帕金森相关LRRK2突变R1441C/G/H损害LRRK_2的PKA磷酸化并中断其与14-3-3的相互作用

S910和S935是PKA磷酸化位点。

S935以前在体外和细胞培养中被描述为PKA磷酸化位点(12)；此外，S910和S935被鉴定为推测的IκB激酶位点(10). 在这里，我们证明除了S935之外，S910也是PKA磷酸化位点。首先，我们在体外用PKA磷酸化重组LRRK2 WT（使用Sf9昆虫细胞表达和纯化），并用磷酸特异性抗体抗pS910或抗pS935探测样品。LRRK2已经在S910和S935上显示出基础磷酸化，与PKA孵育后显著增加(图1A类). 这些体外研究结果在forskolin（FSK）/3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）刺激转染COS7细胞的细胞培养中得到证实。FSK是一种有效的腺苷酸环化酶激活剂，而IBMX抑制磷酸二酯酶活性，导致细胞内cAMP浓度快速增加。同样，我们观察到，与未经治疗的对照组相比，FSK/IBMX治疗导致S910和S935的LRRK2磷酸化增加(图1B类).

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图1。

S910和S935都是LRRK2中的PKA磷酸化位点。(A类)体外用PKA磷酸化从昆虫细胞表达系统纯化的StrepII/Flag-tagged LRRK2 WT。产品在4–12%梯度凝胶上分离，并使用针对pS910和pS935的磷酸化特异性抗体进行Western blot分析。(B类)在用StrepII/Flag标记的LRRK2 WT转染48小时后，COS7细胞被血清饥饿4小时，然后在37°C下与50µM FSK和100µM IBMX孵育30分钟。随后用Strep-Tactin Superflow富集LRRK2，用SDS/PAGE分离，并用抗p910或抗p935抗体进行免疫印迹。Amido Black染色证实蛋白质载量相等。

PKA磷酸化S1443和S1444上隔离的LRRK2 ROC结构域。

因为MS确定S1443和S1444为潜在的PKA磷酸化位点(表S1)，分离的ROC-GTPase结构域（1334-1516）用于体外激酶分析。如所示图2A类，ROC WT被PKA有效磷酸化，并且在PKA特异性抑制剂PKI的存在下其磷酸化被阻断。ROC域本身没有任何可检测的放射性标记(图2A类). 通过定点突变进一步验证了这些结果。产生ROC突变体，其中1443、1444位丝氨酸单独或一起被丙氨酸取代，并与PKA孵育。通过放射自显影术观察反应产物(图2C类)或在闪烁计数器中量化(图2D类). S1443A突变体的磷酸化效率与野生型ROC结构域（100%）相同，而³²S1444A中的P掺入显著减少。双突变体S1443A_S1444A导致磷酸化信号完全丢失，表明这两个残基可能作为LRRK2中的PKA磷酸化位点。

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图2。

S1443和S1444是PKA的靶点，在PD-related LRRK2突变R1441C/G/H中未磷酸化(A类)分离的ROC片段WT（氨基酸1334–1516）单独孵育（泳道1），或在不存在（泳道2）或存在（泳道3）PKA抑制剂PKI（10µM）和放射性标记的ATP的情况下与PKA一起孵育。反应产物通过SDS/PAGE分离，并通过放射自显影进行可视化。(B类)不同物种中新鉴定的PKA磷酸化位点S1443和S1444附近氨基酸的序列比对。强调了P-3精氨酸（R1441）和磷酸化位点（S1443和S1444）的位置。人类蛋白质序列(智人; GenBank登录号。{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q55007”，“term_id”：“75349862”，“term_text”：“Q55007”}}Q55007问题)，黑猩猩(黑猩猩; GenBank登录号H2Q5Q4），rat(褐家鼠; GenBank登录号F1LNJ1），小鼠(肌肉; GenBank登录号。｛“type”：“entrez protein”，“attrs”：｛“text”：“Q5S006”，“term_id”：“341940919”，“term_text”：“Q5S006”｝｝Q5S006问题)，清管器(苏斯克罗法; GenBank登录号A9XXE0）和牛(牛头怪; GenBank登录号E1BPU0）。(C类)分离的WT和突变体（S1443A、S1444A和S1443_S1444A）ROC结构域构建物与PKA孵育；放射性通过放射自显影术进行评估，并通过闪烁计数进行量化(D类). (E类和F类)对ROC R1441C/G/H的PKA磷酸化进行了研究，如下所述C类和D类考马斯染色显示负载相等。(D类和F类)PKA对ROC磷酸化作用归一化为WT。数据是三个实验的平均值，误差条显示±SEM.n.s.，不显著；***，P（P）与ROC WT相比<0.0001，通过单向方差分析和Tukey的事后检验计算。

