介绍
流感病毒是流感的主要致病因子,是一种包膜的负义RNA病毒,含有三种病毒膜蛋白:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2质子通道。病毒包膜内包裹着一层基质蛋白(M1)和一个分段的基因组。八条单链RNA封装成病毒核糖核蛋白复合物(vRNPs),每一条都连接到具有三个亚基的RNA依赖性RNA聚合酶复合物上:PA、PB1和PB2[1].
作为一种仅编码13种病毒蛋白的强制性病原体,流感病毒必须依赖宿主蛋白和细胞机制来完成其感染周期。流感感染始于病毒与质膜上唾液酸的结合[2]病毒-受体相互作用随后通过多种内吞途径触发病毒进入,包括网格蛋白介导的内吞、网格蛋白/小窝蛋白诱导的依赖性途径和大胞吞[3]–[7]在内化后,病毒颗粒从早期的内胚体运输到成熟的内胚体内,病毒和内胚体膜之间的融合导致vRNP释放到细胞质中,随后vRNP进入细胞核[1],[8]–[10]随着复制的进行,病毒mRNA被输出到细胞核外进行蛋白质翻译,病毒成分被输送到质膜、病毒组装位置和子代病毒离子出口[11].
最近,一些全基因组siRNA筛选鉴定出流感病毒利用的宿主因子[12]–[16].CD81在两次筛选中均名列前茅,并被发现调节早期病毒进入步骤[15],[16]CD81属于四spanins家族,在血浆和内膜上都表达[17]–[19]它与其他四Spanin和四Spanin相互作用蛋白结合,形成富含四Spanin的微结构域[18],[20],[21]这些蛋白质共同调节许多细胞过程,如细胞粘附、细胞信号传导、细胞迁移和蛋白质运输[18],[19],[22]–[24]众所周知,四spanins在病毒感染的不同阶段发挥着重要作用[25]例如,CD81是丙型肝炎病毒(HCV)的共受体[26]–[29]CD81与HCV糖蛋白E2相互作用,启动病毒进入时的低H依赖性融合[26],[30],[31]除了介导病毒进入外,CD81还可能参与病毒组装。CD81是纯化流感病毒颗粒中的细胞衍生成分之一[32]然而,尚不清楚CD81如何促进流感病毒进入,或者CD81是否在流感病毒组装中发挥作用。
我们进行了一项从病毒进入到离开的综合研究,以检查CD81缺失对流感感染的影响。在剖析流感感染途径中的每个主要步骤后,我们发现CD81是生产性病毒感染所必需的,CD81主要在两个阶段发挥作用:病毒在内体内融合和病毒出芽。约一半融合在细胞内的流感病毒颗粒在CD81+内体内融合,CD81缺失导致病毒融合和感染减少。CD81在病毒出芽区高度富集,并被募集到特定的亚病毒位置。在病毒组装过程中,CD81首先在组装病毒的生长端形成小簇,然后定位于球形或稍长的病毒粒子的生长端和出芽颈部。CD81的缺失导致出芽病毒粒子附着在质膜上的倾向增加,并减少子代病毒的产生。这些发现证明了CD81在流感病毒进入和萌芽中的双重作用。
结果
CD81参与流感病毒感染的早期和晚期
为了阐明CD81在流感病毒感染中的作用,我们使用siRNA敲低CD81来探测对三种不同的甲型流感病毒株的影响:甲型流感/WSN/33(H1N1),一种主要产生球形病毒颗粒的实验室适应株;流感病毒A X-31,A/Aichi/68(H3N2),形状稍长[33]; 和流感A/Udorn/72(H3N2),可产生长丝状病毒[34]–[37]。我们筛选了6个CD81 siRNA结构体,包括几个先前报道的结构体[15],[16]发现CD81 siRNA 1具有最高的击倒效率(和图S1A,B)。48小时后,siRNA 1产生80–85%的CD81敲除(图S1C). 用siRNA 1特异性地去除CD81,而一些已知的CD81相关蛋白的表达水平,包括CD9、CD82、CD63、整合素β1(ITGB1)、EGFR和EWIF,没有受到影响(图S1D). 在随后的实验中,我们使用siRNA 1去除A549肺癌细胞中的CD81。
CD81参与流感病毒感染的早期和晚期。A) 用非靶向对照siRNA或CD81 siRNA1处理A549细胞48小时,并用抗CD81抗体进行免疫染色。图像是共焦z堆栈的最大投影。B) 用对照或CD81 siRNA处理A549细胞48小时。收集细胞,用所示抗体进行免疫印迹。Tubulin被用作负荷控制。C) CD81缺失会削弱流感病毒感染。用siRNAs或mock处理A549细胞48小时,然后以小于0.1的MOI感染X-31、WSN或Udorn 36小时。通过菌斑试验测定上清液中的病毒滴度。阴影条表示用不含siRNA的转染溶液处理的模拟细胞中测量的传染性;空心条表示在用对照、非靶向siRNA处理的细胞中测量的感染性;黑色实心条表示用CD81 siRNA处理过的细胞的传染性。D)表达病毒NP的受感染细胞的数量在CD81被击倒后减少了约50%。将经siRNA处理的A549细胞感染WSN、X-31或Udorn病毒,MOI小于0.1,持续8小时,不进行酸旁路,并通过流式细胞术测定表达NP的细胞比例。E) 当通过酸-旁路治疗消除进入缺陷诱导流感感染时,CD81敲除后病毒NP表达不受影响。将siRNA-处理的A549细胞与WSN或X-31病毒在冰上结合1小时,用温度低pH值的PBS缓冲液(pH 4.5)处理2分钟。8小时后,收集细胞并对其进行NP染色,以进行流式细胞术分析。F) 在感染流感病毒的CD81敲除细胞中,通过酸-旁路处理,上清液中的病毒滴度降低了~50%或更多。简单地说,病毒可以在冰上与对照细胞或CD81敲除细胞结合1小时。清洗未结合的病毒颗粒,加入低pH缓冲液2分钟,以触发病毒在质膜上的融合。感染后17小时,收集上清液,并通过菌斑试验测定病毒滴度。对于,误差条是从三个独立实验中得出的标准偏差。一个双尾学生t检验对所有数值数据执行,并显示数据的p值。p值小于0.05表示存在统计显著差异。
为了测定CD81耗竭对感染性病毒子代产生的影响,用WSN、X-31或Udorn病毒以<0.1的MOI感染siRNA处理的A549细胞36小时。使用菌斑试验测定上清液的病毒滴度。与非靶向对照siRNA处理细胞相比,CD81-敲除细胞的病毒滴度显著降低:WSN降低了~90%,X-31降低了~75%,Udorn降低了~70%(). 这些结果与之前公布的数据一致[15],[16],并表明多种不同的流感菌株需要CD81才能感染。
接下来,我们继续确定多步骤流感感染过程的哪个阶段依赖于CD81。为了测试CD81是否影响早期感染,我们感染了siRNA处理的A549细胞,并测量了NP的表达,NP是流感感染细胞中表达的第一种病毒蛋白[15],[16],[38]我们使用流式细胞术分析了表达NP(NP+)的细胞比例以及每个NP+细胞中NP的表达水平。与非靶向siRNA处理的对照细胞相比,对于所有三种病毒株,CD81-敲除细胞的NP+细胞减少了约50%(). 在NP+细胞中,对照细胞和CD81敲除细胞的NP表达水平相似(数据未显示)。这些结果表明,CD81在病毒蛋白表达的步骤或之前参与早期感染。
为了测试CD81是否直接影响病毒蛋白的表达,我们接下来通过酸-旁路处理在质膜上诱导病毒融合(脱膜):用pH值低于5的缓冲液进行处理,pH值是HA诱导膜融合所需的pH值。然后我们探讨了NP在这些样本中的表达。通过酸-旁路处理,感染病毒的对照细胞和CD81-敲除细胞的NP+细胞比例和NP表达水平相似(和数据未显示)。这些结果表明,CD81并不直接参与病毒蛋白的表达,CD81敲除对病毒感染的抑制很可能是由于抑制了病毒在内体中的脱包衣或脱包衣前的任何步骤。值得注意的是,这种酸-旁路检测克服了WSN和X-31菌株的进入缺陷,但类似的酸旁路处理对Udorn菌株不起作用,可能是因为低pH值导致丝状流感病毒破碎[7].
