神经疗法。2014年4月；11(2): 419–432.
白藜芦醇改善运动神经元功能并延长SOD1的存活时间G93A公司ALS小鼠
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伦佐·曼库索
巴塞罗那大学神经科学研究所和细胞生物学、生理学和免疫学系，以及西班牙贝拉特拉生物研究中心（CIBERNED）
Jaume del Valle村
巴塞罗那大学神经科学研究所和细胞生物学、生理学和免疫学系，以及西班牙贝拉特拉生物研究中心（CIBERNED）
劳拉·莫多尔
巴塞罗那大学神经科学研究所和细胞生物学、生理学和免疫学系，以及西班牙贝拉特拉生物研究中心（CIBERNED）
安娜·马丁内斯
巴塞罗那大学神经科学研究所和细胞生物学、生理学和免疫学系，以及西班牙贝拉特拉生物研究中心（CIBERNED）
安娜·B·格拉纳多·西洛
西班牙莱伊达大学医学院实验医学系
奥马尔·拉米雷斯-努涅斯
西班牙莱伊达大学医学院实验医学系
MercéPallás酒店
西班牙巴塞罗那大学生物医学研究所（IBUB）、巴塞罗那国际农业大学和西班牙巴塞罗纳CIBERNED
Manel Portero-Otin公司
西班牙莱伊达大学医学院实验医学系
罗萨里奥·奥斯塔
西班牙萨拉戈萨萨拉戈萨大学阿拉贡健康科学研究所遗传生物化学实验室（LAGENBIO-I3A）
泽维尔·纳瓦罗
巴塞罗那大学神经科学研究所和细胞生物学、生理学和免疫学系，以及西班牙贝拉特拉生物研究中心（CIBERNED）
西班牙贝拉特拉，巴塞罗那大学医学院，E-08193
巴塞罗那大学神经科学研究所和细胞生物学、生理学和免疫学系，以及西班牙贝拉特拉生物研究中心（CIBERNED）
西班牙莱伊达大学医学院实验医学系
西班牙巴塞罗那大学生物医学研究所（IBUB）、巴塞罗那国际农业大学和西班牙巴塞罗纳CIBERNED
西班牙萨拉戈萨萨拉戈萨大学阿拉贡健康科学研究所遗传生物化学实验室（LAGENBIO-I3A）
西班牙贝拉特拉，巴塞罗那大学医学院，E-08193
通讯作者。 - 补充资料
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GUID:D4DD3857-2AE4-4707-B744-09D849865BC3
摘要
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种成人发病的神经退行性疾病，由于脊髓、脑干和运动皮层中运动神经元的退化而导致进行性瘫痪和死亡。如今，没有有效的治疗方法，患者在确诊后2-5年内死亡。白藜芦醇（反式-3,4′，5-三羟基二苯乙烯）是一种存在于葡萄中的天然多酚，具有良好的神经保护作用，因为它可以诱导涉及Sirtuin1和AMPK的多种神经保护途径的表达和激活。这项工作的目的是评估白藜芦醇给药对SOD1的影响G93A公司ALS小鼠。我们通过旋转试验确定症状的出现，并通过电生理试验评估上下运动神经元功能。我们评估了动物的存活率并确定了脊髓运动神经元的数量。最后，我们通过western blot和免疫组化分析进一步研究了白藜芦醇的作用机制。从8周龄开始的白藜芦醇治疗显著延缓了雌性和雄性动物的疾病发作，并保持了上下运动神经元的功能。此外，白藜芦醇显著延长SOD1G93A公司延长小鼠寿命，提高脊髓运动神经元的存活率。从12周龄开始延迟给予白藜芦醇也改善了脊髓运动神经元功能的保存和存活。进一步的实验表明，白藜芦醇的保护作用与脊髓腹侧Sirtuin 1和AMPK的表达和激活增加有关。两种介质都促进了自噬流量的正常化，更重要的是，增加了SOD1中线粒体的生物生成G93A公司脊髓。综上所述，我们的研究结果表明，白藜芦醇可能是一种有前途的ALS治疗方法。
电子辅助材料
本文的在线版本（doi:10.1007/s13311-013-0253-y）包含补充材料，授权用户可以使用。
关键词：运动神经元病、肌萎缩侧索硬化症、白藜芦醇、Sirtuin 1、AMPK、SOD1G93A公司小鼠
介绍
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其特征是上下运动神经元（MN）死亡，临床表现为进行性肌肉萎缩和瘫痪[1]. 虽然大多数ALS病例是散发的，病因不明，但其中10%是遗传形式，由基因突变引起。其中，约20%的患者观察到铜/锌超氧化物歧化酶1（SOD1）编码基因的突变[2]. 对这些基因突变的研究导致了几种ALS转基因动物模型的开发。最广泛使用的是转基因小鼠，该转基因小鼠过度表达人类突变形式的SOD1基因，在第93密码子处进行甘氨酸到丙氨酸的转换[三]. 该模型概括了家族性和散发性人类疾病最相关的临床和组织病理学特征[三]. SOD1蛋白在散发性ALS患者中的改变也具有相关性[4]，增加了这种小鼠模型的兴趣。一些机制被认为是ALS中MN死亡的促因，如谷氨酸兴奋毒性、氧化应激、蛋白质错误折叠、线粒体缺陷、轴突运输受损和炎症[5,6]. 然而，针对其中一些异常的积极实验结果未能转化为成功的人体试验[7,8].
白藜芦醇（3,5,4′-三羟基-反式苯乙烯）是一种存在于葡萄和红酒中的多酚，据报道具有延缓衰老和神经保护作用[9,10]. 尽管白藜芦醇具有这些有充分证据证明的有益作用，但其作用机制仍存在争议。然而，最近有报道称，白藜芦醇可以触发细胞内级联事件，这些事件集中在Sirtuin 1（Sirt1）、AMP-activated protein kinase（AMPK）和PGC-1α上，它们是重要的能量敏感调节因子[11,12]. Sirt1是NAD+-依赖性去乙酰化酶是细胞代谢网络的一个重要组成部分。它的激活已被证明可以防止几种神经退行性疾病中的神经退化[13]. 事实上，Sirt1可能通过调节几种细胞途径（例如自噬）促进神经保护[14,15]和线粒体生物发生[16]. 另一方面，人们也认为白藜芦醇的益处可能通过激活AMPK介导[16,17]. 有人提出，白藜芦醇主要通过激活AMPK发挥作用，然后AMPK通过提高其共基质NAD的细胞内水平间接激活Sirt1+[18,19]. 或者，白藜芦醇可以首先激活Sirt1，通过AMPK激酶LKB1的脱乙酰化和活化导致AMPK活化[20,21].
