癌症患者的循环造血干细胞和祖细胞是髓样细胞

重要性

摘要

稳定状态下血细胞谱系的发展受到内源性信号的严格控制，内源性信号驱动造血干细胞和祖细胞（HSPC）向下游和高度增殖的谱系承诺祖细胞的顺序分化，例如：。，常见的髓系祖细胞和粒-单核祖细胞（GMP）(1–5). 骨髓和外周血中的这些祖细胞可以分化为未成熟的髓细胞（IMC），并产生大量最终分化的髓细胞。正常情况下，IMC迁移到不同的外周器官，在那里分化为巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞。然而，最近的研究表明，热休克蛋白细胞对外源性环境线索的敏感性远高于先前的预期，部分原因是各种微生物产物和炎症细胞因子的受体表达。例如，促炎细胞因子（IL-1、IL-6、干扰素等）和TLR4刺激可以影响HSPC分化的速度和方向(4,6,7). 这些数据强烈表明HSPC在病理条件下的初级免疫反应中起着直接和重要的作用；然而，HPSC在人类肿瘤中的性质和作用在很大程度上仍不清楚。

肿瘤进展与骨髓生成的深刻改变相关，骨髓源性抑制细胞（MDSCs）的招募和扩增导致骨髓生成的严重改变。MDSCs是IMCs和髓系祖细胞的异质性群体，对免疫反应进行负调控，增强癌细胞的“干性”，促进肿瘤转移和血管生成(8–11). 虽然确切的潜在机制尚不清楚，但MDSC的积聚通常被认为是由肿瘤衍生因子引起的(12,13). 恶性细胞和基质细胞产生的生长因子（GM-CSF、巨噬细胞集落刺激因子等）和促炎细胞因子可从人类骨髓中的前体细胞中诱导MDSC的快速生成(12,14). 这些发现与临床研究一致，这些细胞因子的血清浓度在癌症患者中通常升高，在某些情况下，这些浓度与不良预后有关(15,16). 然而，应该注意的是，与MDSCs具有相同表型的IMCs在健康个体的骨髓中不断产生，并分化为成熟的髓细胞，而不会引起免疫抑制，而这一过程可以转向癌症中病理性MDSCs的分化(8,9). 因此，对癌症患者HSPC和MDSC进行更详细的描述将有助于了解这些细胞在肿瘤免疫发病机制中的作用和潜在机制。

在这里，我们对133名患有7种不同类型肿瘤的患者和102名年龄匹配的健康人的外周血中HSPC亚群和其他造血祖细胞的频率进行了特征分析。我们发现实体瘤患者循环热休克蛋白的组成发生了显著变化，循环GMP水平增加了四到七倍，热休克蛋白普遍偏向粒细胞分化。循环GMP的频率与临床分期相关，与患者进展时间呈负相关。此外，我们使用脐血（CB）衍生的CD34⁺细胞建立体外短期培养模型并发现，在各种肿瘤产生的因子中，GM-CSF、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和IL-6不仅可以促进髓系分化，还可以诱导髓系前体细胞分化为功能性MDSC。

结果

实体瘤患者外周血中HSPCs的特征。

为了确定实体肿瘤患者中HSPC的组成是否发生改变，我们首先应用FACS来确定淋巴结内HSPC亚群的频率⁻CD34型⁺90例不同类型癌症患者和63例年龄匹配的健康献血者的外周血人群。6个HSPC亚群的分类基于联合表面标记的表达(图S1) (17,18). 结果表明，癌症患者外周血中GMP的频率是健康献血者的4至7倍。癌症患者的造血干细胞（HSC）和多潜能祖细胞（MPP）水平也显著增加，尽管不如GMP显著(图1). 相反，我们观察到癌症患者循环中常见髓系祖细胞显著减少。健康成人和癌症患者巨核细胞-红系祖细胞的频率没有明显差异，而普通淋巴祖细胞的出现频率很低（0～0.5%）⁻CD34型⁺细胞；图1).