为了探讨CD81是否在病毒脱膜之外发挥其他作用,我们使用酸-过流处理在质膜上诱导流感病毒融合,以克服进入缺陷,并在感染后17小时测定上清液的病毒滴度。值得注意的是,与对照siRNA处理的细胞相比,CD81敲除细胞中的病毒滴度降低了50%以上(). 这种缺陷并不是由于病毒基因表达减少所致,因为病毒蛋白表达细胞的百分比和感染后17小时的表达水平在CD81敲除后不受影响(和后面显示的数据)。这些结果表明CD81影响病毒后基因表达的另一个步骤。
总之,上述结果表明,CD81对流感感染周期的两个不同阶段很重要:一个是在病毒脱壳时或之前的早期感染期间,另一个是在病毒基因表达后的晚期感染期间。在以下实验中,我们旨在确定CD81在流感病毒感染中的特定作用。
CD81不参与病毒结合、内化或运输到早期内体
为了确定CD81依赖性进入步骤,我们进行了一系列实验,以检查CD81对病毒结合、内化、转运到早期内体和融合的影响。siRNA处理的A549细胞首先与荧光标记的X-31病毒在4°C下孵育30分钟,该温度抑制内吞作用。通过流式细胞术分析表面结合病毒的数量。与非靶向siRNA处理的对照细胞相比,CD81-敲除细胞在与流感病毒结合方面没有缺陷(). 接下来,让流感病毒在37°C下感染30分钟,并量化内化病毒颗粒的数量。如所示,每个细胞内化病毒的数量在对照细胞和CD81敲除细胞之间相似。此外,在37°C内化后,对照细胞和CD81敲除细胞中的病毒颗粒被送入早期内体。在感染后20分钟,对照细胞和CD81敲除细胞与早期内体共定位的病毒颗粒平均分数(以EEA1标记)分别为~50%和~53%(). 这些结果表明,CD81不影响流感病毒向早期内体的运输。
CD81不需要用于病毒结合、内化或传递到早期内体。A) 流式细胞术检测到CD81-敲除不影响病毒结合。紫红色、蓝色和橙色曲线分别对应于未添加病毒的细胞、流感病毒结合后的对照细胞和流感病毒结合之后的CD81-击倒细胞的强度曲线。B) 内化的病毒颗粒的数量不受CD81敲低的影响。内化病毒颗粒的数量以点图显示,中线代表平均值,顶/底线代表标准偏差。对每种情况下随机选择的至少40个细胞进行分析。C) 与早期内体共定位的病毒颗粒百分比不受CD81敲除的影响。早期内体用抗EEA1抗体进行免疫染色。数据绘制与(B)类似。对每种情况下随机选择的至少40个细胞进行分析。D) CD81缺失不会影响RSV或假型MLV感染。将siRNA处理的A549细胞感染不同剂量的RSV和伪型MLV病毒24小时。对于RSV病毒感染,用流式细胞术定量RSV融合蛋白的表达,而对于伪型MLV病毒,分析GFP信号。一个双尾学生t检验对所有数值数据执行,并显示数据的p值。
此外,我们测试了CD81缺失对另外两种病毒的影响:呼吸道合胞病毒(RSV)和GFP编码的伪型小鼠白血病病毒(MLV),已知这两种病毒在早期内体中以pH非依赖性方式进行病毒融合[39],[40].假型MLV感染细胞表达GFP,但不能产生完整的病毒,因此可以通过测量GFP的表达来量化MLV的进入。对于RSV,我们在感染24小时后测量融合蛋白(F蛋白)的表达水平。如所示感染MLV和RSV的对照细胞和CD81敲除细胞的感染细胞比例相似。这些数据进一步证实了CD81不影响病毒进入早期内体的概念。
综上所述,上述结果表明CD81不参与流感病毒的结合、内化或运输到早期内体。
流感病毒颗粒被输送到CD81+内体并在其中融合
接下来,我们探讨了CD81在病毒融合中的作用。流感病毒从早期的内体运输到成熟的内体,其中低pH环境触发HA构象变化,介导病毒与内体膜融合[2],[9],[41]除了分布在质膜上,CD81还显示出与Rab5阳性的早期和成熟内体(Rab5+)的实质性共定位()[41]约30–35%的Rab5+内体含有CD81()表明CD81在这些内体的亚群中富集。为了探究流感病毒颗粒是否被传递到CD81+内体,我们让Alexa Fluor 647-标记的X-31内化15分钟,并对细胞进行CD81免疫染色。如所示,相当一部分(~54%)的病毒与CD81+内体共定位。
大部分病毒被输送到CD81阳性内体并在其中融合。A) CD81基本上与Rab5共定位。用CD81-mEmerald和RFP-Rab5电穿孔A549细胞。24小时后,将细胞固定并成像。方框区域的放大图像显示在右侧。比例尺:10µm。B) 流感病毒颗粒进入CD81+内体。A549细胞与Alexa Fluor 647标记的X-31病毒(红色)在冰上冷结合30分钟,然后在37°C下追逐15分钟。将样品固定并对CD81(绿色)进行免疫染色。方框区域的放大图像显示在右侧。所有的图像都是共焦XY横截面。比例尺:10µm。C) 流感病毒颗粒进入CD81阳性内体后融合。添加了DiD-标记X-31的活细胞共焦成像就地将CD81-mEmearld表达的A549细胞维持在37°C。以0.5秒的间隔收集图像。C-1)在不同时间点拍摄的多张快照,白色圆圈表示病毒。C-2)所示DiD标记病毒的荧光信号随时间的变化。注意,在515秒时DiD信号突然增加,这表明病毒融合事件。D) 流感病毒也可以在CD81阴性内体中融合。D-1)在不同时间点拍摄的多张快照,白色圆圈表示病毒。D-2)所示DiD标记病毒的荧光信号随时间的变化。病毒颗粒在422秒融合。E)在从结合到融合的61个病毒颗粒中,52±8%进入CD81+内体并融合,而其余48±8%在CD81-内体融合。四个独立实验的结果表明,±误差表示这些实验得出的标准偏差。F) CD81缺失后,病毒融合受损。DiD-标记的X-31被允许在冰上与A549细胞结合30分钟,然后在37°C下追逐指定的时间。细胞立即胰酶化固定,流式细胞仪分析。绘制了DiD强度相对于初始DiD强度的增加。误差线是由重复实验得出的标准偏差。
然后,我们追踪活细胞中的单个流感病毒颗粒,这是一项以前建立的技术[5],[10],[41]–[43],以检查流感病毒是否在CD81+内体中融合。为此,我们在A549细胞中表达CD81-mEmerald。与内源性CD81类似,CD81mEmerald定位于质膜和内涵体膜上(图S2A)CD81-mEmerald的表达并不影响CD81+内体的比例(图S2B–D)。此外,CD81的表达也不影响流感病毒的融合或传染性(图S2E,F)。
为了便于追踪单个病毒颗粒,X-31病毒被标记为饱和量的DiD,这是一种亲脂性染料,由于相邻染料之间的自猝灭效应,DiD分子的荧光发射较低。病毒包膜和内胚体膜之间的融合应导致荧光强度增加(去猝灭),因为病毒的染料扩散到内胚体的脂质双层中[42]。我们将标记的病毒添加到CD81-mEmerald表达细胞中就地37°C时。病毒颗粒通常在与细胞结合后立即表现出运动受限,然后在病毒颗粒内化后迅速定向运动,这与我们之前的观察结果类似[5],[41],[42]我们观察到一部分病毒颗粒在内化后很快进入CD81+内体,如和电影S1这些病毒与CD81保持共定位,并最终与CD81+内体融合,正如DiD荧光突然增加所反映的那样,推测是在内体成熟后获得足够低的pH值(和电影S1). 在我们追踪的从结合到融合的61个病毒颗粒中,约52±8%的病毒颗粒在CD81+内体内进行了融合(). 其余48±8%的病毒颗粒融合在缺乏CD81的内体中(、和电影S2). 为了证实融合事件确实发生在内体中,我们追踪了表达RFP-Rab5的细胞中的单个DiD标记流感病毒颗粒。与之前的观察结果类似[41],近90%的病毒融合事件发生在Rab5+内体中(图S3).
为了研究CD81是否影响病毒融合,我们接下来监测了感染DiD标记的X-31病毒的对照细胞和CD81敲除细胞的DiD荧光强度。在这些实验中,细胞首先在4°C下与DiD标记的病毒孵育,然后将温度升高到37°C以启动病毒进入。在温度变化后的特定时间点,收集感染细胞,并用流式细胞仪对这些细胞的DiD荧光进行定量。正如预期的那样,由于病毒融合,DiD荧光随时间持续增加(). 值得注意的是,与对照细胞相比,CD81敲除细胞在病毒融合中表现出显著降低()表明CD81促进病毒融合。CD81敲除细胞中剩余的大多数病毒融合事件仍发生在Rab5+内体中(图S3). 然而,病毒融合的减少是不完整的()与只有约一半的病毒颗粒在CD81+内体中融合的观察结果一致()虽然病毒融合的不完全抑制也可能部分归因于CD81的不完全敲除(图S1).
