小鼠肝纤维化中肌成纤维细胞的来源

肌成纤维细胞的分离。

记者Col-GFP老鼠(22)已被广泛描述并广泛用于显示纤维化肝、肺、肾和皮肤中激活的肌成纤维细胞(三–5,8,23–36). 这些小鼠中GFP的表达与肝肌成纤维细胞中I型胶原蛋白的表达密切相关，但在内皮细胞、上皮细胞或其他细胞类型中不表达(37–39). 使用Col-GFP小鼠，我们已经证明激活的肝星状细胞（aHSC）（GFP）⁺，维生素A⁺，Desmin公司⁺细胞）占对CCl反应的肌成纤维细胞的92%以上₄-诱导或酒精诱导纤维化(1,40).

流式细胞术分析活化的肌成纤维细胞。

我们确定肝肌成纤维细胞组成的策略是基于GFP的特性⁺BDL-和CCl的非实质性肝组分中的细胞₄-治疗后的Col-GFP小鼠（包含所有Col1a1⁺和α-SMA⁺肌成纤维细胞；有关详细信息，请参见图S1A类) (22). 虽然胶原-α1（I）-GFP在所有活化的肌成纤维细胞中表达(40,41)，肝脏中维生素A（Vit.A）滴的表达仅归因于HSC(1) (图2A类). HSC的细胞命运定位[使用GFAP^Cre公司×Rosa26^{flox-TmRed-Stop-flox-GFP}老鼠(40);图S1B类和C类]研究表明，尽管HSC在激活时下调维生素A，但通过流式细胞术（维生素A的自荧光信号；图S1D类). 我们使用流式细胞术量化aHSC（GFP）的作用⁺维生素。A类⁺)和其他来源的肌成纤维细胞（GFP⁺维生素。A类⁻)在BDL和CCl中₄受伤(图2B类). 正如预期的那样，肝肌成纤维细胞（GFP）的激活⁺细胞，100%）仅在损伤的肝脏中观察到(图2B类). CCl公司₄-活化的肌成纤维细胞含有87±6%的GFP⁺维生素。A类⁺和13±3%GFP⁺维生素。A类⁻细胞。相反，BDL（20 d）小鼠的非实质部分由56±4%的GFP组成⁺维生素。A类⁺和42±5%GFP⁺维生素。A类⁻肌成纤维细胞，表明GFP的组成⁺肌成纤维细胞因肝纤维化的病因而异。GFP公司⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类⁻对细胞进行分类纯化和电镀(图2B类). 荧光显微镜证实两组分中GFP的表达，而Vit的表达。A类⁺仅在GFP中检测到液滴⁺维生素。A类⁺细胞。

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图2。

肝肌成纤维细胞的检测、定量和分离。(A类)流式细胞术分析肌成纤维细胞的策略：通过GFP表达在非实质组分中鉴定出表达I型胶原的肌成纤维纤维细胞，并进一步分离为Vit。A类⁺和维生素。A类⁻细胞。(B类)未经处理的BDL-和CCl非实质部分的FACS分析₄-经处理的Col-GFP小鼠：GFP⁺用488nm波长的氩激光和Vit检测细胞。A类⁺在405nm波长下用紫激光检测细胞。显示了代表性的点图，P（P）< 0.03. GFP公司⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类⁻对细胞进行分类纯化，并通过光学显微镜和荧光显微镜分析GFP和维生素A的表达（紫外线激光，20倍物镜）。(C类)基于流式细胞术的GFP定量⁺肌成纤维细胞。维生素A在绿色荧光蛋白中的表达⁺分析不同时间点Col-GFP小鼠非实质部分的细胞(n个=每个时间点6个）₄和BDL，P（P）< 0.01. (D类)GFP的免疫表型⁺从BDL小鼠分离的肌成纤维细胞。GFP公司⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类⁻从Col-GFP小鼠中分离纯化出的组分(n个=6）BDL后（20 d）。使用特异性抗体或同型匹配对照（40×目标）通过免疫细胞化学分析肌成纤维细胞标记物（α-SMA）、HSC标记物（结蛋白、GFAP、CD146）和PF标记物（弹性蛋白、Thy1）的表达。GFP公司⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类⁻细胞分别被鉴定为aHSC和aPFs。对于每个部分，计算阳性染色细胞的百分比（与总细胞相比，100%，P（P）< 0.05). (E类)GFP的量化⁺维生素。A类⁺和GFP⁺维生素。A类⁻分数基于GFP中HSC和PF特异标记的表达⁺免疫细胞化学检测肌成纤维细胞（100%），P（P）< 0.05.

