18kDa易位蛋白（TSPO）优先表达于类固醇生成组织的线粒体膜，其基因家族几乎存在于所有生物体中(1–三). TSPO最初被描述为一种外周苯二氮卓类受体，是地西泮的第二受体(1，4). 随后发现TSPO负责胆固醇运输到线粒体，从而影响神经甾体的合成(1，5). TSPO在细胞凋亡中也起重要作用(6)和压力适应(7). TSPO在脑损伤区域和神经炎症状态（包括阿尔茨海默病和帕金森病）中的表达强烈上调(2). TSPO位于线粒体内外膜的接触部位，与亲环素D、电压依赖性阴离子通道和腺嘌呤核苷酸转运体共同形成线粒体通透性转换孔(8).
TSPO配体在肿瘤细胞增殖抑制方面具有潜在的诊断和治疗应用(6)神经保护作用(2). 与传统苯二氮卓类药物相比，TSPO配体如XBD-173在治疗焦虑症方面也可能有用，副作用减少(9). TSPO的最佳特征配体是1-（2-氯苯基）-N-甲基-N-（1-甲基丙基）-3-异喹啉甲酰胺（PK11195），它在许多物种中以纳摩尔亲和力与TSPO结合(10–13). PK11195被用作正电子发射断层扫描中的生物标志物，用于显示神经元损伤患者的大脑炎症(2，10). 此外，TSPO配体PK11195和Ro5-4864的结合降低了小鼠可溶性β-淀粉样蛋白的水平(14). PK11195与TSPO结合的生化后果包括刺激TSPO介导的胆固醇向线粒体的转运(12，15).
序列分析表明TSPO组织为五个跨膜螺旋(1，4，16). 分离肽的圆二色性和核磁共振（NMR）研究支持小鼠TSPO（mTSPO）的螺旋结构(17). 电子显微镜进一步提供了一个10μl分辨率的密度图，表明细菌TSPO同源物，富含色氨酸的感觉蛋白球形红杆菌折叠成五螺旋束，进一步结合成同二聚体(18). 此外，以前的研究表明哺乳动物TSPO可以以功能形式过度表达和纯化(11). 药物配体以1:1的化学计量比和与天然蛋白类似的药理学特征结合到重组蛋白(11，12，19).
我们制备了重组mTSPO并将其重组为十二烷基磷酸胆碱（DPC）胶束。在没有PK11195的情况下，核磁共振信号高度重叠并聚集到一个区域(图S1). 低信号分散可能表明游离蛋白质的动态性质，并解释了该蛋白质结构研究中的困难。然而，在（右)-PK11195，用于正电子发射断层成像(10)与外消旋体相比具有更高的TSPO亲和力(20)，获得了高质量的核磁共振谱(图S1). 将核过热增强（NOE）实验和放松优化分配策略与补充氨基酸特异性标记相结合（请参见补充方法(21))大多数共振的允许赋值(图S2和S3). 具体来说，98%的主链共振和95%的侧链共振被指定，包括所有亮氨酸和缬氨酸甲基的完全立体特异性区分。共振分配的完整性以及高磁场下NOE实验的卓越质量产生了3300多个NOE距离限制，并使3D F1中61个TSPO-PK11195触点能够直接检测到-13C、，15N过滤/编辑-NOE实验(表S1和图S3、S4). 大量中远程NOE触点(图S4)以高分辨率确定TSPO-PK11195复合物的残基W5至S159的结构()，而N端和C端尾部保持动态(图S5).
mTSPO-PK11195复合物的高分辨率溶液结构。（A）由核磁共振波谱确定的20个最低能量结构的主干带状迹线（上面板）和全原子视图（下面板）。主链和侧链分别以银色和洋红色显示。配体是黑色的。（B）最低能量络合物结构的柱面表示，配位原子显示为球体。（C）mTSPO-PK11195复合物的细胞学和IMS视图。（A）和（B）中的灰色虚线表示近似的膜边界。
mTSPO-PK11195复合物的3D结构包括五个跨膜螺旋（TM1至TM5），当从胞质溶胶观察时，它们以顺时针顺序紧密地堆积在一起TM1-TM2-TM5-TM4-TM3(). TM1受P15干扰，而TM2和TM3受双脯氨酸基序干扰44聚丙烯45和96聚丙烯97分别是。TM2和TM3的51和81位也分别含有脯氨酸，TM5的139位脯氨酸使其向膜间空间（IMS）扭结。C末端带高正电荷并暴露于细胞质(图S6)，根据拓扑分析确定(16). 相反，在受体的IMS侧存在相同数量的正负电荷(图S6). 暴露于溶剂中的带电斑块可能对与携带内源性TSPO配体（如胆固醇）的蛋白质的相互作用很重要(22). 除了连接TM1和TM2的残基G28-P45外，跨膜螺旋之间的环很短。E29-A35折叠成相对于TM1长轴倾斜的短α螺旋线，并将TM1-TM2环定位在TM5和TM3-TM4环附近(). 由于TSPO的高序列保守性(图S7)mTSPO结构的拓扑结构可能保留在其他哺乳动物物种以及细菌同源物中。
TSPO作为单体结合药物配体，但也可以形成二聚体和高阶低聚物(11，23). 高质量的核磁共振谱表明，mTSPO在重组为DPC胶束时主要是单体(图S1、S2). 为了进一步支持mTSPO-PK11195络合物的单体状态，我们使用顺磁性化合物16-羟基-硬脂酸进行了滴定实验。在蛋白质分子周围观察到连续的顺磁环图案(图S8)，证明所有五个跨膜螺旋的中心部分都与洗涤剂的疏水尾部接触。此外，顺磁展宽数据证实了mTSPO的拓扑结构，并描绘了TSPO插入膜的区域(和图S8).
