc2型−/−表达空载体（EV）或用所示化合物处理24h后再表达TSC2的MEF。化合物的浓度为：雷帕霉素20ng/mL；LY294002 20μM、BEZ235 10μM、BPTES 10μM和DON 1mM。
显示平均值；误差条表示至少三个生物复制品的SEM。免疫印迹图像下方的数字表示根据负荷控制标准化的量化。
另请参见图S1.
哺乳动物GLS酶不同染色体编码中的两个不同基因：Gls1号机组肾型（K型）同工酶的基因编码，而Gls2公司基因编码肝脏型（L型）同工酶[4]. 的唯一表达式Gls1号机组，不是Gls2公司在我们的细胞系统中检测到(图S1B). 此外，Gls1号机组雷帕霉素治疗后Tsc2型−/−MEF(图S1C). p53最近被证明调节Gls2公司促进谷氨酰胺代谢，但对Gls1号机组描述了[5]. 一贯地，GLS的mTORC1依赖性调节独立于p53发生(图S1D). mTORC1对GLS水平的调节也应反映在谷氨酰胺转化为谷氨酸的过程中。雷帕霉素治疗增加细胞内谷氨酰胺水平() [三]. 此外，mTORC1的抑制降低了Tsc2型−/−MEF表示空向量（EV）或TSC2().
mTORC1途径通过Myc调节GLS1
致癌Myc被证明能积极刺激谷氨酰胺代谢相关基因的表达[6]. 此外，Myc通过抑制miR-23a/b的转录来调节GLS[7]. 与此一致的是，在人类胰腺癌细胞系BxPC3中使用两个siRNA（#25和26）有效地敲除Myc与GLS蛋白水平降低相关(，车道5和6）。与GLS相似，Myc蛋白水平在Tsc2型与WT对应物相比，−/−MEF对雷帕霉素治疗敏感(&). 这些观察促使我们测试mTORC1是否通过Myc调节GLS水平。引人注目；我们发现Myc的稳定表达可以消除雷帕霉素诱导的GLS下降().
mTORC1途径通过Myc调节GLS1（A-C）全细胞裂解液中GLS和Myc蛋白水平：（A）转染非靶向对照siRNA（NTC）或四个独立的抗Myc siRNA 72小时的BxPC3细胞；（B）
Tsc2型WT和Tsc2型雷帕霉素20ng/mL处理−/−MEF 8h；（C）
Tsc2型−/−稳定表达Myc或空载体（EV）的MEFs，并用雷帕霉素20ng/mL处理24小时。
mTORC1底物S6K1控制Myc和GLS
尽管早期研究已将mTORC1与Myc联系起来[8]，尚未描述机械细节。我们假设mTORC1下游效应器S6激酶1（S6K1）可能调节Myc。我们发现，用PF470861（PF）或雷帕霉素抑制S6K1导致Myc转录活性降低(). 此外，催化活性S6K1（S6K1-F5A/R3A/T389E）的表达[9,10]导致Myc和GLS水平升高，并阻止雷帕霉素诱导的Myc和GLS水平降低(). 雷帕霉素耐药的S6K1也显著降低了雷帕霉素诱导的细胞内谷氨酰胺水平的增加(). 相反，S6K1/2的敲除或PF治疗导致Myc和GLS水平降低(图S2A和S2B). PF-治疗或S6K1/2敲除增加细胞内谷氨酰胺水平(和S2C公司)与S6K1/2缺失细胞谷氨酰胺摄取率降低相关(). 重要的是，敲除Myc导致细胞内谷氨酰胺水平增加，与S6K抑制后在细胞内观察到的谷氨酰胺水平相当(图S2D和S2E). 总之，这些显示了S6K1/Myc介导的GLS和谷氨酰胺代谢调节的生物学意义。
mTORC1底物S6K1通过Myc mRNA翻译控制GLS（A）归一化荧光素酶光单位Tsc2型−/−稳定表达Myc-responsive萤火虫荧光素酶结构体（Myc-Luc）或载体控制（pCignal Lenti-TRE Reporter）的MEF。用雷帕霉素20ng/mL或PF4708671 10μM处理8h后测定Myc转录活性。