PKA共识主题的突变大大减少了S1443和S1444的磷酸盐掺入。

几种哺乳动物LRRK2蛋白序列的比对表明，S1443和S1444及其侧翼基序高度保守(图2B类). 特别是，PKA可以有效地磷酸化含有一致序列RRXpS/pT的蛋白质（其中X是任何氨基酸，pS/pT是磷酸化的丝氨酸或苏氨酸），但PKA介导的磷酸化并不严格依赖于这个基序，并且基本残基和间距的偏差是可以容忍的，例如RXXpS/pP或RKXpS/p T和RXpS/pT，在已确认的体内底物中发现的KRXpS/pT或KKXpS/pT，如磷酸化酶激酶、果糖-6-磷酸-1-激酶、果聚糖-1.6-二磷酸酶和糖原合成酶(26——28). 有趣的是，pS1444和上游残余物R1441(¹⁴⁴¹R（右）澳大利亚标准普尔¹⁴⁴⁴)在LRRK2中，构成RXXpS/pT PKA识别基序(26,28)，其中pS/pT之前的第三个位置应该被精氨酸占据（P-3，LRRK2中的相应位置用粗体和下划线标记），以便PKA底物识别。因此，我们假设精氨酸（P-3）的致病性突变为半胱氨酸、甘氨酸或组氨酸残基将有效阻止PKA的磷酸化。为了回答这个问题，我们探讨了ROC片段中已知致病性LRRK2突变R1441C/G/H对PKA磷酸化的影响。值得注意的是，在PKA体外激酶检测中，ROC R1441C、R1441G或R1441H均未磷酸化(图2E类和F类)，将R1441位置处的精氨酸识别为S1444处PKA磷酸化的do-or-die情况。

S1444上LRRK2的PKA磷酸化诱导14-3-3结合。

先前的研究表明，S910和S935的磷酸化促进LRRK2和14-3-3的相互作用(12,19). 然而，许多14-3-3客户蛋白，如Cdc25B，含有一个以上的14-3-3结合位点(29). 为了检验S910和S935以外的区域可能与14-3-3相关的可能性，我们用StrepII/Flag标记的LRRK2 WT和相应的N-末端截短突变体（LRRK2 WT∆967）进行了GST–14-3-3下拉实验，该突变体在S910和S935周围缺乏14-3-3结合位点。与GST对照组相比，GST–14-3-3γ与野生型和N末端截断的LRRK2表现出特定的相互作用(图3B类). 因此，不含S910/S935的LRRK2 WT∆967被GST–14-3-3γ有效沉淀，这强烈表明LRRK2中存在额外的14-3-3对接位置。

接下来，我们详细研究了介导14-3-3与LRRK2 WT∆967结合的残基。14-3-3蛋白与其结合伙伴之间的大多数相互作用取决于靶蛋白中离散基序内丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化，称为模式I（RSXpS/pTXP）和模式II[RX（F/Y）XpS/p TXP](30). 有趣的是，通过比较这些基序，我们发现S1444及其周围的氨基酸序列与14-3-3的I型结合序列非常相似(图3A类).