白藜芦醇给药已被证明对几种神经退行性疾病模型（如阿尔茨海默病）具有有益作用[10]和帕金森氏病[22]在创伤中[23]以及中枢神经系统的缺血性损伤[24]. 之前的研究表明，服用白藜芦醇可以保护MN在体外ALS模型[25,26]，本研究的主要目的是评估富含白藜芦醇的饮食在SOD1中的潜在治疗效果G93A公司ALS小鼠模型。
材料和方法
转基因小鼠与药物管理
具有G93A人SOD1突变的转基因小鼠（B6SJL Tg[SOD1-G93A]1Gur）从杰克逊实验室（美国缅因州巴尔港）获得，并保存在萨拉戈萨大学动物服务中心。半合子B6SJL SOD1G93A公司雄性是通过与来自CBATEG（西班牙贝拉特拉）的B6SJL雌性杂交获得的。通过从尾部组织提取的DNA进行PCR扩增来鉴定后代。将小鼠保持在标准温度条件下（22 ± 2°C）和12:12光照：黑暗循环，可获得食物和水随意所有实验程序均由进行动物实验的巴塞罗那奥托诺马大学伦理委员会批准。
在8周时（开始服用白藜芦醇之前）通过旋转和电生理测试对动物进行评估，以获得基线值。根据祖细胞、体重和电生理基线值，将动物分为平衡实验组。所有的功能和生存评估都是由研究人员进行的，这些研究人员都是在组内治疗的基础上进行的。富含白藜芦醇的饮食[10]给8周龄和12周龄的治疗组小鼠服用。假设正常食物摄入量为4克/只/天，白藜芦醇的日剂量为160毫克/千克。对照组接受标准饮食，研究期间的操作没有差异。表中总结了研究中的实验组。
表1
| 实验组 | 性别 | n个 | 开始治疗 |
|---|
| 野生型 | 雌性 | 10 | – |
| SOD1未处理 | 雌性 | 20 | – |
| SOD1+白藜芦醇 | 雌性 | 23 | 8周 |
| 野生型 | 男性 | 10 | – |
| SOD1未处理 | 男性 | 16 | – |
| SOD1+白藜芦醇 | 男性 | 22 | 8周 |
| SOD1未处理 | 雌性 | 8 | – |
| SOD1+白藜芦醇 | 雌性 | 8 | 12周 |
| SOD1未处理 | 男性 | 8 | – |
| SOD1+白藜芦醇 | 男性 | 8 | 12周 |
神经传导测试
在8周龄时对研究中使用的所有动物进行运动神经传导测试，然后每两周进行一次，直到16周。坐骨神经通过0.02 ms持续时间的单脉冲（Grass S88）通过放置在坐骨切迹处的一对针电极经皮刺激。用微针电极记录胫骨前（TA）和足底（骨间）肌肉的复合肌肉动作电位（CMAP，M波）[27,28]. 为了评估运动中枢通路，记录TA和足底肌肉的运动诱发电位（MEP），以响应经颅电刺激运动皮层，通过皮下插入的针电极传递0.1 ms的单一矩形脉冲，覆盖感觉运动皮层的颅骨上的阴极和鼻子上的阳极[27,29]. 所有电位都被放大并显示在数字示波器（Tektronix 450S）上，其设置适合测量从基线到最大负峰的振幅。为了确保再现性，记录针放置在显微镜下，以确保在解剖标志引导下所有动物的位置相同。在试验期间，通过恒温加热垫保持小鼠体温恒定。
运动测试
进行旋转试验以评估运动协调性、力量和平衡[30,31]研究中使用的所有动物（表). 小鼠每周接受三次以14 rpm的转速旋转杆的训练，然后在8至16周龄期间进行测试，旋转杆的任意最大维持时间为180秒。临床疾病发作被定义为动物无法在旋转杆上完成180秒的第一天。
DigiGait系统（Mouse Specifics，Boston，MA）用于评估疾病末期（16周龄）动物的运动性能。将动物放在跑步机皮带上，记录它们随着跑步机速度增加而跑的能力。根据我们实验室之前的研究，使用的跑步机速度为5、10、15、20、25和30 cm/s[32,33].
生存
为了进行生存评估，23名女性（10名未经治疗的女性，13名服用白藜芦醇的女性）和20名男性（10名没有治疗的男性，10名服用白黎芦醇）SOD1G93A公司使用小鼠。人们认为，当动物在30岁左右无法直立时，它们就到达了疾病的终点。
组织学
16周龄时，每组4-5只小鼠经心灌注4%多聚甲醛（PBS），取脊髓腰段，固定24小时后，在30%蔗糖中冷冻保存。在L2–L5节段水平之间用冷冻刀（Leica）连续切割40μm厚的横切面。对于每个片段，连续收集10个片段中的每个片段，将其分别置于涂有明胶的载玻片上或在Olmos培养基中自由漂浮。
将每只动物的一片玻片重新水化1分钟，并用3.1 mM甲酚紫酸化溶液染色2小时。然后，将载玻片在蒸馏水中清洗1分钟，脱水并用DPX（Fluka）固定。通过定位于脊髓节段腹角的MN进行鉴定，并按照严格的大小和形态标准进行计数；仅计数直径大于20μm、多角形和核仁突出的MN。在L4和L5节段的四个连续节段中计算了两个腹角中的MN数量[27,34].
另一系列切片用PBS-Triton-FBS封闭，并在4°C下与一级抗体抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP，1:1000，Dako）、兔抗电离钙结合适配器分子1（Iba1，1:1000、Wako）或抗irtuin 1（Sirt1，1:200，Abcam）孵育过夜。多次清洗后，在室温下用Alexa 488或Alexa 594结合二级抗体（1:200；Life Science）培养切片1小时，或用生物素化二级抗体培养切片1个小时（1:200，Vector），然后再用Alexa 584结合链霉亲和素培养切片1 h。对于共同定位，脊髓MN用435/455-Neurotrace荧光Nissl染色标记（1:200，《生命科学》）。为了量化星形胶质细胞和小胶质细胞的免疫反应性，在×400下拍摄了腹角灰质的显微照片，在确定背景校正阈值后，使用ImageJ软件测量GFAP或Iba1标记的积分密度[33]. 积分密度表示平均密度减去背景后高于阈值的区域。
蛋白质提取和蛋白质印迹
对于蛋白质提取，另一组小鼠（每个实验组4-5只）在16周龄时被麻醉并斩首。将腰椎脊髓切除并分成四等分，以隔离腹侧象限。其中一种用于蛋白质提取，并在改良的RIPA缓冲液（50 mM Tris–HCl pH 7.5，1%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠，0.2%SDS，100 mM NaCl，1 mM EDTA）中匀浆，加入10μl/ml蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）和磷酸停止磷酸酶抑制剂混合物（Roche）。清除后，通过Lowry分析（Bio-Rad Dc蛋白质分析）测量蛋白质浓度。
为了进行蛋白质印迹，将每个样品的20μg蛋白质装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。转移缓冲液为25 mM trizma-base、192 mM甘氨酸、20%（v/v）甲醇、pH 8.4。用PBS中5%的BSA加上0.1%的吐温-20封闭膜1小时，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。使用的主要抗体为：抗b-actin（Sigma；1:10000）、抗GAPDH（Millipore，1:20000）、抗血清Sirt1（Abcam，1:1000）、抗p53（Abcam1:500）、抗乙酰基p53（L382）（Millibore，1:500），抗AMPK（Cell Signaling，1:1000，抗Fis-1（ThermoScientific，1:1000）、抗丝裂原融合蛋白2（Sigma，1:1000，和抗复合体V亚单位α（分子探针，1:1000）。在室温下进行辣根过氧化物酶偶联二级抗体（1:5000，载体）培养60分钟。使用增强化学发光法对膜进行可视化，并分别使用Gene Genome仪器、Gene Snap和Gene Tolls软件（英国剑桥Syngene）收集和分析图像。
统计分析
数据以平均值±扫描电镜表示。使用重复测量和单向方差分析对电生理和运动测试结果进行统计分析，必要时使用土耳其事后测试。组织学数据采用Mann-Whitney U检验进行分析。使用Mantel-Cox试验分析发病和生存数据。
结果
白藜芦醇治疗延缓症状的发生并改善SOD运动障碍G93A型老鼠
当每只动物在旋转试验中首次出现运动能力缺陷时，都会考虑其症状的开始[35]. 结果显示症状出现明显延迟（Mantel-Cox试验，第页 < 0.05）在雌性和雄性治疗的SOD1中G93A公司与未经治疗的小鼠相比，分别为1周和2周的小鼠（图).