BDL-和CCl中HSC的激活不同₄-诱导性肝损伤。

所有GFP分析⁺肌成纤维细胞（100%）显示GFP⁺维生素。A类⁺aHSC是CCl反应中激活的肌成纤维细胞的主要来源₄肝损伤(图2B类). 即使在CCl的早期时间点₄治疗后，79±3%（第5天）和88±4%（第14天）的肌成纤维细胞为GFP⁺维生素。A类⁺高速列车(图S2A类). 相反，BDL激活的HSC更少(图S2B类). BDL后5天，GFP⁺肌成纤维细胞主要由GFP组成⁺维生素。A类⁻细胞（73±5%），而GFP⁺维生素。A类⁺aHSC仅占GFP的18±7%⁺细胞。BDL后（17天），GFP⁺肌成纤维细胞由53±4%的GFP组成⁺维生素。A类⁻细胞和45±3%的GFP⁺维生素。A类⁺aHSCs，提示BDL中HSCs的激活与GFP的诱导有关⁺维生素。A类⁻肌成纤维细胞。基于流式细胞术的维生素数量统计分析。A类⁺和维生素。A类⁻肌成纤维细胞对BDL和CCl的反应₄总结如下图2C类.

GFP公司⁺维生素。A类⁺肌成纤维细胞起源于HSC，而GFP⁺维生素。A类⁻主要来源于aPF。

分类纯化GFP⁺维生素。A类⁻和GFP⁺维生素。A类⁺肌成纤维细胞通过特异性标记物的免疫染色进行表征。如预期，所有GFP⁺细胞表达肌成纤维细胞标记物α-SMA，表明在肝纤维化中只有肌肉成纤维细胞表达I型胶原。BDL激活的GFP⁺维生素。A类⁺肌成纤维细胞表达典型的HSC标志物GFAP（94±2.6%）、结蛋白（98±2%）和间充质标志物CD146（87±3.0%），证实GFP⁺维生素。A类⁺分数仅由aHSC组成(图2D类). 如预期，CCl₄-诱导GFP⁺维生素。A类⁺肌成纤维细胞是aHSC(图S3A类). 相比之下，GFP⁺维生素。A类⁻已建立的门静脉成纤维细胞标记物Thy1（93±4.0%）和弹性蛋白（86±3.4%）对肌成纤维细胞染色阳性)但缺乏HSC标记物（GFAP、Desmin、CD146；图2D类)骨髓细胞（CD11b、F4/80、CD68；图S3B类). 只有少量GFP⁺维生素。A类⁻细胞表达纤维细胞样标志物CD45（3.1±0.1%）和CD11b（2.4±0.3%）；图S3B类)，表明GFP⁺维生素。A类⁻该组分主要（95±4%）含有aPFs，并且不到4±1%的肌成纤维细胞来源于其他来源（例如纤维细胞和BM衍生的间充质祖细胞）。基于免疫细胞化学的肌成纤维细胞成分对BDL和CCl的反应分析₄总结如下图2E类.