这些数据表明,CD81标记了Rab5+内体的特定群体,这些内体负责一半的病毒融合事件。因为CD81-敲除细胞减少了病毒感染()与酸旁路感染相比,未经酸旁路感染时病毒滴度降低更高()CD81+内体内的病毒融合可能导致生产性流感感染。
综上所述,我们的结果表明,一半的病毒颗粒被输送到CD81+内体并在其中进行病毒融合。CD81可以通过组织内体膜来帮助病毒融合或帮助病毒运输到融合活性内体隔室,从而促进病毒融合。
CD81不参与病毒蛋白的表达或运输
在随后的实验中,我们旨在确定病毒感染过程的哪些进入后步骤是CD81依赖性的。为此,我们研究了CD81对病毒蛋白表达、病毒蛋白运输以及子代病毒的组装和流出的影响。我们在以下方面的初步结果提示CD81敲除并不直接影响病毒NP的表达。通过使用酸-过流治疗,在不同时间点用不同病毒剂量感染细胞,进一步证实了这一点。如所示NP+细胞比例和NP表达水平随病毒剂量和感染时间的增加而增加,而对照组和CD81-敲除细胞之间无显著差异。为了进一步验证这一发现,我们测量了另一种细胞溶质病毒蛋白M1的表达。与NP的结果类似,与对照细胞相比,使用酸-旁路疗法感染流感病毒的CD81敲除细胞的M1+细胞比例或M1蛋白表达水平没有差异(). 这些数据表明CD81在细胞溶质病毒蛋白的病毒基因表达中不起作用。
CD81缺失不会影响病毒蛋白的表达和转运。A) CD81敲低不影响用酸旁路处理感染流感病毒的细胞中病毒NP蛋白的表达。除了在感染后的不同时间点和不同剂量的病毒下评估表达水平外,实验的执行与1E)中的相似。绘制了NP+细胞中NP表达细胞的百分比和NP表达水平。B) CD81敲除不影响经酸-旁路治疗的流感病毒感染细胞中病毒M1蛋白的表达。除了对细胞进行M1免疫染色外,实验的执行与(A)中的相似。绘制了M1+细胞的百分比和M1+细胞中的M1表达水平。C) CD81敲除不影响经酸-旁路治疗的流感病毒感染细胞中病毒M2蛋白的表达。除了对细胞进行M2免疫染色外,实验的执行与(A)中的相似。绘制M2+细胞的百分比和M2+细胞中的M2表达水平。D) CD81敲除不会影响通过酸-旁路治疗感染流感病毒的细胞中被输送到细胞表面的M2蛋白的数量。实验与(C)中的相似,只是细胞被染色为M2而没有渗透。绘制M2+细胞百分比和M2+细胞表面M2表达水平。E) CD81敲除不会影响通过酸-旁路治疗感染流感病毒的细胞中运输到细胞表面的NA蛋白数量。通过共焦图像评估X-31病毒感染的对照细胞或CD81 siRNA处理细胞的NA表达水平。一个双尾学生t检验对所有数值数据执行,并显示数据的p值。
为了确定CD81是否影响病毒膜蛋白的表达,我们通过酸旁路处理检测M2的表达。对照组和CD81敲除细胞中M2+细胞的比例和M2+细胞中M2的表达水平相似(). 此外,通过仅探测表面M2蛋白而不渗透细胞,我们发现表面M2蛋白质表达水平也没有差异()表明CD81敲除也不影响M2向细胞表面的转运。同样,另一种病毒膜蛋白NA的表达和运输也不受CD81缺失的影响().
综上所述,这些数据表明CD81在流感病毒蛋白的表达或流感膜蛋白向质膜的转运中没有直接作用。
CD81被招募到流感病毒质膜上的出芽部位
接下来,我们探讨了CD81在病毒组装中的作用。为了检测CD81是否存在于病毒组装部位,A549细胞被三种流感菌株感染,并对CD81和病毒蛋白进行免疫染色。值得注意的是,X-31感染时,CD81主要定位于多个病毒蛋白集中的部位(和S4A系列,B)。与CD81在质膜上均匀分布的未感染细胞相比,X-31感染细胞表现出CD81在浓缩斑块中的显著再分配。我们可以获得特异性免疫荧光染色的所有X-31蛋白,包括PB1、NA和M2,都存在于这些斑块中。非渗透性细胞的免疫荧光证实,CD81斑块在质膜上形成(图S4B). 我们注意到,病毒感染后CD81表达仅略有下降(图S5A,B)。对于Udorn-感染细胞,CD81沿着PB1标记的出芽病毒丝富集(). PB1是一个很好的丝状病毒标志物,在出芽丝状病毒中与Udorn HA和M2共定位(图S4C,D)。我们还直接观察到CD81和其他乌多恩蛋白之间的共定位,包括HA、NA和抗乌多恩血清(图S4E–G)。值得注意的是,在siRNA处理后,耗尽了80~85%的内源性CD81,剩余的CD81全部集中在出芽的病毒丝中,而细胞体几乎没有CD81信号(和S4H系列). 与对照细胞相比,CD81敲低细胞中每个病毒丝的平均CD81量减少了60%以上。虽然我们缺乏WSN抗体,因此很难对WSN感染的细胞进行类似的免疫荧光实验,但我们用免疫金标记CD81的EM图像显示,CD81也被招募到WSN病毒的萌芽区(图S6A). 综上所述,这些结果表明CD81被特异性地招募到流感病毒的组装和出芽位点。
CD81被招募到病毒萌芽站点。A) CD81被招募到X-31感染细胞的病毒萌芽区。用X-31感染A549细胞16小时。细胞用抗CD81抗体(绿色)和抗PB1抗体(红色)染色。图像是共焦XY横截面。比例尺:10µm。B) CD81被纳入Udorn感染细胞的出芽丝状病毒中。用Udorn病毒感染A549细胞16小时,并用抗CD81抗体和抗PB1抗体进行染色。比例尺:10µm。C) CD81敲除细胞中剩余的CD81被并入Udorn感染细胞的出芽丝状病毒中。与(B)类似,只是使用了CD81敲除细胞。根据100多个细胞的共焦图像计算Udorn-感染细胞中CD81的表达水平,发现与对照细胞相比,CD81缺失后CD81表达水平降低了约88%。与未经处理的细胞相比,每个病毒丝的CD81数量减少了63%。比例尺:10µm。
为了探究哪种病毒成分可能负责招募CD81,我们转向了一种基于质粒的系统,该系统只在细胞中表达特定的病毒包膜蛋白[44]我们将含有HA或NA的质粒瞬时转染到A549细胞中,并用CD81和HA或NA对细胞进行免疫染色。有趣的是,HA即使在A549细胞内单独表达也会在细胞表面形成簇,CD81在HA簇中大量积累(图S7A). 约46%的HA簇与CD81共定位。相反,当单独表达时,NA不形成簇,而是在质膜上基本均匀地分布,并且CD81分布和NA分布之间没有明显的相关性(图S7C). 用不含HA或NA的质粒进行模拟转染,未产生任何明显的HA或NA染色(图S7B,D)。这些结果表明HA可能负责将CD81招募到病毒萌芽位点。
CD81在特定的亚病毒位置结合,促进流感病毒的萌芽
尽管我们观察到,经过酸-旁路处理以克服CD81依赖性进入缺陷后,CD81敲除细胞中的病毒滴度下降了约50%或更多()目前尚不清楚病毒滴度的缺陷是否源于细胞上聚集的出芽病毒数、细胞释放的子代病毒颗粒数或每个释放病毒颗粒的特定传染性的减少。为了区分这些可能性,我们首先使用酸-旁路处理感染细胞,然后使用透射电子显微镜定量细胞上附着的萌芽病毒的数量。在对每个条件下超过250个细胞横截面进行量化后,我们进行了统计分析,发现对照组与CD81敲除细胞中每个细胞横截面上聚集病毒颗粒的数量没有统计上的显著差异().