为了测试S1444是否具有作为PKA诱导的LRRK2中14-3-3结合位点的潜在作用，我们合成了含有非磷酸化S1444（LFNIKARASS公司SPVILVGT）和磷酸化S1444（LFNIKARAS第页S公司SPVILVGT），并检查其在下拉中与LRRK2 WT∆967结合GST–14-3-3γ的能力。通过以增加的浓度应用肽，我们发现含有磷酸化S1444的肽以剂量依赖性的方式抑制LRRK2 WT∆967与GST-14-3-3γ的相互作用，而对相应的非磷酸化肽没有观察到任何影响(图3C类).

为了验证LRRK2区域1334-1516（ROC-GTPase结构域，包括S1444）的PKA磷酸化可能调节其与14-3-3蛋白的相互作用的假设，并排除其他区域，我们使用分离的ROC结构域进行了Far-western分析。ROC WT在PKA存在或不存在的情况下培养，然后用SDS/PAGE分离蛋白质，并将其印在PVDF膜上进行远西分析(图3D类). 当以0.1µM的浓度应用重组14-3-3γ时，检测到14-3-3仅与PKA磷酸化的ROC融合蛋白结合，而不与非磷酸化的ROC融合蛋白结合。除了ROC WT外，还测试了缺乏特定PKA磷酸化位点的突变蛋白（S1443A、S1444A和S1443A_S1444A）在PKA处理后的14-3-3结合。用丙氨酸取代丝氨酸1444完全消除了磷酸化依赖的14-3-3相互作用，而取代相邻丝氨酸（S1443A）与ROC WT相比，14-3-3结合没有显著降低。相应地，ROC双突变体S1443A_S1444A在PKA培养后也没有与14-3-3交互作用。

LRKK2与14-3-3结合亲和力的测定。

为了进一步表征在丝氨酸1444处翻译后修饰的LRRK2与14-3-3的结合能力，我们通过荧光偏振（FP）和表面等离子体共振（SPR）分析了14-3-3与磷酸化或非磷酸化LRRK_2肽的结合。FP用于测定三种14-3-3亚型（γ、θ和zeta）对四种不同的荧光标记LRRK2肽的亲和力。除了包含LRRK2残基R1441、S1443和S1444的肽（称为野生型序列）外，还测试了包含S1444磷酸化、致病性突变R1441G或不可磷酸化变体S1444A的三种变体肽。在存在或不存在PKA的情况下培养肽，然后在测量FP信号之前与相应的14-3-3蛋白混合。

如所示图4磷酸化的LRRK2 WT肽（pS-LRRK2-1444）与所有三种14-3-3亚型结合，高FP信号表明，而非磷酸化的WT LRRK1肽不与任何14-3-3异构体结合。非磷酸化WT肽与重组PKA的预培养导致与所有14-3-3亚型的结合显著增加。作为对照，在PKA预培养期间，在存在PKI（1µM）的情况下阻止WT肽磷酸化，随后未观察到与14-3-3蛋白的相互作用。含有致病性变体LRRK2-R1441G或磷酸化变体LRRK-2-S1444A的肽与任何14-3-3蛋白均无相互作用，与PKA预处理无关(图4).

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图4。

GST–14-3-3与与LRRK2新识别的14-3-3结合区相对应的合成肽的结合。直接FP分析：在激酶缓冲液中存在或不存在500 nM PKA的情况下培养20 nM荧光标记的LRRK2肽。在PKA特异性抑制剂PKI（10µM）存在下进行对照实验。每个数据点代表三次测量的平均值±SEM。

接下来，我们使用10 nM的荧光标记肽和相应14-3-3蛋白的系列稀释液，在直接FP结合分析中测量了两个相应肽对每个14-3-3亚型的亲和力。磷酸化WT肽（pS-LRRK2-1444）与14-3-3γ结合，亲和力为220 nM，而非磷酸化WT-肽没有结合(图S2). 14-3-3θ（K_d日：940 nM）和14-3-3 zeta（K_d日：650 nM）分别降低了4.5倍和3.3倍(表1).