基因表达谱区分BDL衍生aPFs和CCl₄-aHSC和BDL-aHSC。

将BDL-aPFs的基因表达谱与BDL-aHSC和CCl进行比较₄-美国健康安全委员会(图3A类). 通过对基因表达进行阈值确定的置信检测，我们证实aPFs表现出肌纤维母细胞样表型，与aHSC共有8981个基因的mRNA表达。这些基因包括Col1a1、Col1a2、Col2a1、TIMP-1、Spp1、TGFβ-RI、，和波形蛋白(图3C类)并且在aPFs中诱导至与BDL-和CCl相当的水平₄-aHSC。正如预期的那样，GFAP和Bambi mRNA在qHSC中高度表达，而血小板衍生生长因子-Rb在aHSC中上调。同时行动1在CCl中检测到₄-美国健康安全委员会(图3C类). aPFs上调了另外694个独特基因(图3A类). 这组基因丰富了与生物粘附、刺激反应、发育过程和细胞组织相关的基因本体论生物过程注释(图3B类)、运动、局部黏附、细胞黏附分子、肌动蛋白细胞骨架的调节，并与促纤维化Wnt信号通路的诱导相关(图S4). 此外，aPFs上调IL-18R、IL-25R的表达(图3C类)以及其他区别于aHSC的基因(表1，如下所述）。有趣的是，BDL-aHSC仅差异表达92个基因，与aPFs（635个基因）的相似性高于与CCl的相似性₄-aHSC（217个基因；图3A类)这表明，为了应对胆汁淤积性肝损伤，aHSC可能会模仿aPFs的表型（用于BDL-和CCl的比较₄-aHSC，参见图S5).

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图3。

aPF和aHSC的特征。(A类)BDL（20天）GFP⁺维生素。A类⁻aPFs和GFP⁺维生素。A类⁺通过全小鼠基因组微阵列分析aHSC，并将其基因表达谱与CCl中的基因表达谱进行比较₄-活化GFP⁺维生素。A类⁺HSC。与其他组相比，细胞组富集基因的文氏图显示出两倍以上的上调。(B类)GO-TERM：显示BDL-aPFs与BDL-或CCl中上调或下调的信号通路₄-aHSC。(C类)选定基因在qHSC、BDL-aHSC、BDL-aPFs和CCl中的表达₄-aHSC。结果是Agilant微阵列获得的相对mRNA水平（标准化值/多探针/每个基因的平均值），P（P）< 0.001. (D类)通过RT-PCR分析从同一小鼠分离的BDL-（5 d）aPFs和BDL-aHSC中纤维生成基因的表达(n个=6），并与qHSCs-aHSCs和CCl中的值进行比较₄（1.5个月）-aHSC。数据显示为与qHSC相比的折叠诱导**P（P）BDL-aPF和BDL-aHSC显示<0.02；ns不显著。(E类)分析BDL（17 d）-aPFs和BDL-aHSC（从同一小鼠分离，n个=6）通过RT-PCR对比qHSC。数据显示为与qHSC相比的折叠诱导*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，无显著性。(F类)同样，CCl₄-（1.5个月）aPF和CCl₄-aHSC，从同一小鼠中分离(n个=4）通过RT-PCR分析。数据显示为qHSC上的折叠感应*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. 中的数据D类–F类代表至少三个独立的实验。

PFs在BDL诱导的早期肝损伤中被激活。

我们的数据表明，aPFs和aHSC对BDL（20天；图3C类). 为了进一步表征aPF和aHSC的成纤维特性，我们检测了BDL的早期时间点。BDL 5天后(图3D类)，的表达水平第1a1列,美国陆军装备司令部、和TIMP1公司mRNA在aPFs中的表达远高于aHSC，表明在BDL损伤中PF的激活先于HSC的激活。例如，Co1la1公司与aHSC的20倍诱导相比，aPF的诱导倍数是qHSC的120倍。BDL 17天后(图3E类)HSC的激活变得更加突出（即。，第1a1列mRNA：aHSC诱导33倍，而aPFs诱导55倍）。与此同时，CCl₄-aPFs表现出低得多的水平第1a1列信使核糖核酸比CCl₄-aHSC（折叠诱导分别为20和160；图3F类)表明PF只是毒性CCl的次要因素₄-诱导性肝损伤。这些数据与我们之前通过流式细胞术获得的结果一致(图2)并证明BDL-aPF数量的增加与其激活水平之间存在相关性。