符合TSPO-PK11195相互作用的1:1化学计量比(11)，只观察到一组蛋白-干性接触(和表S1). 61例PK11195与TSPO的接触描述了螺旋束上部细胞溶质部分的五个跨膜螺旋形成的结合囊(). PK11195通过E-酰胺旋转体与mTSPO结合()，虽然在溶液中自由，但也可能有E-和Z-旋光体构象(24). PK11195接触由残留物A23、V26、L49、A50、I52、W107、L114、A147和L150形成的结合囊中的几个保守残留物(和图S7). 其中一个残基A147特别令人感兴趣，因为它与苏氨酸的天然多态性（Ala147Thr多态性，rs6971）强烈影响第二代放射性配体（而不是PK11195）的TSPO结合，从而影响这些配体在人类中的应用(25). 结合囊由TM1和TM2之间的长环从细胞溶质侧封闭(和图S7). mTSPO中41-51残基的缺失以及几个物种的定点突变支持了TM1-TM2环对PK11195结合的重要性(19，26). PK11195与TSPO的结合模式可能对其他相互作用很重要，因为PK11195会与几个小分子竞争结合TSPO(1，2，10). 此外，合成或内源性配体可能涉及额外的结合位点(1，2，10)，进一步规范TSPO职能。
PK11195与TSPO的绑定。（A）20个最低能量的叠加(对)-在TSPO-PK11195复合物结构中发现的PK11195构象。3D F1中的条带-13C、，15N过滤/编辑-NOESY-1H（H）-13C-HSQC（右）和3D F1-13C、，15N过滤/编辑-NOESY-1H（H）-15N-HSQC（左）实验显示PK11195和选定TSPO残基之间存在分子间NOE。配体原子被标记。二面角φ1, φ2, φ三、和φ4是20个最低能量结构±st.dev的平均值。（B）PK11195装订腔的详细视图。跨膜螺旋显示为绿色丝带，以棒状表示配体。（C）形成配体结合囊的TSPO残基。与（A）中相同的残留物显示在棒状图中。跨膜螺旋是彩色编码的。
胆固醇与重组TSPO具有纳米级亲和力(11). 这种相互作用通过胆固醇识别序列发生147ATVLNYYVWRDNS公司159TM5的羧基末端() (19，27). TSPO-PK11195复合物的3D结构表明，Y152、Y153和R156的侧链对胆固醇结合至关重要(19，27)位于TSPO结构的外部，指向膜环境(). 因此，它们不参与与PK11195的结合，这与这些残基的定点突变抑制与胆固醇的结合但不抑制与PK11195%的结合的发现一致(19，27). 胆固醇结合所必需的残基在TSPO结构外部的位置以及已知的胆固醇二聚能力表明，胆固醇结合可以调节TSPO的齐聚。事实上，一些转运体作为二聚体发挥作用(28). 胆固醇识别序列的残留物以及TM4中的L112-V115高度稳定，氢/氘交换证明了这一点(和图S9). 因此，PK11195的结合稳定了TSPO的3D结构，与添加PK11195后核磁共振信号色散的显著增加一致(图S1). 配体诱导的TSPO结构的稳定可能提供了一种促进胆固醇转运的机制() (12，13)与PK11195显著增加胆固醇与TSPO聚合物结合的观察结果一致(23).
TSPO结构的配体诱导调制模型。（A）在PK11195不存在（左）和存在（右）的情况下，TSPO构象的卡通表示。配体结合态的表示基于mTSPO-PK11195复合体的3D结构，如.与圆二色性一致(17)，假定无配体状态下的二级基序与mTSPO-PK11195复合体中的基序相似。DPC胶束中mTSPO的二维相关谱显示出窄的信号色散(图S1)，表明无配体结构的迁移率增加和螺旋堆积减少。胆固醇识别氨基酸共识CRAC被标记。配体结合后，细胞溶质通道入口被包含TM1-TM2环的盖子覆盖。（B）TM1-TM2盖子上的原子分辨率视图。CRAC残基Y152和R156对胆固醇结合至关重要(19，27)位于TSPO结构的外部，不涉及PK11195绑定。（C）TSPO-PK11195复合物的表面表征，突出了氢/氘交换28小时后最受保护的残留物（用白色标记）。其余蛋白质的颜色如（A）所示。灰色虚线表示近似的膜边界。
TSPO-PK11195复合物的3D结构揭示了这一重要受体家族成员在分子水平上的组织方式，并为理解TSPO在生理和病理条件下的功能提供了基础。