使用FP，我们进一步将14-3-3与磷酸化-S1444的结合与最近发表的磷酸化位点S910和S935进行了定量比较。合成了与磷酸-S910（pS-LRRK2-910，SFLVKKKSN）相对应的磷酸化和非磷酸化肽第页S公司ISVGEFYRD）或磷酸-S935（pS-LRRK2-935，SPNLQRHSN第页S公司LGPIFDHED）。基于这些实验，与pS-LRRK2-910相比，与ROC结构域相对应的磷酸肽pS-LRR1444对14-3-3γ、θ和zeta具有更高的亲和力(表1). 相应的非磷酸化肽均未与14-3-3蛋白结合(表1或图S2). 值得注意的是，与之前的报道相比，将磷酸化S935描述为14-3-3受体位点(12,19)，我们未发现pS-LRRK2-935磷酸肽与14-3-3有显著结合。

我们还应用SPR直接分析了分别固定在一个传感器芯片上的N-末端生物素化、非磷酸化（S1444）和磷酸化（pS1440）LRRK2肽之间的相互作用，并在表面注入14-3-3蛋白γ、θ或zeta。三种亚型中没有一种与非磷酸化肽相互作用，而与磷酸化肽的结合可以清楚地检测到(图5). 综上所述，上述实验表明，在S1444磷酸化的LRRK2直接与14-3-3结合，并且这种相互作用取决于PKA的磷酸化。

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图5。

GST–14-3-3与合成肽相互作用的SPR分析，合成肽对应于LRRK2 S1444的新识别的14-3-3结合区域。通过生物素连接剂将60纳米摩尔的未磷酸化（S1444，灰线）或磷酸化（pS1444（黑线））的S1444肽固定到传感器表面，并在表面注入14-3-3（γ、θ或zeta，各1µM）。只有磷酸化肽与不同的14-3-3蛋白结合。与γ亚型相比，14-3-3θ和zeta的最大SPR信号减少，表明与pS1444的亲和力较低。

细胞培养与PKA的刺激在赛卢洛.

COS7细胞保存在DMEM中，在37°C和5%CO条件下使用10%（vol/vol）FCS（GE Healthcare）₂大气。在27°C恒温培养箱中，将Sf9细胞培养单层保存在补充了10%（vol/vol）FCS（GE Healthcare）的Insect-XPRESS培养基（Lonza）中。

在用50µM FSK（Sigma–Aldrich）和100µM IBMX（Sigma-Aldrich。LRRK2蛋白必须通过Strep-Tactin Superflow（IBA）进行富集。用1X PBS清洗COS7细胞一次，并在添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Roche）的冰镇裂解缓冲液[30 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.05%Nonide P-40]中进行裂解。如上所述制备Sf9昆虫细胞样品。将含有可溶性蛋白质的上清液与悬浮树脂涂敷在Mobicol柱（MoBiTec）上。用洗涤缓冲液[100 mM Tris（pH 8），150 mM NaCl，1 mM EDTA]洗涤三次后，将蛋白结合树脂重新悬浮在含有0.25 mM DTT（Roth）的30µL 4X NuPAGE样品缓冲液（Invitrogen）中，并通过95°C煮沸5分钟洗脱结合蛋白。蛋白质通过SDS/PAGE溶解，然后转移到PVDF膜（Roth）上。用磷酸特异性LRRK2抗体抗pS910和抗pS935（Biomol）免疫印迹法检测PBS或FSK/IBMX处理细胞中LRRK_2的磷酸化。两种抗体均在4°C下以1/10000的稀释度隔夜应用于20 mM Tris（pH7.5）、140 mM NaCl、0.05%吐温20（TBS-T）和5%（wt/vol）奶粉中。使用抗兔HRP二级抗体（GE Healthcare）和ECL化学发光（PerkinElmer）观察免疫复合物。