（B）表达HA-S6K1-CA（F5A-R3A-T389E）或经雷帕霉素20ng/mL处理24h的空载体（EV）的HEK293T细胞的全细胞裂解液中GLS和Myc蛋白水平。
（C-D）细胞内谷氨酰胺水平Tsc2型−/−MEF：（C）稳定表达S6KCA（F5A/R5A/T389E；将三种精氨酸或RSPRR基序中的所有残基突变为丙氨酸显示出相同的效果）[10]或空载体，用雷帕霉素20ng/mL或二甲基亚砜处理48h；（D）转染非靶向对照siRNA（NTC）或抗S6K1/2的siRNA。转染24h后，用PF4708671 10μM或DMSO处理转染NTC siRNA的细胞48h。
（E）谷氨酰胺消耗Tsc2型转染非靶向对照siRNA（NTC）或针对S6K1/2的siRNA的−/−MEF。转染72h后，收集培养基，测定培养基中谷氨酰胺的含量。
（F）归一化荧光素酶光单位Tsc2型在肾萤光素酶的控制下，用含有Myc的5’UTR的pDLN报告子构建体转染的WT MEFs。萤火虫荧光素酶用作内部控制。转染48小时后，用雷帕霉素20ng/mL或PF4708671 10μM处理细胞8小时。
（G）的相对水平Myc公司,Gls公司和肌动蛋白mRNA在每个多体梯度部分。用qPCR测定mRNA水平，并将其归一化为5S rRNA水平。用雷帕霉素20ng/mL处理HEK293T细胞24h，在蔗糖密度梯度上分离多聚体。
（H-I）全细胞裂解液中GLS和Myc蛋白水平：（H）
Tsc2型转染非靶向对照siRNA（NTC）或针对eIF4B的两个独立siRNA 72小时的−/−MEF；（一）
Tsc2型稳定表达eIF4B WT、突变S422D或空载体（EV）的−/−MEF，并用雷帕霉素处理24h。
显示平均值；误差条表示至少三个生物复制品的SEM。星号（*）表示非特定带。免疫印迹图像下方的数字表示根据负荷控制标准化的量化。
另请参见图S2和S3.
Myc由S6K1通过eIF4B进行监管
雷帕霉素治疗抑制Myc公司信使核糖核酸[11]，在其5'非翻译区域（5'UTR）中包含一个二级结构[12]. 与此一致，翻译抑制剂环己酰亚胺的治疗降低了Myc蛋白水平，这与雷帕霉素治疗24小时的效果相当(图S3A). S6K1促进具有高度结构5'UTR的mRNA翻译[13]，建议对Myc公司mRNA翻译。为了评估这种可能性，我们使用了一个荧光素酶报告子，该报告子包含Myc公司我们发现雷帕霉素和PF显著降低Myc公司荧光素酶报告子，而荧光素素酶mRNA水平不受影响(和S3B型). 雷帕霉素诱导的内源性Myc公司信使核糖核酸向较轻的多糖体部分转移() [14]，证明了这一点Myc公司在mTORC1抑制条件下，翻译减少。相比之下GLS公司和肌动蛋白mRNAs不含高度结构化的5'UTRs，不受雷帕霉素处理的影响().
S422上依赖S6K1的eIF4B磷酸化导致翻译前启动复合物中eIF4B-eIF4A的关联增加[15]eIF4A解旋酶活性的增强[16]. 重要的是，击倒eIF4B或eIF4A导致GLS和Myc水平降低(和S3C系列). 一贯地，当eIF4B过度表达时，Myc公司mRNA向较重的多体部分移动，而eIF4B的敲除导致Myc公司较轻多体组分中的mRNA存在(图S3D) [17]. 为了进一步评估S6K1/eIF4B对Myc的影响，我们使用了一个eIF4B（S422D）的拟磷酸突变体。引人注目的是，该残基的突变抑制了雷帕霉素诱导的GLS和Myc的减少().
