骨骼肌周脂蛋白3和外套膜蛋白在运动后增加，并与脂肪氧化相关

人骨骼肌原代培养物的建立

通过从股外侧肌5名瘦削健康的白人男性捐赠者（年龄23.0±1.9岁，BMI 24.2±0.6 kg/m²). 人类原代肌肉培养的建立已从先前描述的方案中进行了修改[22]使用杂交瘤银行（爱荷华大学）提供的5.1H11抗体和MACS细胞分选柱系统（加利福尼亚州奥本市Miltenyi Biotec）对成肌细胞骨骼肌祖细胞进行免疫分类。来自五位捐赠者的成肌细胞培养物同时生长到大约90%的融合处，然后使用之前描述的方案合并在一起进行实验[23]细胞进一步生长到大约80%的汇合处，然后用补充有2%胎牛血清（纽约州格兰德岛生命技术公司）、1%牛胎球蛋白（密苏里州圣路易斯西格玛）和1%喷氏菌的α-最小基本培养基（纽约州Grand Island生命技术公司触发差异化。将细胞保存在分化培养基中7天，通过对融合的纵向多核细胞的视觉评估，将其视为肌管。

体外用原代人肌管治疗肾上腺素和PFI

采用Watt等人的技术治疗肌管。[20]用100μM肾上腺素（西格玛，圣路易斯，密苏里州）进行15分钟、30分钟和1小时的疗程，在每个时间点收集总蛋白。对于PFI实验，肌管用30μM棕榈酸盐、4μM毛喉素和0.5μM离子霉素（PFI）处理——所有这些都是从Sigma（密苏里州圣路易斯）购买的。我们之前的研究表明，肌管中的PFI处理增加了棕榈酸酯氧化，增加了线粒体氧化磷酸化复合物的表达，并改善了葡萄糖摄取[21]简而言之，肌管在分化培养基中维持4天，然后每天用PFI治疗1小时，再治疗3天。在没有PFI的情况下，每天对对照细胞的分化培养基进行类似的改变。PFI治疗3天后，PFI治疗后立即收集总蛋白和mRNA（0分钟），并在PFI治疗15分钟、30分钟和1小时后收集总蛋白。使用补充有2%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma，St.Louis，MO）、2%磷酸酶抑制剂鸡尾酒2（Sigma，St.Louis，MO）和2%磷酸酶抑制剂鸡尾酒3（Sigma，St.Louis，MO）的RIPA缓冲液（Sigma，St.Louis，MO）收集总蛋白。使用齐阿唑（Qiagen，Germantown，MD）收集总mRNA。

人类参与者的耐力训练

20名健康、血糖正常的男性参与者（16名白种人、3名非裔美国人、1名非特定种族）被招募参与本试验，他们没有参与竞技水平的运动。这些参与者的特征见表1身体成分通过双x射线吸收仪（DXA，QDR 4500A；Hologics，Waltham，MA）和VO进行评估₂最大值是在固定式自行车测功机上测量的（荷兰格罗宁根Lode Excalibur），使用增量工作负荷协议，同时使用代谢车进行气体交换测量（TrueOne 2400；犹他州桑迪ParvoMedics）。VO（旁白）₂在运动干预前2天以上评估max和DXA测量值，以防止运动对基线测量值产生任何混淆的急性影响。在运动会之前，参与者在晚上被送入机构住院部。第二天早上，在隔夜禁食后，使用DeltaTrac代谢车和经皮骨骼肌活检术测量静息代谢率股外侧肌进行肌肉锻炼。该运动试验的其他结果已经公布[24]使用Parvodics TrueOne 2400代谢车，通过吹口收集的呼气来评估运动时的气体交换。如前所述，计算了总能量消耗和底物氧化[25]。然后参与者以50%的VO在固定自行车上锻炼₂直到他们消耗了650千卡。在运动完成前8%、20%、40%、60%、80%和之后进行间接热量测定，以测量消耗了650 kcal的能量。定期抽血，并结合间接量热法测量，用化学发光免疫分析法测定肾上腺素和去甲肾上腺素（Immulite 2000™，Siemens Healthcare Diagnostics，Deerfield，IL）；通过Beckman Coulter DXC 600（加利福尼亚州Brea Beckman Coolter）上的酶法测定血糖、胰岛素和血脂。所有血清测量均遵循制造商的方案。这里我们只报道了运动前后的血清检测结果(表2). 运动后，立即从股外侧肌靠近第一次活检。