PKA检测和远西斑试验。

His-tagged ROC结构域作为PKA的体外底物进行测试。在不存在或存在人PKA催化亚基（Calpha1）（0.5 U/µL）或10µM假底物PKA抑制剂PKIα的情况下培养等量（每个约1µg）的纯化蛋白质(52)在激酶分析缓冲液中[25 mM Tris●HCl（pH 7.5），10 mM MgCl₂，2 mM DTT，0.1 mM Na_三VO（旁白）₄、5 mMβ-甘油磷酸和0.1 mM ATP]，包含2µCi[γ-³²P] -ATP在30°C下持续搅拌1小时。检测总体积为20µL。通过在95°C下用10µL含有0.25 mM DTT（Roth）的4X NuPAGE样品缓冲液（Invitrogen）煮沸2分钟来终止反应。随后，在4–12%梯度凝胶（Invitrogen）上分离产物；凝胶用考马斯亮蓝染色，干燥，并暴露于X射线胶片。将含有分离的ROC结构域的凝胶切片切下并转移到闪烁计数器中，并计算ROC中磷酸盐掺入的百分比。所有实验至少进行了三次。要比较的级别³²通过使用GraphPad Prism 5.0版（GraphPad-Software）进行单向方差分析和Tukey事后检验，确定P合并的统计显著性。

或者，通过MS或免疫印迹检测LRRK2内的PKA磷酸化。为了通过MS绘制LRRK2内的磷酸化位点，将400 nM纯化的LRRK1蛋白与40 nM PKA在30°C下孵育1 h。

对于Far-western分析，如上所述磷酸化2µg分离的ROC结构域。通过SDS/PAGE将反应产物分离并转移到PVDF膜上。将膜在室温下的TBS-T中的5%（wt/vol）奶粉中封闭1 h。然后，在4°C下与膜一起孵育0.1µM GST–14-3-3γ过夜，然后用TBS-T清洗，并在室温下用抗GST抗体（GenScript）在稀释度为1/3000的TBS-T中孵育1 h，孵育浓度为3%（wt/vol）奶粉。使用HRP-结合二级抗体和ECL化学发光（PerkinElmer）对条带进行可视化。为了确保蛋白质负载相等，在60°C的剥离缓冲液[25 mM甘氨酸（pH 2.2），1%十二烷基硫酸钠]中剥离膜15分钟，并在室温下用1/40000的抗-His抗体（GE Healthcare）在TBS-T中用5%（wt/vol）奶粉稀释1小时。

LRRK2激酶分析。

为了测定LRRK2激酶活性，进行了放射性和非放射性激酶分析。GST–moesin（500 ng，由Frank Gillardon，Boehringer Ingelheim，Biberach and der Riss，Germany善意提供）在65°C下变性10分钟，并用作纯化LRRK2（1µg）的底物。放射性激酶反应是通过在30°C的激酶缓冲液中培养两种蛋白1小时来进行的。反应产物通过放射自显影术进行可视化或如上所述进行量化。在非放射性激酶分析中，将1µg重组LRRK2与10µg GST–14-3-3γ和/或9 U PKA在30°C的激酶缓冲液中培养1 h。通过在95°C下煮沸2分钟，终止反应。使用抗pT2483抗体（Abcam）在5%（wt/vol）奶粉中稀释至1/2000，在4°C下过夜，通过Western blotting检测LRRK2活性。随后，用Amido Black对印迹膜进行染色。