服用白藜芦醇可延缓疾病发作并改善SOD1患者的运动能力G93A公司老鼠。连续线表示白藜芦醇SOD1G93A公司经过治疗的动物(n个 = 23名女性；22只雄性），虚线代表SOD1G93A公司未经治疗的小鼠(n个 = 20只雌性；16只雄性）。一通过旋转试验评估的疾病发病率表明，男性和女性SOD1的症状出现明显延迟1周和2周G93A公司小鼠。b条通过旋转试验评估的运动性能显示，服用白藜芦醇后显著改善。数值表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001相对于SOD1G93A公司未经治疗的小鼠。c（c）通过Digigait测试评估运动性能，并表示为16周龄SOD1的比例G93A公司能够增加跑步机速度的老鼠。结果表明，用白藜芦醇治疗的动物的运动能力显著增加(第页 < 0.05，Mantel-Cox试验）
通过旋转步态和DigiGait测试评估运动性能[27,32]. 雌性和雄性白藜芦醇治疗小鼠的Rotarod性能均显著高于对照组SOD1G93A型鼠标（图). 此外，我们还探索了动物在跑步机上跑步的能力，这种跑步机会导致强迫运动。16周龄小鼠能够以越来越快的速度奔跑的比例表明，运动能力显著提高（Mantel-Cox试验，第页 < 0.001）).
白藜芦醇给药可保留SOD1的上下运动神经元功能G93A公司老鼠
上下MN功能受损是人类ALS病理学的主要特征[1]和动物模型[27,36,37]. 我们分析了足底、TA CMAP和MEP的振幅，分别作为上下MN功能状态的测量值。野生型小鼠TA肌肉的CMAP振幅在49至51 mV之间，跖肌的CMAP幅度在6至9 mV之间。在所有随访期间，CMAP振幅保持不变。相反，SOD1的CMAP振幅逐渐下降G93A公司如前所述，8至16周龄的小鼠在TA和足底肌肉中[27]. 结果表明，白藜芦醇处理的雄性和雄性小鼠的足底和TA CMAP振幅都得到了显著的保存（图). 由于在随访结束时MEP的振幅也得到了显著的保留，因此治疗也保护了中枢运动通路。在疾病末期（16周龄），白藜芦醇治疗组记录到MEP反应的动物比例增加，也证明了中枢运动传导的保存（图).
白藜芦醇治疗保留上下运动神经元功能。一雌性小鼠的电生理测试(n个 = 20个未治疗组与23个白藜芦醇治疗组SOD1G93A公司老鼠）。b条雄性小鼠的电生理测试(n个 = 16个未经治疗的与22个白藜芦醇治疗的SOD1G93A公司老鼠）。结果显示，无论男女，复合肌肉动作电位（CMAP）和运动诱发电位（MEP）振幅都得到了显著保存，16周龄时保持MEP的动物比例也有所增加。数值为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001相对于SOD1G93A公司未经治疗的小鼠
白藜芦醇降低SOD1脊髓运动神经元变性G93A公司老鼠
通过评估16周龄小鼠腰椎脊髓前角染色MN细胞体的数量来评估脊髓MN的存活率。我们重点分析了代表TA和足底肌运动核团的L4-L5节段[38]. MN计数仅限于第九层的外侧部分，因为MN的数量支配后肢肌肉。直径小于20μm的神经元被排除在计数之外，即使它们可能是萎缩的MN，因为它们不太可能发挥功能。雌性和雄性动物的MN计数汇总，因为性别之间没有显著差异。白藜芦醇给药显著减少SOD1中MN的变性G93A公司老鼠。SOD1期间G93A公司未经治疗的动物有18.2 ± 每个切片有1.3个MNs（与野生型相比为35.9%），白藜芦醇处理的小鼠有35.2个MNs ± 1.1（与野生型相比为63.6%），存活MN增加了近两倍（图). 图还显示了野生型、未经处理和白藜芦醇处理的SOD1腹角的代表性图像G93A公司说明神经保护作用的小鼠。
白藜芦醇能显著保护脊髓运动神经元免受变性。L4脊髓x200的代表性图像(一)野生型(b条)SOD1标准G93A公司未经处理和(c（c）)白藜芦醇SOD1G93A公司治疗小鼠(n个 = 每种性别和治疗5只动物）。比例尺，500μm。插入框显示单个运动神经元在×1000处的细节。比例尺，20μm(d日)L4–L5脊髓运动神经元定量显示白藜芦醇给药具有显著的神经保护作用(n个 = 每组5人）。数值为平均值±SEM*第页 < 0.05相对于野生型#第页 < 0.05与未经处理的SOD1G93A公司小鼠
白藜芦醇降低SOD1中的小胶质细胞免疫反应性G93A公司小鼠脊髓
据广泛报道，ALS患者的神经胶质细胞导致MN变性[39]和动物模型[40–42]. 我们评估了腰椎脊髓切片前角的星形胶质细胞（GFAP标记细胞）和小胶质细胞（Iba-1标记细胞）免疫反应性，以评估白藜芦醇治疗是否影响胶质细胞的反应。与MN计数一样，由于雌雄动物之间缺乏差异，因此将它们合并在一起。结果显示，白藜芦醇给药显著降低了SOD1前角的小胶质细胞免疫反应性，但没有降低星形胶质细胞免疫反应性G93A公司老鼠。而在未经处理的SOD1中G93A公司与野生型小鼠相比，小鼠Iba-1免疫反应性增加了1152%以上，白藜芦醇治疗使其降低到649%。GFAP免疫反应性在治疗后保持不变，因为未经治疗的动物和白藜芦醇治疗的动物分别比野生型水平显示出673%和614%的相似值（图).