CD81在出芽病毒粒子的特定亚病毒位点富集,并且CD81敲低会削弱病毒的分裂。A) CD81基因敲除不会改变附着在感染细胞上的出芽病毒的数量。将siRNA处理的细胞感染WSN病毒,并进行15小时的酸化处理。细胞直接固定用于透射电子显微镜,每个细胞横截面上出芽病毒粒子的数量被量化为250多个截面,并显示在点图中。一个双尾学生t检验执行,并提供p值。B) CD81敲除导致释放的病毒颗粒数量大幅减少。将siRNA处理的细胞感染WSN病毒,并进行17小时的酸化处理。用ELISA法检测上清液中病毒M1蛋白的含量。用免疫荧光成像法计数上清液中M1阳性和HA阳性病毒颗粒的数量。误差线是三个独立测量值的标准偏差。C) CD81定位于生长中的X-31病毒在早期萌芽阶段的尖端。细胞被X-31感染12小时,CD81被免疫金标记用于电子显微镜。白框中区域的放大图像显示在右上角。比例尺:100 nm。D) CD81主要定位于X-31病毒出芽后期的尖端和出芽颈部。与(C)相似,但感染时间为16小时。比例尺:200 nm。E) 感染后16小时含金颗粒在出芽X-31病毒中的分布。为了对齐病毒粒子,每个病毒的长度被规范化为1,其中点被指定为坐标值0。对于萌芽病毒上的单个金粒子,它们的坐标值是根据它们到中点的相对距离计算的。负值坐标对应于靠近质膜的位置。共分析了105种萌芽病毒。F) 在对照siRNA处理的细胞中,新生WSN病毒呈球形,膜被完全封闭。将病毒感染A549细胞并进行酸-旁路处理13小时。白色框中的区域被放大并显示在右上角。比例尺:200纳米。G) 新生WSN病毒在CD81 siRNA处理的A549细胞中更为伸长。很大一部分出芽病毒具有与质膜相连的开放膜颈(箭头所示)。白色框中的区域被放大并显示在右上角。比例尺:200 nm。H) 出芽WSN病毒在CD81缺失时被拉长,如对照细胞或CD81敲除细胞中出芽病毒长度的分布所示。
接下来,我们使用酸旁路处理将WSN感染细胞,收集上清液中的病毒颗粒,然后使用ELISA分析定量病毒基质蛋白M1的数量,并使用成像分析定量M1和HA阳性的释放病毒颗粒的数量(). 值得注意的是,与经非靶向siRNA处理的对照细胞相比,CD81敲除细胞的病毒M1数量以及释放到上清液中的M1+和HA+病毒颗粒数量均减少了50%或更多。这些结果表明,CD81敲低诱导的受酸-旁路治疗感染的细胞中病毒滴度的降低源于病毒释放的缺陷。考虑到病毒滴度的降低()类似于释放的病毒蛋白或病毒颗粒数量的减少(),我们没有进一步探究每个病毒颗粒的特异性传染性的变化。
为了研究CD81如何促进子代病毒颗粒的释放,我们接下来使用免疫金电子显微镜研究了CD81在单个萌芽病毒中的分布。在X-31感染的细胞中,CD81很容易在出芽病毒中观察到(). 在早期组装阶段,CD81簇位于萌芽病毒的生长端(). 有趣的是,当病毒生长成成熟的、稍微细长的形状时[33],CD81不仅出现在生长尖端,也出现在正在萌芽的病毒的颈部(). X-31的细长形态使我们能够通过对齐病毒颗粒的长轴并将免疫金标CD81的位置归一化为病毒的总长度来定量分析CD81在病毒中的分布。值得注意的是,CD81在出芽病毒的两端高度富集().
同样,我们还发现CD81在WSN病毒的萌芽颗粒中富集,但每个WSN病毒检测到的免疫金数量大大低于X-31病毒,这使得很难确定CD81在这些病毒中的分布(图S6A). 然而,WSN病毒近乎完美的球形形状使我们能够检测到CD81击倒细胞中萌芽病毒的一个有趣的形态缺陷。当我们检查受WSN感染的细胞中的出芽病毒时,我们发现大多数出芽WSN病毒是球形的,并且在用非靶向siRNA处理的对照细胞中完全被病毒包膜包围(). 与此形成鲜明对比的是,在CD81敲除细胞中的WSN病毒萌芽似乎要长得多(). 对照细胞和CD81敲除细胞中出芽病毒的平均长度分别为~100 nm和~150 nm(). 此外,CD81敲除细胞中的许多出芽病毒没有完全封闭的外壳,而是通过开放的膜颈(如图中箭头所示)附着在质膜上). 我们对X-31菌株进行了类似的实验。同样,我们在CD81缺失时观察到许多处于萌芽状态的X-31病毒,并伴有开放性萌芽颈部缺陷(图S6B,C),尽管由于多形性X-31的病毒粒子长度变化较大,很难确定出芽病毒粒子是否进一步拉长。
综上所述,CD81在出芽病毒颈部的特异性富集,CD81敲除细胞出芽颈部闭合的缺陷,以及CD81击倒后释放的病毒颗粒数量减少,但组装病毒的数量没有减少,表明CD81在病毒出芽过程的后期起作用,可能是在最后一步。CD81可通过直接参与断开过程,通过招募宿主或病毒断开蛋白,或通过组织脂质结构域,使其有利于病毒断开,从而促进病毒断开。
CD81在出芽丝状Udorn病毒中的分布
与WSN和X-31毒株不同,乌多恩病毒感染通常会产生2至20µm长的细丝[11],[35],[45],[46]我们用电子显微镜观察了被Udorn病毒感染的A549细胞中免疫金标CD81的分布,并在出芽的病毒丝中观察到CD81簇。值得注意的是,CD81似乎沿整个Udorn灯丝分布().
CD81沿着出芽丝状Udorn病毒分散分布。A) CD81沿着Udorn病毒出芽的丝状体定位。A549细胞被Udorn病毒感染18小时,CD81被免疫金标记用于电子显微镜。这里显示的是从细胞中出芽的一束病毒丝(为了放大病毒丝,未显示细胞)。比例尺:200 nm。B) CD81和病毒PB1蛋白似乎沿丝状Udorn病毒呈交替分布。A549细胞感染Udorn病毒16小时,并用抗CD81(绿色)和抗PB1(红色)抗体进行免疫染色。用Alexa Fluor 405/Alexa Fluor 647缀合的第二抗体进一步探测CD81,而用Atto 488缀合的抗体标记PB1用于双色3D STORM成像。B-1)和B-2)中显示了两种丝状病毒。左:xy投影图像。中)xz投影图像。右)CD81和PB1沿灯丝长轴的局部分布。比例尺:500 nm。
作为一种替代方法,我们使用了超分辨率荧光成像技术,随机光学重建显微镜(STORM),来测量CD81在出芽丝上的分布。STORM通过高精度连续激活、成像和定位单个荧光光开关分子来克服光学显微镜的衍射极限,从而以纳米级分辨率从分子定位重建图像[47],[48]在这里,我们使用了单目标检测几何结构和可光控Alexa Fluor 647和Atto 488染料,以获得20–30 nm的横向分辨率和50–100 nm的轴向分辨率[48],[49]为了可视化CD81在丝状乌冬中的定位,我们对CD81和病毒PB1进行了免疫染色,并进行了双色3D STORM成像。与电子显微镜的结果一致(),我们发现CD81形成了均匀分布在整个灯丝上的小簇(). 相邻的CD81簇通常相隔约150~200 nm。奇怪的是,CD81似乎在病毒PB1蛋白簇之间富集(),但这种交替模式的意义尚不清楚。
讨论
CD81是一种细胞四spannin蛋白,对流感病毒感染至关重要[15],[16]当细胞CD81耗尽时,各种流感病毒株的传染性受到强烈抑制(). 在这项工作中,我们分析了CD81在病毒从进入到离开的感染途径的各个步骤中的作用。我们发现CD81在病毒感染的两个独立步骤中发挥作用:病毒融合和病毒出芽。
CD81在病毒进入中的作用
CD81在流感病毒进入过程中的特定作用是通过一系列独立的分析确定的。首先,siRNA敲低CD81导致表达病毒蛋白的感染细胞百分比下降约50%。这种缺陷并不是由于CD81对病毒蛋白表达的直接调节,因为当通过酸-旁路治疗诱导流感感染时,CD81敲除后病毒蛋白表达保持不变(和). 这些结果表明,CD81在病毒基因表达之前介导流感病毒进入。其次,CD81敲除并不影响病毒结合、内化或转运到早期内体()但导致病毒融合的重大缺陷(). 此外,单病毒追踪实验表明,一半内化的病毒颗粒被转运到CD81阳性内体中,并在这些内体中进行病毒融合,而另一半融合到CD81阴性内体中(). 值得注意的是,CD81阳性内体中发生的病毒融合事件的比例与CD81耗竭后表达病毒蛋白的受感染细胞百分数减少50%密切相关,这表明CD81在生产性病毒脱外壳中发挥了作用。总之,这些结果表明CD81在流感病毒融合中发挥作用。CD81标志着生产性病毒脱外壳过程的内体途径,尽管也存在平行的CD81依赖途径。
有趣的是,CD81在流感病毒进入中的作用似乎与之前在HCV和HIV进入中观察到的CD81的作用不同。CD81作为HCV的重要共受体,对HCV的内吞作用具有重要意义[27],[28],[50],[51]此外,CD81与HCV糖蛋白E2相互作用,并有助于启动其融合活性以进行低H依赖性病毒融合[26],[30]此外,CD81负调控HIV细胞融合[52]CD81和CD81相关四spanins的结合抑制HIV介导的细胞融合过程[52],[53]另一方面,CD81不太可能作为流感病毒的共受体或附着因子发挥作用,因为流感病毒内化到细胞中并不需要CD81。流感病毒融合也不需要CD81启动,因为酸处理足以触发CD81缺失细胞质膜上的病毒脱膜。相反,我们的结果表明CD81在促进流感病毒在内胚层融合中发挥作用。假设CD81和CD81相关蛋白可以组织膜结构域[17]–[20],CD81可能有助于组织内体膜以辅助流感病毒融合。或者,CD81可能在将流感输送到融合活性内体隔室中发挥作用。CD81在多泡体(MVB)中高度富集,多泡体是晚期内体和溶酶体成熟途径上的中间内体细胞器[54]CD81缺失可能会抑制内体的成熟,从而破坏流感病毒与内体的融合。