BDL衍生aPF的功能特性不同于aHSC。

先前的研究提出了aPFs和aHSC的差异，这是不同病因的纤维化的基础(42). 因此，我们评估了aPFs和aHSC对体外纤维生成刺激的反应。正如预期的那样，纤维生成细胞因子TGF-β1对aPF和aHSC有类似的作用(图4A类). 然而，aPFs对已知的HSC激动剂PDGF和NGF无反应（通过靶基因的mRNA表达证明周期D1;巴克斯,投标,比姆,Bcl-2型、和Bcl-xl公司分别）。尽管IL-18R高表达，但用IL-18（100 ng/mL；8 h）治疗aPFs并没有诱导受试IL-18靶基因的表达(MMP3、MMP8、和MMP13、Cox-2、iNOS、IL-6). 同时，只有PF对胆汁酸TCA有反应，增加第1a1列mRNA表达（>2.2倍于对照aPF诱导），表明TCA可能直接介导PF激活(图4B类). 此外，aPFs通过诱导IL-13对IL-25刺激作出反应[类似于IL-25处理的巨噬细胞对IL-13的诱导(43)和成纤维细胞(44)]. 虽然IL-13与HSC激活有关，但肝硬化患者IL-13水平上调(三,4,27)IL-13在淤胆性肝损伤中的作用尚不明确。我们假设BDL-aPFs产生IL-25介导的IL-13可能刺激HSC的激活。为了评估aPF产生的IL-13对HSC的影响，在IL-13存在的情况下培养qHSC。正如我们预测的那样(45)，IL-13增加CTCF公司（4h后）mRNA表达，并诱导Co1la1公司,美国陆军装备司令部,TIMP1公司，和HSC中的mRNA（24小时后）(图4C类)表明aPFs可能通过产生IL-13局部促进HSC活化。更详细的分析(图4D类)证明用IL-13刺激HSC会导致IL-13Ra2表达上调（但不是IL-13Ra1或IL-4）和IL-13靶基因转录上调腱糖蛋白和肠毒素(46,47). 由于IL-13治疗的HSC不表达IL-13或IL-6，我们得出结论，IL-13直接介导HSC活化，这种作用与ERK1/2的磷酸化有关（ERK抑制剂U0126完全阻断了这种作用；图4E类)p38和Smad1/5信号通路的激活。在人类原发性HSC中也获得了类似的结果。hIL-13诱导CCL11/eotaxin的剂量依赖性分泌(图S6A类)在hHSC中。在另一项实验中，hIL-13单独（或与TGF-β1联合）介导IL-13Ra2增加，Tenascin C公司,第1a1列,第3a1列,纤连蛋白、和LoxL2基因(图S6B类). 反过来，TGF-β1和血清刺激不会导致hHSC分泌IL-13(图S6C类)表明aPFs可能是肝纤维化中IL-13的来源。

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图4。

aPF和aHSC的功能特性。(A类)比较BDL-aPFs和CCl对细胞因子的反应₄-aHSC。aHSC和aPFs对TGF-β1（10 ng/mL）都有反应。aHSC而非aPFs对PDGF（100 pg/mL）和NGF（100 ng/mL）有反应。数据是与未经治疗的aPF（或aHSC）相比的折叠诱导，P（P）< 0.01. (B类)BDL-aPFs（但不是BDL-aHSC或CCl₄-aHSC）对胆汁酸牛磺胆酸（TCA；1200 nmol/mL）的反应是上调第1a1列和IL-13分泌产生的IL-25（100 ng/mL），P（P）< 0.05. 用牛磺脱氧胆酸盐（TUDCA；25 nmol/mL）、去氧胆酸（DCA；0.1 nmol/mL）、牛磺酚脱氧胆汁酸盐（TCDCA；60 nmol/m L）、牛磺酸β-丝氨酸（TbMCA；2000 nmol/mL.L）和胆酸（CA；20 nmol/mL.L）刺激aPFs未导致Col1a1诱导。数据是与未经治疗的aPF（或aHSC）相比的折叠诱导*P（P）< 0.05. (C类)评估IL-13对HSC激活的影响。qHSC与IL-13（100 ng/mL）孵育4 h和24 h。通过RT-PCR评估基因表达*P（P）< 0.01; **P（P）< 0.02; ns，无显著性。数据(A类–C类)代表三个独立的实验。在每次实验中，从三只小鼠身上分离细胞。(D类)小鼠HSC中的IL-13信号：如RT-PCR所示，IL-13刺激的HSC（100 ng/mL，6 h）上调IL-13Rα2、tenascin C和eotaxin，但不表达IL-13或IL-6。(E类)Western blot显示，HSC（2 h）中的IL-13信号传导导致ERK1/2、p38和Smad1/5磷酸化（ERK1/2被ERK抑制剂U0126、10μM阻断）。TGF-β1刺激的HSC作为对照。