白藜芦醇治疗可降低小胶质细胞的反应性。小胶质细胞（Iba-1，绿色)和运动神经元（荧光染色，蓝色)英寸(一)未经处理的SOD1G93A公司和(b条)白藜芦醇处理的SOD1G93A公司老鼠(n个 = 每种性别和治疗5只动物）。(c（c）)白藜芦醇给药后，Iba-1免疫反应定量显示显著降低。星形胶质细胞（GFAP，绿色)和运动神经元（荧光染色，蓝色)英寸(一)未经处理的SOD1G93A公司和(b条)白藜芦醇处理的SOD1G93A公司老鼠。(c（c）)GFAP免疫反应的定量在各组之间没有差异。比例尺，20μm*第页 < 0.05与野生型#第页 < 0.05与未经处理的SOD1G93A型老鼠。红外免疫反应性
白藜芦醇治疗显著延长SOD1的生存期G93A公司老鼠
从8周龄开始服用白藜芦醇可显著延长雌性和雄性SOD1的存活时间G93A公司小鼠（Mantel-Cox试验，第页 < 0.001). 而未经治疗的雌性和雄性SOD1G93A公司小鼠的平均寿命为134（平均值±SEM=130.7 ± 1.32）和127（121.6 ± 2.07）天，接受治疗的动物存活了148天（142 ± 2.76）和139（131 ± 2.37）天（图).
白藜芦醇显著延长SOD1G93A型小鼠存活。白藜芦醇治疗延长SOD1G93A公司动物中位寿命和最大寿命(一)女性(n个 = 13次治疗，10次未治疗）和(b条)男性(n个 = 11个处理，10个未处理）SOD1G93A公司小鼠
12周龄的白藜芦醇治疗也能改善SOD1的运动功能和神经保护G93A公司老鼠
考虑到从8周龄开始服用白藜芦醇所取得的重要效果，SOD1的症状前阶段G93A公司我们想知道，如果从第12周开始延迟治疗，当疾病症状明显出现时，是否也可以改善动物的状况。电生理分析显示，白藜芦醇治疗可保护脊髓MN功能，这可以通过增加TA和足底肌CMAP振幅来证明，16周龄时，与未治疗小鼠的值相比，这些振幅具有统计学意义（图). 这种功能效应伴随着L4–L5脊髓节段中存活的MN数量的显著保留（图)同时小胶质细胞反应性轻微降低(第页 = 0.15，图).
(一–b条)从12周龄开始延迟服用白藜芦醇可显著维持较低的运动神经元功能。男女SOD1足底和胫骨前肌复合肌肉动作电位（CMAP）振幅G93A型老鼠(n个 = 每种性别8人接受治疗，8人未接受治疗）。12周龄开始服用白藜芦醇(c（c）)显著保护L4–L5脊髓节段和(d日)轻微降低小胶质细胞反应性(第页 = 0.15). 数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05与野生型#第页 < 0.05与相应的未处理SOD1G93A公司小鼠
白藜芦醇诱导Sirtuin1表达和激活
人们已经广泛描述了白藜芦醇通过增加Sirt1活性来促进神经保护作用[9,43]. 为了评估Sirt1是否过度表达，我们通过western blot分析分析了腰椎脊髓中Sirt1的水平。结果表明，白藜芦醇处理的动物中Sirt1表达显著增加（图). 此外，腹侧脊髓的免疫组织化学显示Sirt1表达局限于MN（图). 为了检查Sirt1的活性状态，我们评估了其最重要下游靶点之一p53的乙酰化程度。事实上，我们发现p53的乙酰化显著减少，表明白藜芦醇治疗组Sirt1的激活增加（图).
SOD1中sirtuin 1（Sirt1）表达和激活增加G93A公司白藜芦醇治疗后的脊髓运动神经元。一白藜芦醇处理的动物的腰脊髓腹侧部分的Sirt1表达显著增加。b条L4脊髓的共焦显微照片证实，这种表达定位于脊髓运动神经元内。比例尺，20μm。重量野生型，SOD1c公司未经处理的SOD1G93A公司老鼠，Resv公司白藜芦醇治疗小鼠，数控阴性对照，无Sirtuin 1一级抗体或荧光染色。c（c）通过测量p53的乙酰化水平对Sirt1活性进行评估，结果显示显著的去乙酰化，因此，SOD1中Sirt1的活性增加G93A公司用白藜芦醇治疗的小鼠*第页 < 0.05与野生型#第页 < 0.05与未经处理的SOD1G93A公司小鼠
白藜芦醇治疗恢复自噬流量
越来越多的证据表明，自噬异常可能与ALS生理病理学有关[44]白藜芦醇已被报道为通过Sirt1激活自噬的调节剂[45]. 因此，我们检查了白藜芦醇治疗后动物的自噬状态。结果显示，服用白藜芦醇后，自噬LC3II和Beclin 1早期标记物正常化（图)表明白藜芦醇治疗使SOD1自噬通量正常化G93A公司小鼠脊髓。
白藜芦醇治疗后恢复正常自噬流量。一LC3b2/LC3b1比率。b条Beclin 1的表达通过给SOD1注射白藜芦醇而正常化G93A型老鼠*第页 < 0.05与野生型#第页 < 0.05与未经处理的SOD1G93A公司小鼠
白藜芦醇通过AMPK途径恢复线粒体功能并促进线粒体生物发生
最近的证据表明，白藜芦醇通过激活AMPK促进线粒体生物发生[16]. 因此，我们首先通过分析活性磷酸-AMPK和总AMPK形式来评估AMPK的表达和激活。结果显示pAMPK/AMPK比值显著增加(第页 < SOD1中腰椎脊髓腹侧部G93A公司用白藜芦醇治疗的小鼠（图). 接下来，我们分析了白藜芦醇治疗是否导致线粒体行为改变。我们发现SOD1G93A公司与野生型小鼠相比，未经治疗的小鼠呼吸链线粒体复合体的表达增加。相反，白藜芦醇治疗降低了这些线粒体复合体的表达，其水平与野生型小鼠相似（图). 最后，我们评估了脊髓腹侧线粒体的分裂和融合。结果显示，Fis-1表达显著增加，这是线粒体分裂的标志，而线粒体融合指标丝裂原2没有改变。综上所述，这些结果表明，白藜芦醇激活AMPK可能导致线粒体对能量应激的反应从呼吸链复合体的上调转变为线粒体生物生成的更适应性增加。
白藜芦醇使线粒体功能正常化，并增加线粒体生物生成。一五种不同线粒体呼吸链复合物的代表性western blot。b条量化显示对照组SOD1中所有复合物的表达显著增加G93A公司小鼠，而白藜芦醇给药的SOD1G93A公司小鼠的水平接近正常。c（c）白藜芦醇治疗后AMPK活化增强，pAMPK/AMPK比值增加证明。d日白藜芦醇给药SOD1后线粒体生物发生增加G93A公司动物。e（电子）治疗并未改变线粒体融合。数值为平均值±SEM*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001 vs.野生型#第页 < 0.05, ##第页 < 0.01, ###第页 < 0.001与未经处理的SOD1G93A公司小鼠
讨论
ALS的生理病理复杂性[5,6]是成功治疗发展的最限制因素之一。已经针对与疾病相关的一种或多种生理病理机制开展了多项工作，但即使取得了积极的实验结果，也未能转化为成功的人类治疗方法[7,8]. 可以想象，成功的治疗不仅应该对抗疾病的致病因素，还应该促进细胞神经保护通路，为MN提供生存工具。本研究的主要目的是评估白藜芦醇在SOD1中的潜在治疗作用G93A型ALS模型，因为有报道称它通过调节几种细胞途径对其他神经病理学产生有益的神经保护作用[9]. 我们的结果表明，白藜芦醇可显著延迟疾病症状的出现1-2周，并显著改善SOD1的运动性能G93A公司动物。此外，电生理测试显示脊髓MN功能得到维持，并且第一次显著改善了上MN功能。这些效应伴随着腰椎脊髓中较低MNs细胞体的保存增加。服用白藜芦醇也能显著延长雌性和雄性SOD1G93A公司寿命。此外，从明显的运动障碍开始（12周龄）延迟服用白藜芦醇仍能显著保护脊髓MN功能和脊髓细胞体。进一步的实验表明，这些治疗效果是通过脊髓中Sirt1和AMPK的增加表达和激活介导的，这两种物质都是众所周知的白藜芦醇效应物。此外，我们观察到白藜芦醇治疗动物的自噬流量显著恢复正常值，更重要的是，脊髓线粒体生物发生增加。
以前的研究表明，白藜芦醇及其下游效应物Sirt1和AMPK在神经退行性损伤和创伤性损伤模型中都能促进保护作用。事实上，在阿尔茨海默病和加速衰老的动物模型中报告了白藜芦醇的有效治疗效果[10,26,46]、多发性硬化[47,48]亨廷顿氏病[9,49]、帕金森氏病[22,50]甚至减少外周轴突变性[51]或促进外伤性脊髓损伤后的功能恢复[23]. 在这个意义上，白藜芦醇也被报道对在体外ALS模型。因此，Kim等人[26]表明白藜芦醇可以减少原代培养的过度表达SOD1的神经元的细胞死亡G93A型突变蛋白，Yáñez等人[52]证明该化合物可保护ALS患者免受CSF引发的神经元死亡。关于体内白藜芦醇对SOD1的影响G93A公司老鼠。Markert等人[53]据报道，25 mg/kg的膳食白藜芦醇不会产生功能性影响，而Han等人[54]结果表明，腹腔注射白藜芦醇20mg/kg可改善功能结果，尽管其重要性不如我们的研究所发现的。这种差异的一个可能解释是剂量和给药途径的差异。白藜芦醇的药代动力学已经得到了广泛的研究，表明口服后肠道吸收率高达80%，而高达98%的化合物在给药后7-15小时排出[55]. 因此，白藜芦醇治疗应采用高剂量饮食或腹腔注射，但注射频率应高于上述研究。