CD81在病毒组装中的作用
除了在病毒解开中的作用外,CD81在病毒融合后流感感染的后期也发挥着功能性作用。融合后阶段对CD81的需求很明显,这一发现表明,CD81缺失导致病毒滴度显著降低,即使使用酸-旁路处理诱导病毒在质膜上脱膜,从而消除进入缺陷(). 减少并非由于病毒蛋白表达缺陷或病毒蛋白向质膜转运所致(),表明扰动可能发生在病毒组装阶段。此外,CD81敲除后,附着在每个受感染细胞上的出芽病毒的平均数量没有改变,而释放到上清液中的病毒颗粒数量显著减少(). 这些结果进一步将CD81的参与范围缩小到萌芽过程的相对较晚阶段,很可能是将病毒颗粒与宿主细胞分离的断裂步骤。为了支持这一观点,CD81被专门招募到病毒萌芽站点()在病毒蛋白中,HA可能对将CD81招募到病毒萌芽部位很重要(图S7). 有趣的是,CD81在球形和略微拉长的病毒的尖端和出芽颈部特异性富集(). CD81敲除后,出芽球状病毒在形态上表现出一致的变化:出芽病毒与对照细胞中的对应病毒相比明显伸长,未能从质膜上分离。许多萌芽病毒的萌芽颈部没有闭合,这表明最后的分离过程中存在缺陷(). 综上所述,我们的观察结果表明CD81在剪断过程中发挥了作用,剪断过程将萌芽病毒从质膜上分离出来。CD81可能直接参与裂解过程,为此目的招募其他宿主或病毒裂解蛋白,或在萌芽部位组织膜结构域,使其有利于病毒裂解。
比较CD81与其他病毒在流感病毒组装中的作用是很有趣的。先前的研究表明,HIV包膜蛋白与一些四spanins相关,包括CD81,并且HIV芽来自富含四spanin的微结构域[55]–[57]然而,CD81在HIV传播中的确切作用尚不清楚[53],[58]–[61]一项研究报告称,CD81缺失或使用抗CD81抗体治疗后,HIV感染显著受损[61],而另外两篇论文报道,四spanins的耗竭不会影响HIV释放的效率,而四spanin的过度表达会降低释放病毒的感染性[53],[59]四spanins也被提议用于促进HTLV-1感染的细胞间传播[25]CD81在流感病毒排出中的作用似乎与先前报道的四Spanins在HIV和HTLV-1感染中的作用不同,因为CD81正调节病毒分裂。
此前已有研究表明,流感病毒的裂解依赖于病毒M2蛋白[62]在病毒出芽过程中,M2定位于出芽病毒的颈部,其C末端的两亲性尾突变导致病毒出芽的明显缺陷[62]有趣的是,已知M2位于脂筏和非脂筏区域之间的界面,而CD81被划分为富含四spanin的微域,这是一个类似脂筏的平台[18]因此,CD81有可能促进M2向病毒的萌芽颈部募集。未来对CD81和M2在病毒裂解过程中相互作用的研究将有助于进一步阐明CD81的机制作用。CD81与四联蛋白和其他四联蛋白相互作用蛋白结合,在细胞膜上形成富含四联蛋白的微结构域[18],[20]CD9是一种与CD81相互作用的四spanin,先前在纯化的病毒颗粒中发现[32]。我们的初步结果显示,其他tetraspanin家族蛋白也合并到出芽病毒中(数据未显示)。富含四spanin的微结构域中的不同组分是否以及如何相互合作以促进流感病毒的萌芽仍然是一个值得未来研究的有趣问题。
材料和方法
细胞培养、病毒和试剂
A549肺癌细胞(ATCC)在含有10%胎牛血清(serum International)和抗生素(ATCC;25U/ml青霉素和25µg/ml链霉素)的高糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM;Invitrogen)中培养,并保持在湿润的5%CO中2环境温度为37°C。对于siRNA敲除实验,使用Amaxa Lonza Nucleofector的X-001程序和Kit-T(Lonza,VVCA-1002)用100 pmol siRNA构建物电穿孔A549细胞。电穿孔后48小时进行实验。siGENOME非靶向siRNA#1(Thermo Scientific)被用作对照siRNA。六个CD81 siRNA构建物的设计序列如下:CD81 siRNA1:中央空调机组(Thermo Scientific);CD81 siRNA 2:AAGGA ACAUC AGGCA UGCUA A dTdT公司(Thermo Scientific);CD81 siRNA 3:GGAAC AUCAG GCAUG CUAATT公司(齐阿根);CD81 siRNA 4:CCUUC UAUGU AGGCA UCUATT公司(齐阿根);CD81 siRNA 5:GCCCA ACACC UUCUA UGUATT公司(琥珀色);CD81 siRNA 6:CCACC UCAGU GCUCA阿加特(Ambion)。注意,CD81 siRNA 1和CD81 siRNA2之前已经证实不会引起干扰素诱导的反应[16]对于质粒表达,使用类似的程序电穿孔2µg质粒。本研究中使用了以下质粒:CD81-mEmerald(人四spanin CD81被克隆到mEmerald的C末端,在mEmerald-CD81之间有一个10氨基酸连接子)、RFP-Rab5(Ari Helenius教授馈赠,Addgene,14437[63]),EYFP-Rab7[41])、pCAGGS-HA/Ud和pCAGGCS-NA/Ud(佛罗里达州斯克里普斯研究所迈克尔·法赞教授的礼物)。
本研究使用了以下病毒:流感病毒X-31购自Charles River实验室;WSN和Udorn病毒株是Robert Lamb教授(伊利诺伊州埃文斯顿西北大学)赠送的礼物。呼吸道合胞病毒购自Virapur。伪型MLV病毒是Nir Hacohen教授(马萨诸塞州剑桥市布罗德研究所)赠送的礼物。
本研究中使用了以下主要抗体:小鼠抗CD81抗体(BD Biosciences,555675)、FITC-结合抗CD81抗原(BD Bioscience,551108)、小鼠抗EEA1(BD Biosciences,610457)、兔抗EEA1抗体(Cell signaling,3288s)、兔抗CD82抗体(Santa Cruz,c-16,SC-1087)、鼠抗CD63抗体(Abcam,ab8219)、,兔抗EWIF(Fitzgerald,70R-13159)、鼠抗ITGB1(Millipore,MAB2253)、鼠反管蛋白(Sigma,T5076)、鼠抗EGFR(BD bioscience,610016)、兔抗肌动蛋白(Abcam,ab8227)、兔抗CD9(Santa Cruz,H-110,sc-9148)、羊抗Udorn血清(由Robert Lamb教授(伊利诺伊州埃文斯顿西北大学)赠送)、,小鼠抗M1抗体(AbD Serotec,MCA401)、山羊抗M1抗原(Abcam,ab20910)、小鼠抗流感病毒M2抗体[14C2](Abcam,ab5416)、小鼠抗流感病毒NP抗体[AA5H](Abcam,ab20343)、鼠鼠抗Alexa Fluor 647(Sigma,C1117)、鼠抗RSV融合蛋白(AbD sertec,MCA490)、,山羊抗流感病毒PB1抗体(Santa Cruz,vK-20),小鼠抗流感病毒HA抗体(Lifespan,LS-{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“C58889”,“term_id”:“2417594”}}C58889元),兔抗流感病毒NA(Gillian Air教授(俄克拉何马州俄克拉荷马大学)赠送)。
以下二级抗体用于常规光学显微镜或免疫金电子显微镜的免疫荧光:Alexa Fluor 647驴抗小鼠(Jackson ImmunoResearch,715-605-150)、Cy3驴抗小鼠(Jackson ImmunoResearch,715-165-150)、Alexa Fluor 488驴抗小鼠(Jackson ImmunoResearch,715-545-150)、,Alexa Fluor 488驴子抗兔(Jackson ImmunoResearch,711-545-152)、Cy3驴子抗兔子,6 nm金共轭山羊抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearch,115-195-146)。
以下二级抗体用于STORM的免疫荧光:标记有Atto 488或Alexa Fluor 405和Alexa Fuor 647的驴抗鼠抗体(Jackson ImmunoResearch,715-005-150),标记有Ato 488或Allxa Flu 405和Allxa Fluro 647的牛抗羊抗体(Jackeson ImmunoResearch,805-005-180)。为了用Alexa Fluor 405和Alexa Fluor 647标记抗体,将80µl抗体(1.3 mg/ml)与10µl 1M NaHCO混合三,8µg Alexa Fluor 405和1.2µg Alexa Fluor 647溶于二甲基亚砜中30分钟。用Atto 488标记抗体时,条件相似,但标记反应使用了1.6µg Atto 488。然后通过NAP-5凝胶过滤柱(GE Healthcare)过滤混合物以收集标记抗体。Atto 488每个开关周期发射约1100~1300个光子,远低于Alexa Fluor 647(每个开关周期4000~5000个光子)[49].