抑制GLS降低胰腺癌细胞的生长
最近的研究表明谷氨酰胺在支持癌细胞代谢方面起着重要作用，这表明GLS的mTORC1依赖性调节可能与癌细胞有关。我们测量了三种胰腺癌肿瘤细胞系（BxPC3、MIAPaCa-2和AsPC-1）中GLS和Myc的水平。BxPC3和MIAPaCa-2均显示S6的基础磷酸化水平较高()，与PTEN的低水平一致[18]. 在BxPC3和MIAPaCa-2细胞中GLS和Myc的水平都较高，并且在雷帕霉素或BEZ235抑制mTORC1后，GLS和Myc的水平降低(). 有趣的是，BEZ235对GLS的影响在BxPC3细胞中更为明显(). 与AsPC-1细胞相比，BxPC3细胞中GLS水平较高与谷氨酰胺消耗增加相关(). 鉴于谷氨酰胺代谢在推动癌细胞生长中的重要性，我们推测抑制谷氨酰胺代谢可能会通过增加mTORC1信号降低胰腺细胞的生长。为了验证这一想法，我们使用GLS-1抑制剂BPTES进行了凤尾鱼非依赖性生长试验。我们发现BPTES显著降低了BxPC3细胞在软琼脂中的生长能力，同时不影响AsPc-1细胞的生长(). 最近研究表明，胰腺导管腺癌的生长对GLS-1抑制剂敏感[19]. 添加TCA循环中间产物草酰乙酸（OAA）能够在GLS抑制后挽救BxPC3细胞的生长(). OAA通过维持NADPH/NADP在胰腺癌细胞生长中发挥重要作用+比率[19]. 我们一直观察到抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以挽救在BPTES存在下培养的BxPC3细胞的生长下降(). 总之，这些数据表明，mTORC1介导的GLS调控对谷氨酰胺补体、氧化还原稳态和胰腺癌细胞生长至关重要。
抑制GLS降低胰腺癌细胞的生长（A）用雷帕霉素20ng/mL或BEZ235 1μM处理24小时的BxPC3、MIAPaCa-2或AsPC-1细胞的全细胞裂解物中的GLS和Myc蛋白水平。
（B）电镀48小时后BxPC3或AsPC-1细胞的谷氨酰胺消耗。
（C-D）软琼脂分析：（C）经BPTES（10μM）处理的BxPC3或AsPC-1细胞，以及经BPTES+OAA（2mM）联合处理的细胞；（D）用BPTES处理的BxPC3或AsPC-1细胞，以及BPTES（10μM）+NAC（10mM）的组合。
显示平均值；误差条表示至少三个生物复制品的SEM。
在本研究中，我们确定GLS是参与能量代谢的mTORC1/S6K1信号的下游效应器。我们证明S6K1通过提高癌基因Myc mRNA的翻译效率，在分子水平上积极控制GLS；我们发现S6K1通过磷酸化起始因子eIF4B调节Myc(). 我们的数据扩展了我们先前的模型，证明eIF4B的磷酸化促进了翻译前启动复合体（PIC）中eIF4B-eIF4A的关联[15]. 这种相互作用增强了eIF4A解旋酶活性Myc公司mRNA翻译是通过提高PIC转移到翻译起始位点的能力和/或暴露隐藏在结构5'UTR内的可能的内部核糖体进入位点（IRES）来实现的[20,21]. 通过这种方式，mTORC1/S6K1调节的解旋酶刺激增加了参与Myc公司信使核糖核酸翻译。始终如一地Myc公司通过雷帕霉素或eIF4B敲除，观察到mRNA从较重到较轻的多聚体分布，并与之前的多聚体形貌一致(和S3D系列) [14,17]. 尽管S6K1介导的Myc蛋白稳定性调节也被提出[22,23]，在我们分析中使用的条件下，MG132治疗未发现Myc水平的显著变化(图S3E). 此外，外源性Myc；没有5'UTR的雷帕霉素没有显著降低()与内源性Myc及其5'UTR相比(). 总之，这些数据与mTORC1/S6K1通过调节其mRNA翻译起始效率来控制Myc表达的模型一致。先前的研究表明，致癌Myc通过抑制miR-23a/b表达，在转录后积极调节GLS水平[7]. 重要的是，雷帕霉素对mTORC1的抑制增加了miR-23a/b水平(图S3F)，通过Myc-介导的miR-23a/b控制将mTORC1调节GLS表达联系起来。有趣的是，我们观察到mTORC1/S6K1在蛋白和mRNA水平上对GLS表达的调节。然而，Gls公司Myc基因敲除对转录没有显著影响(图S3G)这与之前的工作一致，表明Gls公司mRNA水平对P493-6细胞Myc水平的改变没有反应[7]. 因此，尽管Myc介导的GLS表达控制在mTORC1下游发挥主要作用，但mTORC1可能具有其他机制来调节Gls公司mRNA水平。