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图1。

癌症患者循环热休克蛋白亚群的组成发生改变，并偏向于GMP。(A类)外周血HSPC亚群的典型FACS染色⁻CD34型⁺来自健康捐赠者和癌症患者的细胞。肝癌(n个= 26); 还有BC乳腺癌(n个= 9); CxCa，宫颈癌(n个= 19); ESC，食管癌(n个= 4); GC，胃肠道癌(n个= 18); LC，肺癌(n个=8）；NC，年龄匹配的健康捐赠者(n个= 63); OC，卵巢癌(n个= 4). (B类)林氏循环热休克蛋白C亚群综述⁻CD34型⁺人口。各组间的统计差异通过单因素方差分析计算，然后进行事后Bonferroni检验(*P（P）<0.05和**P（P）与健康供体相比<0.01）。(C类)饼图总结了健康献血者和患者HSPC亚群的频率。

与最近在人类骨髓样本中的发现一致(18)，我们还观察到健康献血者外周血中HSPC的年龄相关性改变的类似趋势，包括HSC和MPP的频率增加以及淋巴管内常见淋巴祖细胞的减少⁻CD34型⁺老年人人口(图S1). 与癌症患者的GMP显著增加相比，我们观察到健康老年人的GMP水平下降(图S1).

循环GMP的高频率与肿瘤进展相关。

为了确定GMP在肿瘤进展中的潜在作用，我们接下来分析了相关的临床信息，并将数据与循环GMP的频率相关联。肝细胞癌（HCC）患者；n个=28），GMP水平显著升高，并与临床分期相关(图2). 当HCC患者根据循环GMPs的中位数分为两组时，Kaplan–Meier分析显示，GMPs的频率与进展时间呈负相关(P（P）= 0.005). 与GMP水平较高的患者相比，GMP水平较低的患者进展时间显著延长（中位数为14个月）。此外，在治疗后1年内没有疾病进展的14名患者中，有11名属于低GMP组(图2). 在宫颈癌患者中也发现循环GMP水平与临床分期呈正相关(n个=13）和结直肠癌(n个= 15;P（P）=0.001和P（P）分别=0.013）。

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图2。

循环GMP增加预示着癌症患者的生存率较低。根据GMP频率中位数，将28例HCC患者分为两组。与高GMP组（红色）相比，低GMP组的个体（黑色）的存活率显著提高。采用Kaplan–Meier方法估计进展时间，并采用对数秩检验进行比较。林区GMP的频率⁻CD34型⁺肝癌患者的细胞(右上)、宫颈癌（CxCa、，左下方)和胃肠道癌（GC，右下角)按临床分期显示(*P（P）<0.05和**P（P）< 0.01).

髓样前体在结肠癌组织中积聚。

肿瘤可以招募IMC到肿瘤部位，然后在那里分化为MDSC以抑制抗肿瘤免疫。为了确定这一机制是否与目前观察到的实体肿瘤患者GMP水平与疾病进展之间的正相关，我们首先研究了骨髓前体在配对结肠肿瘤组织、瘤周组织和正常粘膜组织中的浸润和分布(n个= 8). 组织过滤白细胞的FACS分析显示，CD133表达细胞在癌周组织和正常粘膜组织中很少检测到（0～0.3%），但在肿瘤组织中显著增加（30.0±14.7%；图3A类和B类). 与循环CD133的结果一致⁺我们观察到大多数肿瘤浸润CD133⁺细胞CD3为阴性，但骨髓标记物CD15或CD14同时表达(图3A类和B类).