尽管已经进行了许多研究来阐明白藜芦醇的作用机制，但仍存在争议。众所周知，白藜芦醇通过一些特定的效应分子发挥作用，如Sirt1或AMPK[11,12]. Sirt1是NAD+-依赖性脱乙酰酶，在调节细胞代谢中发挥重要作用，最近被认为是几种神经退行性疾病的神经保护元件[13]. Sirt1诱导保护作用，因为它是参与多种细胞过程（如炎症）的多效应器的上游[43]，自噬[45]和线粒体功能[16,46]都与ALS生理病理学有关[5,56]. 在本研究中，我们发现Sirt1在SOD1的脊髓MN中过度表达G93A公司白藜芦醇给药后的小鼠。然后，我们通过评估最重要的Sirt1底物之一p53的脱乙酰度来评估Sirt1活性。事实上，我们发现p53乙酰化显著降低，证明Sirt1活性增加。
自噬具有多种生理功能，如蛋白质降解、细胞器转换和应激反应。据报道，在人类患者和动物模型中，自噬的失调会导致ALS病理学改变[44,57]. Li等人[58]据报道，SOD1中LC3b II的相对量从90天龄增加到140天龄G93A公司小鼠，伴有自噬小泡的积聚。这些发现可能是自噬流量受损的结果。因为人们假设Sirt1通过调节自噬发挥保护作用[45,59]，我们评估了两个最典型的自噬标记LC3和Beclin-1的表达。我们的结果表明，在SOD1中，Beclin-1和LC3bII/LC3bI比率均显著增加G93A公司与野生型同窝小鼠相比，证明自噬通量受损。相反，在服用白藜芦醇后，这两个标记物均归一化为野生型值。虽然自噬通量的恢复可能是白藜芦醇诱导的Sirt1激活下游的直接影响，但也可能是小鼠状况总体改善以及MN内稳态恢复的间接结果。
另一方面，最近的证据表明，白藜芦醇诱导的Sirt1激活通过AMPK激活起作用[18]. 根据这一观点，Park等人[12]最近描述，白藜芦醇通过抑制cAMP磷酸二酯酶促进AMPK磷酸化，从而增加cAMP的量。然后，AMPK通过提高其共基质NAD的细胞内水平间接激活Sirt1+[18,19]. 或者，其他作者提出，白藜芦醇可能首先激活Sirt1，通过AMPK激酶LKB1的脱乙酰化和活化导致AMPK活化[20,21]. 无论如何，服用白藜芦醇会直接或间接激活AMPK，SOD1中pAMPK/totalAMPK比率的增加证明了这一点G93A公司治疗动物。
许多研究强调了线粒体在神经退行性疾病发病机制中的共同作用[60]. 尽管对于线粒体异常的确切作用还没有达成共识[61]，人们普遍认为线粒体功能障碍是ALS发病机制的重要标志[5,62,63]. 几位作者表明，这两名患者的脊髓和肌肉线粒体功能都有缺陷[64]和ALS动物模型[65–67]. 白藜芦醇改善线粒体功能并诱导生物发生，尽管这种作用是否由AMPK激活介导存在争议[18]或Sirt1[16,68]. 由于在SOD1中发现Sirt1和AMPK都被过度激活G93A公司用白藜芦醇治疗的动物，我们对线粒体进行了详细分析。与预期相反，我们发现SOD1中所有呼吸链复合物显著增加G93A公司与野生型同窝小鼠相比，白藜芦醇治疗后小鼠完全恢复正常。然后，我们发现白藜芦醇处理的SOD1中裂变蛋白Fis-1的表达增加G93A公司小鼠，证明线粒体生物发生的一个活跃过程。我们的假设是，白藜芦醇可能促进线粒体对细胞应激的反应从呼吸链复合体的过度表达和由此产生的有害氧化介质的增加转变为通过增加线粒体生物生成而产生的更具适应性的反应。也有报道称，服用白藜芦醇可促进骨骼肌线粒体的生物生成[12,16]通过AMPK激活。需要进一步研究来评估白藜芦醇是否有益于SOD1G93A公司小鼠的部分原因可能是其对骨骼肌的影响。
神经炎症是神经退行性疾病的另一个常见病理特征[69]其调节被认为是一种潜在的治疗靶点[70]. 在ALS中，炎症反应的特征是小胶质细胞的激活和增殖，以及T细胞向脊髓的浸润。尽管尚不清楚这是MN变性的原因还是后果，但一些证据表明，它的操作可以改善疾病的进展。白藜芦醇被发现调节两者的神经炎症体内和在体外模型，专门针对活化的微粒体细胞[71]. 实际上，白藜芦醇通过减少其抑制剂IkB的磷酸化和随后的降解来抑制LPS激活的小胶质细胞中NF-kB通路的激活[72–75]. 我们的结果表明，与未经治疗的SOD1相比，服用白藜芦醇后，小胶质细胞（而非星形胶质细胞）的反应性显著降低G93A公司老鼠。尽管应该进行进一步的研究来评估确切的效果，但白藜芦醇调节小胶质细胞的活性，从而有助于在白藜芦醇给药的SOD1中观察到的神经保护作用G93A公司老鼠。
这项工作的结果表明，白藜芦醇在SOD1中具有强大的治疗作用G93A公司ALS模型。在这里，我们首次展示了一种治疗方法，该方法将显著保留MN的上下功能，转化为显著延迟疾病发作和延长动物生存期。这些影响与MN的重要保存和脊髓小胶质细胞反应性的显著降低有关。分子分析表明，白藜芦醇的有益作用伴随着Sirt1和AMPK的激活。这种多功能靶点结合抑制有害过程和促进神经保护通路，可能比靶点更受限的药物提供更好的翻译结果。这些发现强烈表明，白藜芦醇可能是运动神经元疾病的一种有前途的治疗方法。
致谢
这项工作得到了西班牙卫生研究基金会（Fondo de Investigación Santiaria）的PI1001787和PI111532赠款、TERCEL和CIBERNED资金、西班牙卫生部（Ministerio de Ciencia e Innovación）的SAF2009-12495赠款、FEDER资金和EC的行动成本-B30的支持。我们感谢Jessica Jaramillo和Marta Morell的技术帮助。RM是西班牙教育部博士前奖学金的获得者。
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作者报告没有利益冲突。只有作者对论文的内容和写作负责。
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1Wijesekera LC，Leigh PN。肌萎缩侧索硬化症。孤儿J罕见疾病。2009;4：3.网址：10.1186/1750-1172-4-3。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Cu/Zn超氧化物歧化酶基因突变与家族性肌萎缩侧索硬化症相关。自然。1993;364:362.[公共医学][谷歌学者] 三。Ripps ME、Huntley GW、Hof PR、Morrison JH、Gordon JW。表达改变的小鼠超氧化物歧化酶基因的转基因小鼠提供了肌萎缩侧索硬化的动物模型。美国国家科学院程序。1995;92:689–693. doi:10.1073/pnas.92.3.689。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Bosco DA、Morfini G、Karabacak NM、Song Y、Gros-Louis F、Pasinelli P等。野生型和突变型SOD1在ALS中具有异常构象和共同的致病途径。自然神经科学。2010;13:1396–1403. doi:10.1038/nn.2660。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Pasinelli P，Brown RH。肌萎缩侧索硬化症的分子生物学：来自遗传学的见解。Nat Rev神经科学。2006;7:710–723. doi:10.1038/nrn1971。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Ferraiuolo L、Higginbottom A、Heath PR、Barber SC、Greenald D、Kirby J等。突变超氧化物歧化酶1相关肌萎缩侧索硬化症中星形胶质细胞-运动神经元相互对话的失调。大脑。2011;134:2627–2641. doi:10.1093/brain/awr193。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7罗斯斯坦法学博士。小鼠和人类：协调临床前ALS小鼠研究和人类临床试验。Ann Neurol公司。2003;53：423–426。doi:10.1002/ana.10561。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Benatar M.迷失在翻译中：SOD1小鼠和人类ALS的治疗试验。神经生物学疾病。2007;26：1–13.doi:10.1016/j.nbd.2006.12.015。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Albani D、Polito L、Signorini A、Forloni G。白藜芦醇在不同神经退行性疾病中的神经保护特性。生物因子。2010;36:370–376. doi:10.1002/biof.118。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Porquet D、Casadesús G、Bayod s、Vicente A、Canudas AM、Vilaplana J等。