GST下拉分析和多肽对沉淀的竞争。

根据供应商协议，将等摩尔量的GST或GST–14-3-3融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖4B珠（Macherey–Nagel）结合。然后，将40µL等分的共轭琼脂糖珠浆与1 mg Sf9细胞裂解液上清液在4°C下的裂解缓冲液[30 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.5%Nonide P-40]中培养4 h。随后，用洗涤缓冲液[30 mM Tris（pH 7.4），150 mM NaCl]将珠子洗涤三次，再悬浮在含有0.25 mM DTT（Roth）的30µL 4X NuPAGE样品缓冲液（Invitrogen）中，并通过95°C煮沸5分钟洗脱结合蛋白。

在竞争分析中，Sf9细胞裂解物在存在不同浓度的以下肽的情况下培养：LFNIKAR（右）AS公司S公司S公司P（P）非磷酸化或丝氨酸磷酸化形式的VILVGT。样品在NuPAGE 4–12%梯度凝胶（Invitrogen）上分离，下拉实验中LRRK2∆967的存在通过Western blotting和抗Strep-HRP结合物（IBA）在TBS-T中以2%（wt/vol）稀释100000进行分析室温下BSA 1小时。随后，用GST抗体（GenScript）或14-3-3（pan）抗体[细胞信号；稀释：在TBS-T中用5%（wt/vol）BSA稀释1/1000，在4°C下过夜]培养Western blot膜，以证明蛋白质负载量相等。

FP。

为了研究14-3-3亚型与LRRK2的结合，我们使用了直接FP分析。对于肽磷酸化，20 nM的荧光标记LRRK2肽[S-LRRK2-1444 LFNIKARASS公司SPVILVGT（S1444粗体和下划线），pS-LRRK2-1444 LFNIKARAS第页S公司LRRK2-R1441G利物浦SPVILVGTG公司ASSSPVILVGT和LRRK2-S1444A LFNICARASA类在20 mM 4-吗啉丙基磺酸（MOPS）（pH 7）、150 mM NaCl、0.05%（vol/vol）CHAPS、1 mM ATP和10 mM MgCl中加入或不加入500 nM PKA孵育SPVILVGT]₂在37°C下持续4小时。作为对照，在PKI（1µM）存在的情况下进行检测，PKI从大肠杆菌如Thomas等人(53). 对于FP测量，在384孔微量滴定板（OptiPlate，黑色；PerkinElmer）中，使用FusionTMα-FP板读取器在室温下以Ex485nm/Em 535nm将最终浓度为10nM的肽与2µM 14-3-3（γ、θ或ζ）在150mM NaCl、20mM MOPS、0.005%（vol/vol）CHAPS中混合2 s。使用GraphPad Prism 6.01（GraphPadSoftware）分析数据。每个图表中显示的数据是三次测量的平均值±SEM。

为了确定14-3-3亚型与磷酸化和非磷酸化荧光素标记LRRK2肽之间的亲和力，如上所述，将GST-14-3-3蛋白的浓度增加（从1 nM到100µM）与10 nM荧光标记LRRK1肽混合。每个图表中显示的数据是三次测量的平均值±SEM(n个=每个数据点3）。K（K）_d日通过绘制荧光偏振信号与14-3-3蛋白质浓度的对数，并拟合S形剂量-反应，用GraphPad Prism测定。

我们感谢Irmtraud Hammerl-Witzel、Melanie Spieker和Hannah Breitenstein提供的专家技术援助；Mira Sastri和Ralph Telgmann批判性阅读手稿；曼迪·迪斯卡对细胞培养的有益建议；以及Jörg D.Hoheisel对Affinomics项目的支持。这项工作得到了欧盟FP7卫生计划、241481 AFFINOMICS（致M.U.、F.W.H.和A.J.）的支持；联邦教育和研究部，基金编号：0316177F No Pain（致F.W.H.）；卡塞尔大学（K.M.）奥托-布朗基金会；国家基因组研究框架计划NGFN-Plus，基金编号：01GS08140/子项目12（提交M.U.）；和迈克尔·福克斯基金会（C.J.G.、M.U.和A.G.）。