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图3。

结肠肿瘤组织中富含IMC。(A类)CD133的典型FACS分析⁺CD3（CD3）⁺，CD133⁺CD14号机组⁺和CD133⁺CD15型⁺组织中的细胞CD45⁺从8对结肠癌、癌周和相对正常粘膜组织中分离的细胞。(B类)来自的结果摘要A类. (C类)通过共聚焦显微镜分析冷冻切片中CD133（红色）、CD15（绿色）和DAPI（蓝色）的多重染色。CD133和CD15的共存证实了CD133的比例⁺CD15型⁺结肠肿瘤组织中的细胞。显示了10张代表性显微照片中的一张。(天)石蜡包埋切片中CXCR4（红色）、CD34（绿色）和DAPI（蓝色）的多重染色显示肿瘤组织中CXCR4-和CD34阳性细胞共存。显示了10张代表性显微照片中的一张。（比例尺，20μm）

我们随后检查了这些髓系前体在结肠癌组织冰冻切片中的原位分布。通过共聚焦显微镜，我们证实CD133蛋白在上皮内瘤变和肿瘤间质中表达，其中显著比例为CD133⁺CD15型⁺单元格(图3C类). 有趣的是，大量CD34⁺细胞共表达HSC归巢标记物C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4）(图3C类)表明这些髓系前体可能被动员并归巢到肿瘤组织(20).

GM-CSF、G-CSF和IL-6促进GMP扩张和MDSC与CB-Derived CD34的分化⁺细胞。

细胞因子是造血谱系选择的关键调节因子。其他系统的研究表明，G-CSF、GM-CSF和IL-6是主要的细胞因子，它们调节骨髓HSPC的骨髓生成，并诱导随后肿瘤浸润IMC的扩张和积聚(9,12,21). 为了研究这些机制是否也是癌症患者循环GMP水平升高的原因，我们首先测定了17名健康献血者和96名不同肿瘤患者的血浆中这些细胞因子的水平。结果表明，癌症患者的G-CSF和GM-CSF水平显著高于健康献血者（平均值和范围：G-CSF 18.3 pg/mL和3.9–70.8 pg/mL vs.11.4 pg/mL及4.4–17.2 pg/mL；GM-CSF2.2 pg/mL、0–45.2 pg/mL v.0–0 pg/mL；P（P）=0.005，两者均适用；图S4). 如之前的研究所示，癌症患者的血浆IL-6水平也显著升高(16).

这些结果表明，癌症患者的循环热休克蛋白细胞表现出普遍的髓样偏倚，并且这些髓样前体在肿瘤组织中富集。接下来我们确定G-CSF、GM-CSF和IL-6是否会影响造血前体细胞的分化和功能性MDSC的形成。我们使用了CB-衍生CD34⁺细胞建立短期培养条件，在此条件下，此过程可在体外可靠复制。纯化CD34⁺细胞在HSC扩张培养基中培养。经过8-10天的扩增，大多数细胞仍保存在林⁻大约一半的细胞保持CD133和CD34的表达(图4B类和C类). 然后将扩增后的细胞与GM-CSF、G-CSF和IL-6单独或联合培养3-4天。与未经处理的细胞相比，我们发现这三种细胞因子单独或联合均可增加Lin的频率⁺细胞，GM-CSF是最有效的。有趣的是，林⁺细胞仍表达CD34，表明其不成熟表型(图4B类和C类). 表型分析揭示了细胞因子在诱导造血前体细胞分化中的不同作用。GM-CSF和IL-6显著增加GMP的频率（Lin⁻CD34型⁺CD38型⁺CD123型⁺CD45RA⁺;图4B类和C类)以及表达高水平髓系标志物（CD11b、CD14和CD15）的细胞。G-CSF对CD14和CD15表达细胞的诱导作用最强，尽管它本身并不影响GMP频率。GM-CSF与G-CSF或IL-6联合使用可显著增加CD11b⁺CD14号机组⁺单元格(图S5A类和B类和图S6A类和B类). 总之，这些数据表明G-CSF、GM-CSF和IL-6有效地促进造血祖细胞分化为IMCs。