饮食中的白藜芦醇可预防老年痴呆症标志物并延长SAMP8患者的寿命。年龄（多德）2013;35：1851年至1865年。doi:10.1007/s11357-012-9489-4。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Tennen RI、Michishita-Kioi E、Chua KF。寻找白藜芦醇的靶点。单元格。2012;148:387–389. doi:10.1016/j.cell.2012.01.032。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Park S-J、Ahmad F、Philp A、Baar K、Williams T、Luo H等。白藜芦醇通过抑制cAMP磷酸二酯酶改善衰老相关的代谢表型。单元格。2012;148:421–433. doi:10.1016/j.cell.2012.01.017。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Donmez G.sirtuins的神经生物学及其在神经变性中的作用。药物科学趋势。2012;33:494–501. doi:10.1016/j.tips.2012.05.007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Jeong J-K、Moon M-H、Bae B-C、Lee Y-J、Seol J-W、Kang H-S等。白藜芦醇诱导的自噬可预防人类朊蛋白介导的神经毒性。神经科学研究。2012;73:99–105. doi:10.1016/j.neures.2012.03.005。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Jeong JK、Moon MH、Lee YJ、Seol JW、Park SY。第三类组蛋白脱乙酰酶Sirt1诱导的自噬可预防朊病毒肽的神经毒性。神经生物老化。2013;34:146–156. doi:10.1016/j.neurobiolaging.2012.04.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Price NL、Gomes AP、Ling AJY、Duarte FV、Martin-Montalvo A、North BJ等。SIRT1是AMPK激活和白藜芦醇对线粒体功能的有益作用所必需的。细胞代谢。2012;15:675–690. doi:10.1016/j.cmet.2012.04.003。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18CantóC、Gerhart-Hines Z、Feige JN、Lagouge M、Noriega L、Milne JC等。AMPK通过调节NAD调节能量消耗 + 代谢和SIRT1活性。自然。2009;458:1056–1060. doi:10.1038/nature07813。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Fulco M、Cen Y、Zhao P、Hoffman EP、McBurney MW、Sauve AA等。葡萄糖限制通过AMPK介导的Nampt调节激活SIRT1抑制骨骼肌成肌细胞分化。开发单元。2008;14:661–673. doi:10.1016/j.devcel.2008.02.004。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Hou X，Xu S，Maitland-Toolan KA，Sato K，Jiang B，Ido Y，等。SIRT1通过激活AMP活化的蛋白激酶调节肝细胞脂质代谢。生物化学杂志。2008;283:20015–20026. doi:10.1074/jbc。M802187200。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Lan F，Caccedo JM，Ruderman N，Ido Y.SIRT1对LKB1乙酰化状态、胞浆定位和活性的调节。AMP活化蛋白激酶激活的可能作用。生物化学杂志。2008;283:27628–27635. doi:10.1074/jbc。M805711200。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Wu Y，Li X，Zhu JX，Xie W，Le W，Fan Z，等。帕金森病细胞模型中白藜芦醇激活的AMPK/SIRT1/自噬。神经信号。2011;19：163–174。doi:10.1159/000328516。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Liu C，Shi Z，Fan L，Zhang C，Wang K，Wang B.白藜芦醇改善脊髓损伤大鼠模型的神经元保护和功能恢复。大脑研究。2011;1374:100–109. doi:10.1016/j.braines.2010.11.061。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Wang L-M，Wang Y-J，Cui M，Luo W-J，Wang X-J，Barber PA，et al.一种膳食多酚白藜芦醇通过调节AMPK和SIRT1信号，在反复卒中模型中提供神经保护，从而降低缺血期间的能量需求。欧洲神经病学杂志。2013;37:1669–1681. doi:10.1111/ejn.12162。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Wang J，Zhang Y，Tang L，Zhang-N，Fan D.白藜芦醇通过上调肌萎缩侧索硬化突变型hSOD1-G93A运动神经元样细胞培养模型中SIRT1表达的保护作用。神经科学快报。2011;503:250–255. doi:10.1016/j.neulet.2011.08.047。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Kim D、Nguyen MD、Dobbin MM、Fischer A、Sananbenesi F、Rodgers JT等。SIRT1脱乙酰酶可防止阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化模型中的神经变性。EMBO杂志。2007;26:3169–3179. doi:10.1038/sj.emboj.7601758。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Mancuso R、Santos-Nogueira E、Osta R、Navarro X。运动神经元疾病小鼠模型的电生理分析。临床神经生理学。2011;122:1660–1670. doi:10.1016/j.clinph.2011.01.045。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28不同类型周围神经损伤和修复后的Valero-CabréA、Navarro X.H反射恢复和促进。大脑研究。2001;919:302–312. doi:10.1016/S0006-8993（01）03052-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29García-Alías G，VerdúE，Forés J，López-Vales R，Navarro X。大鼠光化学分级脊髓损伤的功能和电生理特征。神经创伤杂志。2003;20:501–510. doi:10.1089/0897715037653568。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Brooks SP，Dunnett SB。评估小鼠运动表型的测试：用户指南。Nat Rev神经科学。2009;10:519–529. doi:10.1038/nrn2652。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Miana-Mena FJ、Muñoz MJ、Yagüe G、Mendez M、Moreno M、Ciriza J等。G93A小鼠ALS模型的最佳表征方法。肌萎缩侧索。2005;6:55–62. doi:10.1080/14660820510026162。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Mancuso R，Oliván S，Osta R，Navarro X。