新标记物的表达区分BDL衍生aPFs与BDL-aHSC和CCl₄-aHSC。

为了进一步区分aPF与aHSC和其他肌成纤维细胞，我们研究了整个小鼠基因组微阵列，以确定aPF的“特征基因”(表1). 与之前的研究一致，我们证实aPFs缺乏细胞球蛋白（HSC标记）的表达，但表达Thy1、弹性蛋白、Gremlin 1、Fibulin 2和NTPD2 mRNA（已报道区分aPFs和aHSC的标记）(2,11,17–21). 然而，cofilin-1的表达(21)区分aPF和CCl₄-aHSC，但不是来自BDL-aHSC的，这限制了该标记的用途。此外，aPFs唯一表达降钙素α（在BDL-aHSC或CCl中的最高值上，折叠诱导>48₄-aHSC）、间皮素（>28）、尿路生成素1β（>22）、碱性核素1（>18）、阿司匹林（>14）、蛋白多糖4（>14）、glipican 3（>12）和CD200（>11）mRNA(图S7). 这些基因在aPFs中特异性上调[但在静止或aHSC、内皮细胞、Kupffer细胞和肝细胞中无上调(图5A类和图S8A类)或BDL激活的胆管细胞(图5A类和图S8C类)]通过RT-PCR和免疫组织化学证实，表明这些基因可能是aPFs的潜在新标记。其中一些基因（包括碱性核素1、糖蛋白m6a、尿plakin 3b和1b、间皮素、IL-18R、降钙素相关肽、，和玻璃纤维)被报道为小鼠肝间皮的特征基因(48)和心外膜细胞(49) (图S7)，支持PFs来源于间皮细胞的理论(50,51).

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图5。

aPFs中间皮素的表达与小鼠淤胆性肝纤维化相关。(A类)通过RT-PCR比较aPFs和肝脏其他细胞中选定特征基因的表达。间皮素、阿司匹林、碱性核素1、降钙素-α,和尿路蛋白1βmRNA在BDL-（17天）aPFs中上调，但在KC、内皮细胞（EC）、BDL-和CCl中未上调₄-aHSC和qHSC，或BDL诱导的胆管细胞（Ch）。通过KC中F4/80、EC中CD31、Lrat、GFAP和HSC中Desmin、aPFs中Thy1和胆管细胞中K19的表达来评估每个组分的纯度。数据（来自三个独立实验）显示为相对mRNA表达，P（P）< 0.01. (B类)从BDL（17天）损伤的Col-GFP小鼠中分离出aPFs和aHSC，并用抗间皮素抗体染色。间皮素仅在aPFs中表达（而在GFAP中未表达⁺aHSC）并与Elastin（TE-7）和Thy1染色共定位。计算免疫染色细胞的百分比，P（P）<0.05（四个独立实验；图S7B类). (C类)BDL-（17天）或CCl肝组织石蜡切片₄-（1.5个月）给药小鼠(n个=每组4人）用抗间皮素抗体或同型对照进行免疫染色。在BDL小鼠中检测到间皮素的表达，但在假手术小鼠中未检测到。CCl中仅检测到少量间皮素阳性细胞₄-治疗小鼠。使用20倍和40倍物镜显示代表性图像(图S7C类). (D类)激光捕获显微切割检测到BDL诱导的间皮素上调（但不包括CCl₄-诱导）肝纤维化。激光捕获显微切割用于从BDL（20 d）小鼠和CCl中分离门周肌成纤维细胞₄（1.5个月）给药小鼠(n个=3/组），通过RT-PCR分析细胞aPF-和aHSC-特异性标记物的表达。间皮素、弹性蛋白和Thy1在从BDL肝门脉周围区域获得的肌成纤维细胞中高度表达。结蛋白在CCl中高水平表达₄-治疗过的肝脏。与结蛋白不同，间皮素在CCl中不表达₄-治疗的门脉周围区域。数据（来自三个独立实验）是与假小鼠门脉周围区域相比的mRNA折叠诱导*P（P）< 0.01; **P（P）< 0.05; ns，无显著性。