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图4。

GM-CSF、G-CSF和IL-6促进GMP和Lin的分化⁺CD34型⁺细胞。(A类)新分离的CD34⁺将CB单核细胞的细胞在HSC扩增培养基中培养8–10天。然后用细胞因子刺激扩增细胞3天，然后与异基因T细胞共培养。(B类)Lin的代表性流式细胞术数据⁻CD34型⁺细胞，Lin⁺CD34型⁺细胞和刺激后的GMP。(C类)林的频率摘要⁻CD34型⁺和林⁺CD34型⁺总有核细胞中的细胞和林中GMP的细胞⁻CD34型⁺刺激后的细胞。给出的值代表四个单独实验的平均值（±SE）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001与未经处理的膨胀细胞（Med）相比。

为了描述这些髓系细胞的表型特征，我们监测了巨噬细胞集落刺激因子受体（M-CSFR，CD115）和IL-4Rα（CD124）的诱导，这是激活MDSC抑制程序的两个关键成分(8,9,22). 与未经处理的细胞相比，G-CSF处理显著上调CD14上M-CSFR和IL-4Rα的表达⁺和CD15⁺细胞。GM-CSF和IL-6似乎增加了这些髓系细胞上M-CSFR和IL-4Rα的表达，但这种增加没有统计学意义，部分原因是它们诱导CD14的能力较低⁺和CD15⁺细胞比G-CSF(图S6B类). 同时，我们还评估了与这些培养的髓系细胞的抑制功能相关的其他MDSC标记物和分子的表达。CD14号机组⁺MHC II级（HLA-DR）^低/−细胞最近被鉴定为各种癌症患者血液中的一种新型MDSC，而程序性死亡配体1（PD-L1）是介导肿瘤环境中免疫逃避的关键分子(23). 我们发现G-CSF和IL-6单独或联合使用显著增加CD14的频率⁺HLA-DR公司^低/−和CD14⁺PD-L1型⁺单元格(图S6B类). 此外，G-CSF单独或与IL-6联合也刺激精氨酸酶I和CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）的表达，这是MDSC免疫抑制模式的两个关键介质(图S6C类).

我们还研究了GM-CSF和G-CSF对髓系分化及其M-CSFR和IL-4Rα表达的动力学和剂量效应。结果表明，这些细胞因子以剂量依赖的方式诱导骨髓样细胞和MDSC分化。骨髓分化动力学和M-CSFR及IL-4Rα表达的比较表明，在这些细胞因子处理的细胞中，骨髓分化先于M-CSFR和IL-4Rβ的表达(图S7). 这些发现表明，这些细胞因子不仅促进骨髓分化，而且诱导骨髓前体获得MDSC特征。

CB-Derived MDSC表现出强大的抑制活动。

为了证实CB-衍生MDSC（CB-MDSC）的免疫抑制活性，我们检测了它们对T细胞增殖和功能的抑制作用。对照组或细胞因子处理的CB-MDSC与纯化的同种异体循环T细胞以1:1的比例在抗CD3/CD28刺激下培养6d。羧基荧光素二乙酸琥珀酰酯试验表明，GM-CSF加G-CSF-或GM-CSF+IL-6处理的CB-mDSC可有效抑制CD3的增殖⁺，CD3⁺CD4细胞⁺，或CD3⁺CD4细胞⁻T细胞，而对照组CB-MDSC仅产生轻微影响(图5A类和B类). 同样，这些细胞因子处理的CB-MDSC抑制T细胞产生IFN-γ(图5C类和天). 我们还注意到，在CD3/CD28刺激下，CB MDSCs显著降低了T细胞的分裂周期数，这在细胞因子处理的CB MDSCs中更为明显(图5A类和B类和图S6天).

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图5。

CB-MDSC对T细胞表现出强烈的抑制活性，下调CD3ε表达，并诱导Foxp3⁺调节性T细胞。(A类)以1:1的比例将羧荧光素二醋酸酯琥珀酰酯类标记的pan-T细胞与CB-MDSC或不与CB-MDS共培养6d，然后进行FACS分析。显示了未分割单元格的百分比。(B类)T细胞增殖概述。(C类)T细胞PD-1、CD3ε和Foxp3表达的代表性染色。(天)PD-1频率总结⁺和CD25⁺Foxp3系列⁺T细胞CD3ε表达的平均荧光强度。从培养上清液中测定IFN-γ浓度。所示数据代表四个单独实验的平均值（±SE）*P（P）<0.05和**P（P）与未经处理的扩张细胞（Med）共培养的pan-T细胞相比，<0.01。