通过GLS的调节，S6K1首次与谷氨酰胺摄取和代谢直接相关。有趣的是，最近的两项研究表明S6K1控制核苷酸的合成[24,25]，这一过程需要谷氨酰胺衍生的氮。因此，结合这些研究和本文提供的数据，揭示了mTORC1/S6K1信号通过GLS促进谷氨酰胺摄取的正反馈机制的存在，为创造细胞生长所需的遗传物质提供了基础。除了为蛋白质和核苷酸合成提供氮外，谷氨酰胺还可作为生长和增殖的燃料[26]. 有趣的是，mTORC1还刺激谷氨酰胺衍生的αKG通过GDH进入TCA循环[三]证明mTORC1的激活涉及谷氨酰胺补体的各个方面。
越来越多的证据支持谷氨酰胺代谢在推动肿瘤生长中的主要作用。例如，GLS的敲除或抑制会损害多种癌细胞的生长，包括前列腺癌、胶质瘤、淋巴瘤和胰腺癌[7,19,27,28]. 沿着这些路线，我们观察到，在用BPTES抑制GLS-1后，由于mTORC1过度激活，表达较高水平GLS的胰腺癌细胞的锚定非依赖性生长减少。鉴于正在开发临床级GLS抑制剂，这一发现可能具有重要的治疗意义[29]因为谷氨酰胺代谢增加对正常分化细胞并不重要。GLS抑制剂的使用可以提供更大的疗效，同时具有更少和更少的毒性副作用。
实验程序
细胞系和培养
Tsc2−/−p53−/–，Tsc2重量p53−/-、Tsc1−/-p53−/−和Tsc1–/-p53+/+MEF由Brendan Manning博士和David Kwiatkowski博士（哈佛医学院）提供。所有其他细胞系（HT-29、BxPC3、MIAPaCa-2、AsPC-1、HEK293T）均来自ATCC。MEF、HT-29和HEK293T在DMEM中培养。在RPMI培养基（Mediatech）中培养BxPC3、MIAPaCa-2和AsPC-1细胞。DMEM或RPMI补充10%FBS（透析剥夺实验，Gibco）。不包括通常添加到某些DMEM配方中的所有额外含能添加剂，如丙酮酸钠和琥珀酸钠。
细胞裂解和免疫印迹
用冷PBS清洗过一次的细胞，然后将其溶解在常规的溶解缓冲液中（40mM HEPES[pH 7.4]，1mM EDTA，120mM NaCl，10mMβ-甘油磷酸盐，1mM NaF，1mM钠三沃4和0.3%CHAPS）或低盐溶解缓冲液（40mM HEPES[pH7.4]，1mM EDTA，10mMβ-甘油磷酸，1mM NaF，1mM钠三沃4和0.3%CHAPS）添加蛋白酶抑制剂（250μM PMSF、5μg/ml Pepstatin A、10μg/ml Leupeptin和5μg/ml Aprotin）。通过在4°C下以10000rpm离心10分钟获得清除的细胞裂解物，并使用30μg裂解物进行免疫印迹。简而言之，蛋白质通过8-12%的SDS-PAGE溶解，然后转移到硝化纤维素膜上。初级抗体在4°C下培养过夜。红外荧光IRDye二级抗体用于在LI-COR/Odyssey系统中形成带强度。使用Adobe Photoshop CS3 Extended软件量化波段强度。
谷氨酰胺消耗量和谷氨酰胺流量
使用黄泉仪器（YSI）7100测量新鲜和废培养基中的谷氨酰胺浓度（在没有药物的情况下培养24-48小时后）。谷氨酰胺水平被标准化为细胞数量。用于这些实验的培养基不含丙酮酸，并补充有10%的透析FBS。根据谷氨酰胺摄取率和谷氨酸分泌率计算谷氨酰胺净通量。
统计
数据表示为至少三次独立实验平均值（SEM）的平均±标准误差（一式三份）。一个不成对的双尾学生t吨-测试用于确定两组之间的差异。