病毒感染
对于病毒感染,A549细胞首先接种不同剂量的病毒,在37°C的DMEM(无血清)中稀释90分钟。用PBS清洗细胞两次以去除未结合病毒,然后用预热的全DMEM培养基培养并保持在37°C。为了在不使用酸-旁路治疗的情况下测量流感病毒滴度(X-31、WSN和Udorn),在收集用于斑块分析的上清液之前,病毒感染总时间为36小时,如下所述。对于RSV病毒感染,A549细胞被RSV感染24小时,然后用抗融合蛋白(F蛋白)抗体进行免疫染色,并用流式细胞仪进行分析。对于假型MLV病毒感染,允许感染24小时,直接固定细胞,通过流式细胞术检测GFP荧光强度。
为了确保对照细胞和CD81 siRNA处理细胞中的病毒进入量相等,以进行进入后研究,进行了酸-过流处理以诱导病毒在质膜上融合。siRNA处理的A549细胞在4°C下与流感病毒结合1小时。在用冷PBS进行大量清洗后,加入预加热的低pH缓冲液(PBS,pH 4.5)两分钟。然后用培养基中和低pH缓冲液,然后用预热的新鲜培养基放置细胞。为了通过酸-旁路治疗测量流感病毒滴度(X-31和WSN),在收集用于斑块分析的上清液之前,病毒感染总共需要17小时。
牙菌斑测定
如上所述,将细胞感染流感病毒指定的时间,并收集上清液以在每个时间点结束时测定病毒滴度。使用连续稀释的上清液接种接种接种在6孔板中的MDCK-Texas细胞(Robert Lamb的Kind gift),在37°C下接种90分钟。用PBS洗涤两次后,将含有30%Noble琼脂(Affymetrix)、抗生素和2µg/ml乙酰化胰蛋白酶(Sigma)的3 ml DMEM琼脂覆盖层置于细胞上。平板在37°C下培养。大约两天后,小心取出琼脂盘,并立即用结晶紫溶液(1∶1000 V/W结晶紫,30%乙醇水溶液)对细胞进行10至15分钟的染色,以便对斑块数量进行简单量化。病毒滴度(PFU/mL)=斑块数/(稀释因子×接种量(mL))。对于每种情况,用三份样品进行测试。
流感病毒标签
如前所述,流感病毒X-31用亲脂染料DiD(Invitrogen,D7757)或Alexa Fluor 647(Invit罗gen,A-20006)标记[42]为了进行标记反应,将100µl原始病毒储备(2 mg/ml蛋白质浓度)与3µl 25 mM DiD或3µg Alexa Fluor 647溶于二甲基亚砜中分别培养2小时或1小时,并在室温下在黑暗中轻轻旋涡。使用NAP-5凝胶过滤柱(GE Healthcare),通过缓冲液交换将未结合染料去除到Hepes 145缓冲液中(50 mM Hepes,pH 7.4,145 mM NaCl)。将标记的病毒进行校准,在液氮中进行snap冷冻,并在−80°C下保存。在实验之前,将标记的病毒解冻并通过0.2µm孔径的注射器过滤器(Supor膜,Pall)过滤,以去除病毒聚集物。经标准菌斑试验证实,标记的病毒具有传染性(数据未显示)。
病毒结合试验
允许对照组或CD81敲低的A549细胞与DiD-标记的X-31结合,在4°C下用DMEM(无血清)稀释30分钟。在用冷PBS大量洗涤以去除未结合病毒后,将细胞进行胰蛋白酶化,并立即在室温下用2%多聚甲醛(PFA)固定20分钟。用PBS清洗PFA后,用流式细胞仪(BD bioscience)测量DiD荧光强度。每次测量至少有10000个细胞被量化。数据通过FlowJo进行分析。
病毒内化试验
对照或CD81-敲低A549细胞被允许与3×10结合4PFU/ml Alexa Fluor 647-标记的X-31病毒在DMEM(无血清)中在4°C的冰上稀释30分钟。在用冷PBS进行大量洗涤以去除未结合病毒后,加入预先加热的全培养基,并允许病毒在37°C下内化指定的时间量。在每个时间点结束时,用PBS洗涤细胞,在室温下用4%PFA直接固定20分钟。为了区分表面结合的病毒颗粒和内部化的病毒颗粒,在没有洗涤剂的情况下,使用小鼠抗Alexa Fluor 647一级抗体(Sigma,C1117)进行非渗透性免疫荧光,然后用Alexa Fluor 555结合的驴抗鼠二级抗体(Invitrogen,A31570)染色。使用定制的旋转圆盘共焦显微镜对样品进行成像。非内部化病毒颗粒用Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 555染色,而抗体无法进入的内部化病毒粒子仅显示Alexa Fuor 646信号。为了量化每个细胞内化的粒子数,我们使用共焦z堆栈的最大z投影,并计算病毒粒子总数(Alexa Fluor647信号)和非内化病毒粒子数,以及内化颗粒的数量(Alexa Fluor 647,但不含Alexa Fuor 555信号)。每个细胞内化足够低数量的病毒颗粒(~15个颗粒),以尽量减少多个病毒颗粒分入同一囊泡的可能性。使用双尾学生t检验进行统计分析。
蛋白质印迹
用Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad,161-037)制备细胞裂解物样品,并在4-15%Tris-HCL聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Read)上运行。将蛋白质转移到Hybond聚偏二氟乙烯膜(GE Healthcare)上后,用5%的非脂肪酸在TBS-Tween中封闭膜1小时,然后在4°C下培养一级抗体过夜,用TBS-Tween清洗3个10分钟,以及在室温下培养一小时HRP结合二级抗体。用TMA-6(TMA-100,Lumigen)检测信号,并将其显影到柯达胶片上。注意,CD81和CD63只能在非还原条件下检测到。
流式细胞术
流式细胞术分析的程序与之前描述的类似[64]简单地说,为了测量总蛋白表达水平(CD81或病毒蛋白),收集细胞并用2%PFA固定20分钟。用PBS洗涤一次后,在室温下用缓冲液P(0.075%皂苷,PBS中的10%BSA)渗透细胞20分钟。细胞与稀释在缓冲液P(1∶1000)中的一级抗体孵育1小时,并用缓冲液P冲洗三次,然后再与二级抗体孵育45分钟。二级抗体也用缓冲液P(1∶1000)稀释。用缓冲液P洗涤后,用PBS重新悬浮细胞,然后用流式细胞仪进行分析。数据由FlowJo进行分析。基于FSC和SSC散射对细胞进行门控,并根据荧光强度分布生成直方图。对于感染流感病毒的细胞,根据未感染细胞与感染细胞的荧光强度的比较设置第二个闸门。落入第二个门的群体对应于每个样本中感染细胞的百分比,从中分析平均荧光强度以推断病毒蛋白表达水平。为了探测表面蛋白表达,除洗涤剂外,所有步骤都相似。
免疫荧光
对于基于图像的实验,将接种在Lab-Tek 8孔玻璃皿中的A549细胞在室温下用4%PFA固定20分钟。除非另有规定,否则用0.1%Triton-X100在PBS中渗透固定细胞5分钟,用PBS洗涤两次,并用封闭缓冲液PBSA(PBS中3%BSA或PBS中5%牛血清)培养30分钟。然后用PBSA(1∶500)稀释的一级抗体培养细胞1小时。然后进行三次PBS洗涤(每次5分钟),再添加二级抗体1小时。之后,在成像之前,再次用PBS洗涤细胞三次。对于STORM,固定后在PBS中加入3%PFA和0.1%戊二醛(GA)20分钟。仅对免疫染色表面蛋白,固定后未进行渗透。当存在抗体种类冲突时,根据需要使用标记的一级抗体(CD81-FITC,BD Bioscience;HA-Alexa Fluor 647)。
为了量化内化病毒和细胞蛋白(EEA1和CD81)之间的共定位比率,样品的制备与病毒内化分析中的样品类似。在用抗Alexa Fluor 647抗体探测表面结合的病毒颗粒后,用PBS中的0.1%Triton-X100使细胞透化,随后进行间接免疫荧光以对每种蛋白质进行染色。通过共焦显微镜采集图像,手动分析每种情况下至少40~100个随机选择的细胞。只使用内部化的病毒颗粒来量化与CD81或EEA1共定位的病毒的比例。
酶联免疫吸附试验