除降钙素α和间皮素外，大多数这些基因在肝纤维化中的作用尚未评估。降钙素α是一种钙代谢调节激素，与胆汁淤积性损伤的发病机制有关，缺乏降钙素的小鼠对BDL诱导的肝纤维化更具抵抗力(52). 反过来，间皮素是一种糖基磷脂酰肌醇连接糖蛋白，在肝间皮细胞和恶性间皮瘤中表达(53)并介导细胞内粘附和转移扩散(54). 间皮素敲除小鼠存活，无明显异常(55). 间皮素的表达仅在分离的aPFs中检测到，而在其他细胞组分中没有检测到(图5A类).

aHSC和aPFs是纤维化肝脏中肌成纤维细胞的主要来源。

尽管富含维生素A的脂滴是HSC的一个独特特征，但活化会导致这些脂滴减少(1). 然而，体内aHSC并没有完全失去其维生素A滴，如基因表达谱所证实的，维生素A诱导的浮力已成为体内净化静止和aHSC的标准方法(25,41). 我们目前的研究提供了额外的证据，证明维生素A是鉴定、定量和纯化aHSC的可靠标记物，使流式细胞术使用维生素A自体荧光作为从其他来源的肌成纤维细胞中纯化aHSCs的方法。流式细胞术能够鉴定肝肌成纤维细胞，并从同一小鼠肝脏中分离出高纯度的不同亚群肌纤维细胞（HSC和PFs）。

使用胶原蛋白-GFP报告小鼠，我们证明GFP的总数量⁺非实质部分分离的肌成纤维细胞由两个主要群体组成：Vit。A类⁺aHSC和维生素。A类⁻aPF。这些结果通过细胞特异性标记物、RT-PCR和基因表达微阵列的免疫染色得到证实。具体而言，aHSC被确定为维生素。A类⁺、GFAP⁺，Desmin公司⁺和CD146⁺表现出特定形态的细胞。反过来，维特。A类⁻aPFs缺乏GFAP或Desmin的表达，但以Thy1和Elastin的表达以及更圆的形态为特征。总的来说，HSC和PF贡献了超过94%的GFP⁺肌成纤维细胞。这种分析现在应该扩展到其他肝纤维化实验模型，如酒精诱导的肝病和非酒精性脂肪性肝炎。

aHSC和aPFs在不同病因的肝纤维化中的作用不同。

虽然aPFs在门脉纤维化发展中的作用已经被讨论过(42,61)，我们的研究是我们所知的第一个量化一段时间内肌成纤维细胞数量的研究。与以往研究一致(62,63)，我们证明aPFs在BDL诱导的肝纤维化的早期阶段发挥重要作用(13)占肌成纤维细胞的70%以上。此外，即使在晚期（BDL，17~20天），aPFs也贡献约50%的肌成纤维细胞，并且表现出比aHSC更活跃的表型。因此，肌成纤维细胞的组成因肝损伤和纤维化的病因和时间进程而异。

胆汁淤积性损伤导致aPFs的主要激活。

CCl的纤维生成机制不同₄和BDL肝损伤模型。CCl治疗₄具有肝毒性，导致肝细胞坏死和小叶周围区域炎症。然而，BDL会导致胆汁流动受阻，导致胆道压力升高、中度炎症和胆道上皮细胞分泌细胞因子(64). 游离胆汁酸的扩散（积累）可能会触发导管反应（胆管上皮细胞的增生反应），从而激活胆管细胞和门静脉成纤维细胞。PF激活的机制尚不清楚。在这里，我们认为TCA胆汁酸可以直接激活PF（而不是HSC），使其转化为肌成纤维细胞，这种作用可能依赖于TCA诱导的细胞毒性，因为据报道PF缺乏胆汁酸受体FXR（法尼类X受体）和TGR5（膜G蛋白偶联受体）(65,66). TCA诱导的PFs活化似乎是特异性的，用其他胆汁酸（TUDCA、DCA、TCDCA、TbMCA、CA）刺激并没有诱导PFs中的成纤维基因表达。然而，PFs对测试胆汁酸无反应可能是由于分离的PFs已经高度激活（BDL后5天），缺乏相应的受体(65)，或较差的实验条件(67). 此外，个别胆汁酸可能对PF产生其他影响，如细胞增殖和细胞因子分泌(17)，在本研究中未进行评估。此外，我们的体外条件可能无法模拟胆汁酸刺激PFs所需的复杂肝脏微环境(17). 另外，胆汁酸可能通过影响胆管细胞间接诱导PF激活(68)或肝细胞(65)反过来，可能通过细胞间信号或细胞因子分泌促进选择性aPF激活(64). 此外，活化胆管细胞产生的特定因子可能会使PFs对胆汁酸刺激预敏(69).