SOD1（G93A）转基因小鼠步态异常的演变。大脑研究。2011;1406:65–73. doi:10.1016/j.braines.2011.06.033。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Mancuso R、Oliván S、Rando A、Casas C、Osta R、Navarro X.Sigma-1R激动剂可改善ALS小鼠的运动功能和运动神经元存活率。神经疗法。2012;9:814–826. doi:10.1007/s13311-012-0140-y。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Penas C，Pascual-Font A，Mancuso R，Forés J，Casas C，Navarro X。Sigma受体激动剂2-（4-吗啉乙基）1-苯基环己烷羧酸盐（Pre084）增加GDNF和BiP的表达，促进根撕脱伤后的神经保护。神经创伤杂志。2011;28:831–840. doi:10.1089/neu.2010.1674。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Ralph GS、Radcliffe PA、Day DM、Carthy JM、Leroux MA、Lee DCP等。使用RNAi沉默突变SOD1可防止ALS模型中的神经变性并延长生存期。自然医学。2005;11:429–433. doi:10.1038/nm1205。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36Fischer LR、Culver DG、Tennant P、Davis AA、Wang M、Castellano-Sanchez A等。肌萎缩侧索硬化是一种远端轴突疾病：在小鼠和人类中的证据。实验神经学。2004;185:232–240. doi:10.1016/j.expnerol.2003.10004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Ozdinler PH、Benn S、Yamamoto TH、Güzel M、Brown RH、Macklis JD。在hSOD1G93A转基因ALS小鼠中，皮质脊髓运动神经元和相关的脑下投射神经元发生早期和特异性神经变性。神经科学杂志。2011;31:4166–4177. doi:10.1523/JNEUROSCI.4184-10.2011。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38McHanwell S，Biscoe TJ。供应小鼠后肢肌肉的运动神经元的定位。Philos Trans R Soc Lond，B，生物科学。1981;293:477–508. doi:10.1098/rstb.1981.0082。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Haidet-Phillips AM、Hester ME、Miranda CJ、Meyer K、Braun L、Frakes A等。家族性和散发性ALS患者的星形胶质细胞对运动神经元有毒。国家生物技术。2011;29:824–828. doi:10.1038/nbt.1957。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 40Diaz-Amarilla P、Olivera-Bravo S、Trias E、Cragonilini A、Martinez-Palma L、Cassina P等。遗传性肌萎缩侧索硬化模型中促进运动神经元损伤的典型异常星形胶质细胞。美国国家科学院程序。2011;108:18126–18131. doi:10.1073/pnas.1110689108。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 41Yamanaka K、Boilee S、Roberts EA、Garcia ML、McAlonis-Downes M、Mikse OR等。运动神经元和少突胶质细胞以外的细胞类型中的突变SOD1加速了ALS小鼠的发病。美国国家科学院程序。2008;105:7594–7599. doi:10.1073/pnas.0802556105。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 42Sanagi T、Nakamura Y、Suzuki E、Uchino S、Aoki M、Warita H等。症状前肌萎缩侧索硬化模型大鼠面神经撕脱后激活的小胶质细胞参与运动神经元易损性增加。格利亚。2012;60:782–793. doi:10.1002/glia.22308。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 43Han S-H。sirtuin作为神经退行性疾病治疗靶点的潜在作用。临床神经学杂志。2009;5：120.doi:10.3988/jcn.2009.5.3.120。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 44Song C-Y，Guo J-F，Liu Y，Tang B-S.自噬及其对ALS的综合影响。国际神经科学杂志。2012;122：695–703。doi:10.3109/00207454.2012.714430。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 45Lee IH、Cao L、Mostoslavsky R、Lombard DB、Liu J、Bruns NE等。NAD依赖性脱乙酰酶Sirt1在调节自噬中的作用。美国国家科学院程序。2008;105:3374–3379. doi:10.1073/pnas.0712145105。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 46Herskovits AZ，Guarente L.Sirtuin在衰老的神经退行性疾病中的脱乙酰酶。细胞研究。2013;23:746–758. doi:10.1038/cr.2013.70。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 47Fonseca-Kelly Z、Nassrallah M、Uribe J、Khan RS、Dine K、Dutt M等。白藜芦醇对多发性硬化慢性小鼠模型的神经保护作用。前神经。2012;三:84. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 48Nimmagadda VK、Bever CT、Vattikunta NR、Talat S、Ahmad V、Nagalla NK等。神经元中SIRT1蛋白的过度表达通过激活多个SIRT1靶点来保护实验性自身免疫性脑脊髓炎。免疫学杂志。2013;190:4595–4607. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Maher P、Dargusch R、Bodai L、Gerard PE、Purcell JM、Marsh JL。多酚类费瑟素和白藜芦醇激活ERK，为多种亨廷顿病模型提供神经保护。人类分子遗传学。2010;20:261–270. doi:10.1093/hmg/ddq460。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 50金凤，吴强，卢Y-F，龚Q-H，石J-S。白藜芦醇对6-OHDA诱导的大鼠帕金森病的神经保护作用。欧洲J药理学。2008;600(1-3):78–82. doi:10.1016/j.ejphar.2008.10.005。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 51Araki T、Sasaki Y、Milbrandt J.增加核NAD生物合成和SIRT1激活可防止轴突退化。科学。2004;305:1010–1013. doi:10.1126/science.1098014。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 52Yáñez M、Galán L、Matías-Guiu J、Vela A、Guerrero A、GarcíA AG。肌萎缩侧索硬化症患者的脑脊液导致大鼠运动大脑皮层神经元的谷氨酸非依赖性死亡：白藜芦醇而非利鲁唑的保护。