通过酸旁路将流感病毒感染细胞17小时,收集上清液以测定释放的病毒颗粒中病毒蛋白的总量。选择M1是因为它在病毒中的丰度最大化了信号。Nunc 96孔板(eBoscience,44-2404-21)与捕获抗体(山羊抗M1,Abcam,在0.2M碳酸钠/碳酸氢盐缓冲液中稀释1∶1000,pH 9.4)在室温下孵育2小时。用PBST(PBS中0.05%吐温)清洗3分钟后,用PBSA(PBST中2%BSA)封闭板1小时。将上清液与RIPA缓冲液(1∶2稀释)混合,并添加到每个孔中,在4°C下过夜培养。样品用PBST洗涤三次,在室温下与检测抗体(小鼠抗M1,AbD Serotec,PBSA中1∶600稀释液)孵育1小时,洗涤三次后再与HRP结合的山羊抗鼠抗体(Bio-Rad,172-1011,1∶5000)孵养1小时。使用TMB底物(Thermo Scientific,N301)检测HRP活性,用0.18 M硫酸停止反应,然后在450 nm处测量吸光度。实验使用来自独立感染的三份样本进行,每个样本进行三次测量。为了确认检测效率,使用纯化的X-31病毒(查尔斯河实验室)作为标准样品(数据未显示)。
释放病毒数量的量化
对照组和CD81 siRNA处理的细胞通过酸旁路处理感染流感病毒。感染后17小时,收集上清液,通过免疫荧光检测释放的病毒数。简单地说,上清液在4°C下在涂有聚赖氨酸的Lab-Tek 8孔玻璃皿上吸收过夜。用PBS两次洗去未结合病毒后,用4%PFA固定样品15分钟,用3%PBSA缓冲液封闭,用抗HA和抗M1抗体进行免疫染色,然后用共焦显微镜成像。对150多个随机选择的区域进行成像,并对HA和M1染色阳性的颗粒数量进行量化(包含600多个病毒颗粒)。
单粒子跟踪
单粒子追踪实验已经在前面详细描述过[5],[41]–[43]简单地说,在单病毒追踪实验前24小时,用CD81-mEmerald或RFP-Rab5质粒对A549细胞进行核感染。用预先加热的PBS清洗细胞两次后,2.6×104将PFU/ml DiD-标记的X-31病毒稀释在成像缓冲液中(9份DMEM,不含酚红,1份pH值为8的Hepes缓冲液,补充氧气清除系统:0.8 mg/ml二羟基苯甲酸(PCA,Sigma,37580),0.5 U/ml原儿茶酸3,4-双加氧酶(PCD,Sigma-,P8279))添加到细胞中。将显微镜的物镜和载物台加热,使细胞的温度保持在37°C。添加DiD标记病毒后立即开始图像采集就地为了获得DiD标记的病毒和细胞蛋白的同时成像,DiD用647 nm氪激光(相干)激发,而mEmerald和RFP分别用488 nm氩离子激光(相干激光)和561 nm固态激光(CrystaLaser)激发。DiD和mEmerald/RFP的荧光发射由630 nm长通二向色性分离,用带通滤波器过滤(705/40用于647通道,525/40用于488通道,605/70用于561通道),并在EMCCD相机(Andor)上以0.5秒的曝光时间成像。如前所述进行成像分析[5]简单地说,对于每个图像,从DiD通道收集的荧光信号用高斯空间滤波器卷积以去除背景和噪声。为了识别病毒峰值,该算法对连接到每个局部最大值的明亮区域执行递归积分。计算每个荧光峰的质心以确定病毒粒子的位置,并通过重建相邻帧之间具有相似邻近度和强度的成对峰来获得轨迹。绘制DiD的荧光强度随时间的变化曲线。
批量病毒融合试验
首先用冷PBS冲洗接种在Lab-Tek 8孔玻璃皿中的对照或CD81-敲除A549细胞,然后用2×10培养4PFU/ml DiD-标记的X-31在4°C下在DMEM(无血清)中稀释45分钟。用冷PBS洗涤两次未结合病毒后,加入预先加热的全培养基,并将细胞保持在37°C下指定的时间。在每个时间点结束时,对细胞进行胰蛋白酶处理,并立即用2%PFA固定20分钟。然后,用PBS清洗细胞并重新悬浮。通过流式细胞仪测量DiD荧光强度。每次测量至少测量10000个细胞,每种条件下重复测量。使用FlowJo对数据进行分析。绘制归一化病毒融合程度(每个时间点的平均DiD强度-初始平均DiD密度)/初始平均DiC密度)。
风暴
STORM实验在奥林巴斯IX71倒置光学显微镜上进行,如前所述[65]在本研究中,STORM使用了三种激光器:657 nm(RCL-300-656;晶体激光器)、488 nm(蓝宝石460-10;相干)和405 nm(立方405-50C;相干)。使用高数值孔径(NA)油浸物镜(100×UPlanSapo,NA1.4;Olympus)收集荧光发射,将其成像到背照电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)相机(iXON DU-897;Andor)上。对于Alexa Fluor 647和Atto 488的双色3D成像,两个成像激光束(488 nm和657 nm)和一个激活激光束(405 nm)由定制的多色反射镜(z488/647/780rpc;Chroma)反射。Alexa Fluor 647和Atto 488的荧光发射由安装在商用分束装置上的630 nm长通二向色性分光镜(带100 cm焦距圆柱透镜的3D双视图;光度学)分离。采用FF01-535/50(Semrock)和ET705/72m(Chroma)两种带通滤波器分别对短波和长波信道进行滤波。除了带通滤波器外,在双视图(光度学)之前还添加了一个双陷波滤波器(NF01-488/647;Semrock),以阻挡两个激发激光束。每个通道的STORM成像以60 Hz的频率连续进行,每个通道在EMCCD摄像机(iXON DU-897)中的256×256像素上成像。STORM图像是使用前面描述的类似方法生成的[65]。Alexa Fluor 647和Atto 488通道中的STORM图像通过三阶多项式翘曲图在三维上对齐,该翘曲图是从100-nm Tetraspeck荧光珠的校准图像中获得的。剩余对准误差在x-y方向为~7 nm,在z方向为~20 nm。如前所述,为了校正成像采集过程中的样本漂移,我们依靠成像本身的相关函数来校正横向和轴向漂移[48]。由于成像采集是先用长波通道依次进行的,647通道被漂移校正到647 nm采集的最后一帧,而488通道被漂移修正到488 nm采集的第一帧。Alexa Fluor 647的横向空间分辨率为20~30 nm,轴向空间分辨率为50~60 nm;而Atto 488的横向分辨率为30~40nm,轴向分辨率为~100nm。
电子显微镜
A549细胞感染了流感病毒,感染指数为2。在室温下用2.5%PFA/GA在pH 7.4的0.1M二甲酰二胺钠缓冲液(电子显微镜科学,15949)中固定至少1小时之前,允许感染持续15小时。细胞在1%四氧化锇(OsO4)/1.5%亚铁氰化钾(KFeCN6)中固定30分钟,在水中清洗三次,并在1%醋酸铀酰水溶液中培养30分钟,然后在水中清洗两次,随后在酒精等级中脱水(每次5分钟;50%、70%、95%、2×100%)。将细胞从培养皿中取出,置于丙氧基中,以3000 rpm的转速造粒3分钟,并在丙氧基和TAAB Epon的1∶1混合物中渗透2小时(加拿大圣罗兰Marivac公司)。随后将样品嵌入TAAB Epon中,并在60°C下聚合48小时。在Reichert Ultracut-S切片机上切割超薄切片(约60 nm),转移到柠檬酸铅染色的铜网格上,并在TecnaiG中进行检查2Spirit BioTWIN和图像由AMT 2k CCD摄像机记录。
对于免疫金电子显微镜,在病毒感染指示时间点结束时,用PBS冲洗细胞一次,用4%PFA固定15分钟,用PBSA(PBS中的3%BSA)封闭30分钟。在PBSA(1∶500)中稀释的初级抗体与细胞在4°C下孵育过夜。用PBS洗涤三次后,用6nm金缀合的第二抗体(1∶40)处理细胞4小时,用2.5%PFA/GA在0.1M碳酸钠缓冲液中后固定至少1小时。按照上述方法将样品嵌入并切片,以进行透射电子显微镜成像。
支持信息
图S1