除直接抑制T细胞增殖外，其他系统的研究表明，MDSC还可以通过改变T细胞的表型和/或功能发挥其抑制活性，包括上调PD-1、下调CD3ε和诱导调节性T细胞(8,14,24). 因此，我们接下来确定CB-MDSC是否也配备了这些抑制机制。结果表明，对照组和细胞因子处理的CB-MDSC可有效提高活化T细胞表达的关键免疫关键受体PD-1的水平。有趣的是，与对照细胞相比，经细胞因子处理的CB-MDSC显著减弱了CD3ε的表达，CD3是TCR复合物中的关键成分，对T细胞生存和增殖至关重要。此外，与细胞因子处理的CB-MDSC共培养后，约一半的CD4⁺FoxP3（一种通常用作调节性T细胞标记物的转录因子）染色阳性的T细胞(图5C类和天).

讨论

癌症与造血缺陷相关，导致免疫抑制细胞积聚，这可能预示着患者的不良预后。最近的研究表明，热休克蛋白细胞对外源性环境线索的敏感性远高于先前的预期，并且可以作为各种病理条件的主要免疫反应的一部分(8,25–28). 本研究表明，各种实体瘤患者的循环热休克蛋白细胞的组成发生了显著变化，具有髓系分化，祖细胞的淋巴潜能下降。这些髓系前体在肿瘤组织中富集，循环GMP的高水平与肿瘤进展相关。通过使用CB-derived CD34体外短期培养模型⁺我们发现，GM-CSF、G-CSF和IL-6不仅可以促进髓系分化，还可以诱导髓系前体获得MDSC的抑制特征。这些结果表明，循环热休克蛋白细胞的改变可能是癌症患者骨髓造血失调和骨髓增生异常综合征细胞积累之间的重要联系。值得注意的是，我们的研究仅适用于实体肿瘤，因为用于分类人类HSPC亚群的CD123在血液恶性肿瘤中广泛表达(29,30).

最近的研究表明，造血不仅可以取代耗尽的子代库以维持体内平衡，而且由于HSPC上各种微生物产物和细胞因子受体的表达，造血还可以作为对感染性疾病、炎症和肿瘤的主要免疫反应的一部分(三,6,31,32). 因此，肿瘤生长与造血系统的严重紊乱有关，包括骨髓生成和白细胞增多。不同类型肿瘤患者的外周血中性粒细胞数量和中性粒细胞与淋巴细胞比率增加，可能是某些患者预后不良的指标(33). 本研究表明，这种癌相关骨髓生成也发生在循环热休克蛋白细胞水平。不同类型癌症患者的循环GMP频率增加了4至7倍，其水平与疾病进展相关。癌症患者的循环造血前体细胞选择性地丧失其淋巴潜能，并向粒细胞分化倾斜。有趣的是，这些细胞在肿瘤组织中高度富集，具有类似的表型特征，即在这些前体细胞上表达髓系而非淋巴样标记物。这些观察结果表明，除了充分成熟以产生特定类型的细胞外，癌症患者中的这些髓系前体可能通过归巢肿瘤组织而促进疾病进展。我们的发现支持了这一观点，即肿瘤浸润性造血前体表达CXCR4，CXCR4是趋化因子SDF-1在肿瘤中招募和保留趋化因子的主要归巢受体(20).