骨骼肌活检程序

利多卡因/布比卡因局部麻醉后，使用Bergstrom技术从股外侧肌（Propper Manufacturing Co.，纽约长岛市）。在基线检查和运动后分别进行两次切口收集组织。第二次活检是在运动结束后不超过3分钟的时间内进行的。对所有骨骼肌样本进行目测评估并清除肌内脂肪组织，然后立即在液氮中快速冷冻，以测量mRNA和蛋白质。样品被吸干，然后放置在最佳切割温度（OCT，Thermo Scientific，Waltham，MA）和Tragacanth粉末（Acros，Geel，Belgium）的混合物中，以进行糖原、肌内脂质和纤维分型的免疫组化测量。收集了另一个样本，用于测量体外棕榈酸酯氧化。

免疫组织化学测量

如前所述，使用免疫荧光技术测量纤维分型和肌细胞内脂质（IMCL）[24]纤维分型采用免疫组织化学方法，在12μm切片上进行，使用Microm HM 550（Thermo Scientific，Waltham，MA）获得。使用针对慢肌球蛋白重链1型（MHC1）的小鼠单克隆抗体检测1型纤维（MAB1628；Millipore，Burlington，MA），并使用针对层粘连蛋白的大鼠单克隆抗体（AB2500；Abcam Inc，Cambridge，MA）检测肌纤维细胞膜。然后用Bodypy 494染料（Molecular Probes，Eugene，OR）对切片进行复染，以染色IMCL。使用共焦显微镜（Leica TCS SP5 AOBS共振扫描多光子共焦显微镜，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）拍摄图像，并对I型纤维进行计数。IMCL是使用Sigma Scan Pro 5软件（SPSS，芝加哥，IL）通过描述肌纤维内的Bodypy染色来确定的。糖原含量使用周期酸、Shiff染色进行测量，并使用Sigma Scan Pro 5软件进行分析[26]中提供了运动干预前后IMCL、纤维分型和糖原的典型图像图S2对于所有组织学测量，在组织内获得三个横截面切片。从每个横截面切片中评估不少于50根纤维的IMCL含量、纤维类型和糖原。

体外骨骼肌中棕榈酸酯的氧化措施

如前所述，在骨骼肌中进行棕榈酸酯氧化试验[24]简单地说，将约75 mg骨骼肌组织均质化并装入捕获板装置中，以评估脂肪酸氧化的气体交换。0.176μM的棕榈酸总量（0.088μM的[1-¹⁴C] -将0.088μM非放射性标记棕榈酸酯中的棕榈酸酯添加到肌肉匀浆中。放射性标记棕榈酸酯来自美国放射性标记化学品公司（密苏里州圣路易斯）。无线电标签¹⁴一氧化碳₂用闪烁计数法评估棕榈酸酯氧化产生的不完全酸溶性中间体。将数据调整为从肌肉匀浆中获得的总蛋白质含量，该总蛋白质含量通过双钦酸分析测定（Pierce BCA，Thermo Scientific，Waltham，MA）。

骨骼肌中的基因表达

两者的总mRNA体内和在体外使用miRNEasy Mini Kit（马里兰州杰曼顿市齐根）提取实验，并使用高容量cDNA Kit（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）制作cDNA。使用TaqMan基因表达分析按需检测基因表达（加州福斯特市应用生物系统公司）；每个基因产品的目录编号列表见表S1使用7900HT快速实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行实时qPCR，并根据标准曲线测定表达水平。骨骼肌和肌管基因表达调整为RPLPO的表达。

骨骼肌中的蛋白质含量

通过使用Criterion装置和12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶（均购自加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad）的western免疫印迹法从总蛋白质提取物中测量蛋白质含量，并将其调整为GAPDH（AB9484；马萨诸塞州剑桥市AbCam）或通过胭脂红S染色（密苏里州圣路易斯市Sigma）评估的总蛋白质。PLIN3抗体购自Novus Biologicals（产品目录号：NB110-40764，Littleton，CO）。GBF1（AB86071）、ATGL（AB109251）和ARFRP1（AB108199）的抗体购自AbCam（马萨诸塞州剑桥市）。ARF1抗体购自Epitomics（产品目录号1635-1；加利福尼亚州伯灵盖姆）。

作者要感谢Crystal Traylor、Mary Susan Thomas和Pennington生物医学研究中心的护理人员。此外，我们要感谢Mindy Gaubert在RNA和蛋白质分离方面的协助，还要感谢Pennington生物医学研究中心基因组核心设施的Richard Carmouche和Susan Newman在实时qPCR方面的协助。最后，我们衷心感谢所有参与本研究的研究志愿者。