aPFS可能促进BDL肝损伤模型中HSC的激活。

aPFs的另一个特征是IL-25R的表达。随着BDL诱导的肝纤维化的发展，血清和肝脏中炎症前IL-17A、IL-25、IL-22和IL-6的上调(28). 因此，IL-25可能刺激aPFs并不奇怪。与其他细胞类型类似，IL-25诱导aPFs分泌IL-13，但没有进一步激活。IL-13与曼氏血吸虫感染性肝纤维化(70)最近，IL-13被证明直接刺激HSC产生CTGF，并随后逆转非寄生虫性肝损伤的纤维生成基因(71). 因此，我们假设在BDL后，IL-25刺激的aPFs分泌IL-13，IL-13促进HSC激活（通过诱导白细胞介素13受体2,第1a1列,肠毒素,腱糖蛋白,纤维连接和ERK1/2磷酸化）。支持这一观点的是Abcb4中的骨髓移植^−/−小鼠通过Th1反应减轻肝纤维化，但没有改变IL-13的产生水平(72)表明这些小鼠中一定存在IL-13的内源性来源。需要进一步研究以确定HSC激活对淤胆性肝损伤的反应机制。

非实质部分的分离。

使用蛋白酶/胶原酶方法灌注和消化肝脏(41)离心细胞，使肝细胞颗粒化。剩余的非实质细胞部分[包含肝肌成纤维细胞（HSC、门静脉成纤维细胞等）、枯否细胞、骨髓细胞和内皮细胞](41). 通过Col-GFP细胞分选分离aPFs和aHSC⁺维生素。A类⁻和GFP列⁺维亚特。A类⁺细胞。通过梯度离心（15%Nycodenz）分离枯否细胞（KC）和内皮细胞，然后分别用抗CD11b和抗CD31抗体进行磁性分选（Miltenyi Biotec）。胆管细胞是Gianfranco Alpini（德克萨斯州a&M健康科学中心，德克萨斯州中部退伍军人健康护理系统，Temple，TX）捐赠的，从BDL小鼠中分离得到(78).

小鼠全基因组基因表达芯片。

qHSC、CCl的基因表达谱₄-使用全小鼠基因组微阵列（Agilent）研究（1.5 mo）aHSC、BDL-（20 d）aHSCs和PFs(40). 请参见SI材料和方法了解详细信息。

人HSC中IL-13信号的特征。

人星状细胞（ScienceCell）被镀过夜，然后缺血6小时，并用IL-13、TGFβ1（R&D系统）或两者的组合刺激。采用夹心ELISA（RnD系统）在IL-13刺激48小时后，在无细胞上清液中检测CCL11/嗜酸性粒细胞趋化蛋白。24小时后通过定量RT-PCR评估基因表达。

定量RT-PCR。

从非实质部分、肝细胞部分或纯化的Col中分离出总RNA⁺维生素。A类⁺和Col⁺维生素。A类⁺细胞或肝星状细胞，采用RNeasy柱（Qiagen）。使用制造商（Invitrogen）描述的∆∆CT方法，在标准看家基因18S标准化后计算基因表达水平，并表示为与对照相比的相对mRNA水平。结果表示为平均值±SEM，P（P）< 0.0001.

我们感谢Sato博士和Uehiro博士在激光捕获显微切割方面提供的初步技术援助，以及Tom Kisby和Rebecca Dunmore在使用人类造血干细胞进行体外研究方面提供的技术援助。这项工作得到了国立卫生研究院DK088837、GM41804、AA15055、DK72237、AI0777802和P50 AA011999的支持；日本卫生、劳动和福利部；和美国肝脏基金会。