不同siRNA结构的CD81耗竭效率。A) 电穿孔48小时后,对六种不同的siRNA构建物进行CD81敲除效率测试。用抗CD81一级抗体和荧光标记的二级抗体染色后,用流式细胞仪检测CD81的表达。每个条件下至少测量了10000个细胞。橙色、蓝色和洋红色曲线分别对应于未添加一级抗体的细胞、CD81免疫染色的对照(非靶向)siRNA处理细胞和CD81 siRNA处理的细胞的强度分布。B) (A)中测量值的定量总结。选择CD81 siRNA 1进行后续研究。C) 用对照或CD81 siRNA 1处理A549细胞48小时。用洗涤剂渗透或不渗透细胞,分别检测细胞中CD81的总量或细胞表面CD81的量。然后通过从CD81的总量中减去细胞表面上的CD81的量来计算细胞内CD81水平。根据定量,对照细胞的细胞表面和细胞内CD81组分分别为~92%和8%。CD81敲除细胞的分配相似(细胞表面和细胞内CD81的分配分别为87%和13%)。一条双尾蛇t检验在每种情况下进行,并提供p值。D) CD81敲除不影响CD81相关蛋白的表达。用对照或CD81 siRNA处理A549细胞48小时。收集细胞,用所示抗体进行免疫印迹。肌动蛋白和微管蛋白用作负荷对照。
(每股收益)
图S2
CD81-mEmerald的表达并不影响CD81的分布或流感病毒的融合和感染。A) 用CD81-mEmerald质粒对A549细胞进行核感染24小时,然后用抗CD81抗体进行免疫染色。注意,CD81-mEmerald信号和CD81抗体染色之间几乎完全重叠。B) CD81与早期内体标记部分共定位。用CD81-mEmerald质粒对A549细胞进行核感染24小时,然后用抗EEA1抗体进行免疫染色。C) 用抗CD81和抗EEA1抗体对A549细胞进行免疫染色,以显示内源性CD81和EEA1之间的部分共定位。D) 量化CD81和EEA1之间的共定位。我们从共聚焦切片中随机选择2500~3000个CD81+囊泡,并量化CD81-mEmerald或内源性CD81与EEA1之间的共定位。对于CD81-mEmerald表达细胞,约37±11%的CD81-mEmerald+囊泡对EEA1呈阳性,约33±12%的EEA1+囊泡对于CD81-mEmerald呈阳性。未转染细胞中内源性CD81和EEA1的共定位水平相似:约34±13%的CD81+囊泡对EEA1阳性,约38±14%的EEA1+囊泡对于CD81阳性。E) CD81-mEmerald表达不影响流感病毒融合。用CD81-mEmerald或对照GFP质粒对A549细胞进行核感染24小时。在指定时间进行批量病毒融合试验。误差线为三倍的标准偏差。F) CD81-mEmerald表达不影响流感感染。用CD81mEmerald或对照GFP质粒对A549细胞进行核转染24小时。用MOI<0.1的X-31或WSN感染细胞36小时。通过菌斑试验测定上清液中的病毒滴度。误差线为三倍的标准偏差。
(每股收益)
图S3
流感病毒的融合主要发生在对照细胞和CD81敲除细胞的Rab5阳性内体中。A) 流感病毒颗粒进入后融合在Rab5阳性内体内。添加了DiD-标记X-31的活细胞共焦成像就地将表达RFP-Rab5的A549细胞维持在37°C。以0.5秒的间隔收集图像。A-1)在不同时间点拍摄的带有白色圆圈所示病毒的几张快照。A-2)所示DiD标记病毒的荧光信号随时间的变化。请注意,病毒融合事件发生在434秒。B)流感病毒偶尔在Rab5阴性内体中融合。B-1)在不同时间点拍摄的多张快照,白色圆圈表示病毒。B-2)所示DiD标记病毒的荧光信号随时间的变化。病毒融合事件发生在85秒。C)C-1)在40个在对照细胞中融合的病毒颗粒中,86±4%进入Rab5+内体并融合,而其余的则在Rab5-内体中融合。C-2)在CD81-敲除细胞中融合的35个病毒颗粒中,89±3%的病毒颗粒进入并融合在Rab5+内体中,而其余的病毒颗粒融合在Rab2-内体中。误差是两个独立实验的标准偏差。D) CD81缺失后,RFP-Rab5表达细胞中的病毒融合受损。实验的执行与除了用RFP-Rab5质粒对细胞进行核感染。仅选择那些表达RFP-Rab5的细胞进行流式细胞术分析。误差线是三次测量的标准偏差。一条双尾蛇t检验执行,并提供p值。
(每股收益)
图S4
CD81和各种病毒蛋白在病毒出芽部位的克隆化。A) 用X-31感染细胞16小时,固定、渗透并用抗NA(红色)和抗CD81(绿色)进行免疫染色。比例尺:10µm。B) 用X-31感染细胞16小时,用抗M2(红色)和抗CD81(绿色)进行固定和免疫染色,但不渗透。比例尺:10µm。C) 用Udorn感染细胞16小时,固定、渗透并用抗HA(红色)和抗PB1(绿色)进行免疫染色。比例尺:10µm。D) 用Udorn感染细胞16小时,固定、渗透并用抗M2(红色)和抗PB1(绿色)进行免疫染色。比例尺:10µm。E) 用Udorn感染细胞16小时,固定、透化并用抗NA(红色)和抗CD81(绿色)进行免疫染色。比例尺:10µm。F) 用Udorn感染细胞16小时,固定、渗透并用抗HA(红色)和抗CD81(绿色)进行免疫染色。比例尺:10µm。G) 用Udorn感染细胞16小时,固定、渗透并用抗Udorn血清(红色)和抗CD81(绿色)进行免疫染色。比例尺:10µm。H) CD81-敲除细胞用Udorn感染16小时,固定、渗透并用抗Udorn血清(红色)和抗CD81(绿色)进行免疫染色。比例尺:10µm。
(每股收益)
图S5
CD81表达水平随着流感病毒感染而略有下降。A) 通过流式细胞术测定未感染或X-31感染的细胞中CD81的表达量。用NP和CD81对A549细胞进行免疫染色。根据NP强度对细胞进行门控,以进一步分析CD81表达水平。在左侧面板上,黑色、红色和蓝色曲线分别对应于未添加NP一级抗体的细胞、未感染流感病毒的细胞和感染流感病毒细胞的NP强度曲线。具体而言,选择与左侧面板中橙色条带中的细胞对应的NP细胞来分析未感染细胞的CD81强度,而选择与左侧板中蓝色条带中细胞对应的NP+细胞来分析X-31感染细胞中的CD81密度。CD81的荧光强度绘制在右侧面板上,其中黑色、红色和蓝色曲线分别对应于在不添加针对CD81、NP-细胞和NP+细胞的第一抗体的情况下测量的细胞的CD81强度曲线。每种情况下至少有10000个细胞被定量。B) 根据(A)中所述的分析,量化有或无X-31感染的细胞中CD81表达水平。细胞被X-31感染17小时。注意,X-31感染时CD81表达减少约20%。误差线是重复测量的标准偏差。
(每股收益)
图S6
CD81富含正在萌芽的WSN病毒,CD81敲除可破坏X-31病毒的裂解。A) CD81被纳入正在萌芽的WSN病毒中。细胞被WSN感染15小时,CD81被免疫金标记用于电子显微镜。白色方框中区域的放大图像显示在右上角。比例尺:100 nm。B) 对照细胞中X-31病毒萌芽的EM图像。用X-31病毒感染A549细胞,并进行16小时的酸化处理。比例尺:200 nm。C) 在CD81击倒细胞中萌芽X-31病毒。用X-31病毒感染A549细胞,并进行16小时的酸化处理。请注意,相当一部分萌芽病毒的开放膜颈与质膜相连(箭头)。比例尺:200 nm。
(每股收益)
图S7
单独的HA可以将CD81募集到富含HA的簇中。A) 用pCAGGS-HA/Udorn质粒电穿孔A549细胞24小时,并用HA(红色)和CD81(绿色)抗体进行免疫染色。用Alexa Fluor 647标记的抗HA探针探测HA(红色),用FITC偶联的抗CD81探针探测CD81(绿色)。图像是共焦图像的XY横截面。比例尺:10µm。B) 除了用载体质粒模拟转染细胞外,实验的执行与(A)中的相似。图像是共焦图像的XY横截面。比例尺:10µm。C) 用pCAGGS-NA/Ud质粒电穿孔A549细胞24小时,固定并用抗CD81(绿色)和抗NA(红色)抗体进行免疫染色。用Alexa Fluor 647标记的抗NA探针探测NA(红色),用FITC偶联的抗CD81探针探测CD81(绿色)。比例尺:10µm。D) 除了用载体质粒模拟转染细胞外,与(C)中类似地进行实验。比例尺:10µm。
(每股收益)
电影S1
流感病毒颗粒进入CD81阳性内体后融合。添加DiD标记的X-31的活细胞共聚焦成像就地将CD81-mEmearld表达的A549细胞维持在37°C。以0.5秒的间隔收集图像。电影的播放速度是原始采集数据的7倍。
(WMV)
电影S2
流感病毒颗粒融合在CD81阴性内体中。添加DiD-标记X-31的活细胞共焦成像就地将CD81-mEmearld表达的A549细胞维持在37°C。以0.5秒的间隔收集图像。电影的播放速度是原始采集数据的7倍。
(WMV)