大脑研究2；1423:77–86. [公共医学] 53Markert CD、Kim E、Gifondorwa DJ、Childers MK、Milligan CE。单剂量白藜芦醇治疗肌萎缩侧索硬化小鼠模型。医学食品杂志。2010;13:1081–1085. doi:10.1089/jmf.2009.0243。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 54Han S，Choi JR，Shin KS，Kang SJ。白藜芦醇上调热休克蛋白并延长G93A-SOD1小鼠的生存期。大脑研究。2012;1483:112–117. doi:10.1016/j.braines.2012.09.022。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 55Amri A、Chaumeil JC、Sfar S、Charrueau C.白藜芦醇的服用：针对生物利用度限制的配方解决方案是什么？J控制释放。2012;158:182–193. doi:10.1016/j.jconrel.2011.09.083。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 56Robbrecht W，Philips T.肌萎缩侧索硬化症的变化场景。Nat Rev神经科学。2013;14：248–264。doi:10.1038/nrn3430。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 57Chen S，Zhang X，Song L，Le W.肌萎缩侧索硬化症的自噬失调。脑病理学。2011;22：110–116。doi:10.1111/j.1750-3639.2011.00546.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 58Li L，Zhang X，Le W.改变SOD1突变小鼠脊髓中的大自噬。自噬。2008;4:290–293.[公共医学][谷歌学者] 59Morselli E、Maiuri MC、Markaki M、Megalou E、Pasparaki A、Palikaras K等。热量限制和白藜芦醇通过Sirtuin-1依赖性诱导自噬促进长寿。细胞死亡疾病。2010;1：e10.doi:10.1038/cddis.2009.8。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 60Lin MT，Beal MF。神经退行性疾病中的线粒体功能障碍和氧化应激。自然。2006;443:787–795. doi:10.1038/nature05292。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 61Boilee S、Vandevelde C、Cleveland D.ALS：运动神经元及其非神经元邻居的疾病。神经元。2006;52:39–59. doi:10.1016/j.neuron.2006.09.018。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 62Shi P，Gal J，Kwinter DM，Liu X，Zhu H.肌萎缩侧索硬化症患者的线粒体功能障碍。生物化学生物物理学报。1802;2010:45–51. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 63Ferraiuolo L、Kirby J、Grierson AJ、Sendtner M、Shaw PJ。肌萎缩侧索硬化症运动神经元损伤的分子途径。国家神经科学评论。2011;7:616–630. doi:10.1038/nrneul.2011.152。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 64Wiedemann FR、Winkler K、Kuznetsov AV、Bartels C、Vielhaber S、Feistner H等。肌萎缩侧索硬化患者骨骼肌线粒体功能受损。神经科学杂志。1998;156:65–72. doi:10.1016/S0022-510X（98）00008-2。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 65Fuchs A，Kutter S，Mühling T，Duda J，Schütz B，Liss B，et al.肌萎缩侧索硬化症SOD1G93A小鼠模型疾病终末期脆弱运动神经元的选择性线粒体Ca2+摄取缺陷。生理学杂志（伦敦）2013;591:2723–2745. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 66Jung C，Higgins CMJ，Xu Z。肌萎缩侧索硬化转基因小鼠模型中的线粒体电子传递链复合物功能障碍。神经化学杂志。2002;83：535–545。doi:10.1046/j.1471-4159.2002.01112.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 67孔杰，徐忠。运动神经元大量线粒体变性引发表达突变SOD1的小鼠肌萎缩侧索硬化症的发病。神经科学杂志。1999;18:3241–3250. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 68Lagouge M、Argmann C、Gerhart-Hines Z、Meziane H、Lerin C、Daussin F等。白藜芦醇通过激活SIRT1和PGC-1α，改善线粒体功能，预防代谢性疾病单元格。2006;127:1109–1122. doi:10.1016/j.cell.2006.11.013。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 69Khandelwal PJ，Herman AM，Moussa CEH。神经退行性病变早期的炎症。神经免疫学杂志。2011;238：1-11.文件编号：10.1016/j.jneuroim.2011.07.002。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 70Yong VW，Rivest S.利用系统免疫系统治疗脑部疾病。神经元。2009;64:55–60. doi:10.1016/j.neuron.2009.09.035。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 71张峰，刘杰，石J-S。白藜芦醇在大脑中的抗炎作用：白藜芦醇在小胶质细胞激活中的作用。欧洲J药理学。2010;636：1–7.文件编号：10.1016/j.ejphar.2100.03.043。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 72Bi XL，Yang JY，Dong YX，Wang JM，Cui YH，Ikeshima T，等。白藜芦醇通过脂多糖激活的小胶质细胞抑制一氧化氮和TNF-α的生成。国际免疫药理学。2005;5:185–193. doi:10.1016/j.intimp.2004.08.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 73Candelario-Jalil E、de Oliveira A、Gräf S、Bhatia HS、Hüll M、Muñoz E等。白藜芦醇能有效降低脂多糖活化的大鼠原代小胶质细胞中前列腺素E2的生成和自由基的形成。神经炎杂志。2007;4：25.doi:10.1186/1742-2094-4-25。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 74Heynekamp JJ、Weber WM、Hunsaker LA、Gonzales AM、Orlando RA、Deck LM等。替代的反式苯乙烯，包括天然产物白藜芦醇的类似物，抑制人类肿瘤坏死因子α诱导的转录因子核因子kappaB的激活。医学化学杂志。2006;49:7182–7189. doi:10.1021/jm060630x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 75孟X-L，杨建勇，陈G-L，王L-H，张L-J，王S，等。白藜芦醇及其衍生物对脂多糖诱导的小胶质细胞活化的影响及其构效关系。化学-生物相互作用。2008;174:51–59. doi:10.1016/j.cbi.2008.04.015。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