MDSCs是荷瘤动物和癌症患者免疫功能障碍的关键调节剂。这些细胞由异质性IMC组成，能够抑制免疫反应并促进血管生成。应该指出，感染或接种疫苗后IMC生成和/或招募的增加并不一定反映免疫抑制MDSC的扩张(8,34). 虽然精确的调控机制尚不明确，但一般认为MDSC的扩张和随后的激活受不同因素的调控，活动部分重叠(8,35). 通过建立CB-derived CD34的体外短期培养系统⁺本研究证明，肿瘤衍生细胞因子，包括GM-CSF、G-CSF和IL-6，足以促进造血祖细胞分化为IMC，并随后获得MDSC的抑制特征。我们的以下观察结果支持这一结论。首先，细胞因子组合的短期治疗显著增加了GMPs和表达高水平骨髓标志物（包括CD14）的细胞的频率⁺HLA-DR公司^低/−已被确定为新型人类MDSC的细胞。因此，癌症患者的GM-CSF、G-CSF和IL-6水平显著升高(图S4) (15,16). 其次，这些细胞因子的刺激上调了激活MDSC抑制程序的几个关键成分的表达，包括这些细胞上的M-CSFR、IL-4Rα、精氨酸酶I和C/EBPβ。第三，当与同种异体T细胞共培养时，细胞因子刺激的MDSC通过直接抑制T细胞的增殖和IFN-γ的产生而表现出较强的免疫抑制活性。除了直接抑制T细胞外，细胞因子刺激的MDSC还有效地诱导调节性T细胞的生成，并减弱CD3ε的表达。这些结果还表明，通过应用肿瘤环境中存在的细胞因子的组合，可以通过简单的短期培养系统生成人类MDSC。

肿瘤可以通过释放驱动髓细胞积聚的可溶性因子，调节骨髓和脾脏等远处的部位。在各种肿瘤产生的因子中，GM-CSF、G-CSF和IL-6可以从骨髓中的前体细胞中诱导MDSC的快速生成(12,14)和CB（本研究）。然而，这些细胞因子对MDSC的生成和激活有不同的影响。在我们的体外培养模型中，我们发现GM-CSF显著增加了GMP的频率。G-CSF本身并不影响GMP频率，但它对CD14的诱导有最有力的影响⁺和CD15⁺以及IL-4Rα和M-CSFR在这些细胞上的表达。虽然IL-6单独作用仅为边际效应，但与GM-CSF和G-CSF结合确实产生了加性效应。这些数据支持MDSC参与癌症的两阶段模型，这可能允许在不同的组织环境中灵活调节这些细胞。

我们的结果对人类实体肿瘤中MDSC的形成提供了重要的见解。来自癌症和/或基质细胞的细胞因子和其他可溶性因子可以改变HSPC的发育，并导致循环GMP和髓系造血前体细胞水平的增加。这些IMC在肿瘤组织中被招募并高度富集，在那里它们被激活以获得MDSC的抑制特性，从而促进肿瘤进展。这种循环热休克蛋白细胞组成的改变可以在所有不同类型的人类实体肿瘤中发现，因此可能是癌症患者骨髓造血失调和MDSC积聚之间的重要联系。鉴于MDSC作为治疗靶点的重要性日益增加，研究选择性调节或正常化循环HSPC的组成和分化的机制可能为抗癌治疗提供新的策略。

材料和方法

外周血和肿瘤组织样本或CB来自中山大学肿瘤中心或中山大学第一附属医院。所有样本均根据当地道德准则（《赫尔辛基宣言》规定）进行匿名编码，并获得书面知情同意书。该方案得到了中山大学审查委员会的批准。

153例经病理证实的肝细胞性肝癌患者的外周血样本(n个=62），胸部(n个=9），结直肠(n个=38），卵巢(n个=4），肺(n个=13），食道(n个=4），以及子宫颈(n个=23）癌症在治疗前服用。取8例结肠癌患者新鲜肿瘤、瘤周和正常粘膜（离肿瘤边缘至少5cm）组织配对，分离组织过滤白细胞并进行免疫荧光。临床分期根据国际抗癌联盟进行分类。所有患者的临床特征总结如下表S1从112名在我们癌症中心进行常规体检的健康献血者处采集了对照血样本，所有献血者的HCV、HBV、HIV和梅毒均为阴性。详细方法见SI材料和方法.

补充材料

鸣谢

脚注

工具书类