用一种新的特定因子组合表征皮肤成纤维细胞诱导的神经前体

摘要

功能神经元的选择性变性与神经变性疾病的发病机制有关，如帕金森病中脑多巴胺能神经元的变性¹，阿尔茨海默病的前脑胆碱能神经元²精神分裂症患者大脑皮层GABA能神经元^三治疗这些神经退行性疾病的一个有希望的策略是细胞移植疗法，该疗法使用来自胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）的细胞。最近的研究表明，从ESCs和iPSCs中衍生出的这些神经元亚型可用于治疗啮齿动物模型中的神经退行性疾病^4,5,6虽然已经制定了各种策略来衍生神经元亚型，包括从ESC和iPSC直接分化^4,5,6以及通过强制表达发育基因从体细胞直接重编程^7,8,9,10而限制细胞移植治疗广泛应用的主要障碍是神经元分化方案产生的异质性群体和直接重编程用于临床试验的神经元产量低。

体细胞的衍生，如神经前体细胞（NPC），是非常理想的，因为NPC是自我更新的三能细胞，可以产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞¹¹虽然NPC可以来源于胚胎或成人组织，但组织来源的使用和可获得性将限制NPC在研究和临床中的应用。最近的研究表明，鼻咽癌命运决定因子和负责细胞自我更新和维持的特定转录因子的组合可以直接将小鼠和人类成纤维细胞转化为具有增殖、自我更新和三元分化能力的NSC/NPC^{12,13,14,15,16}这些进展表明，从分化的体细胞而非神经元直接重新编程NPC，不仅可以替代从胎儿组织或多能干细胞衍生NPC，还可以提供潜在的无限神经元来源。

我们之前的研究表明，使用我们的新型转录因子组合，成年小鼠皮肤成纤维细胞可以成功地重新编程为iNPC¹²在这项研究中，我们进一步确定了iNPC的特征和潜在功能，我们的结果表明，直接重编程的iNPC在几个特征上与野生型NPC非常相似，包括特异性标记基因表达、三帐篷分化潜力和神经电生理特性。这些发现进一步证实了使用我们的新型转录因子混合物衍生的iNPC将是神经退行性疾病细胞移植治疗的一个很有希望的候选者。

结果

iNPC的标记基因表达和分化潜能

我们之前使用逆转录病毒传递系统通过三种神经祖细胞相关转录因子（Sox2、Bmi1和c-Myc）体外表达两个神经祖细胞命运决定因子（Brn2和TLX）在小鼠皮肤成纤维细胞中，成功地将E/Nestin:EGFP转基因小鼠皮肤成细胞转化为神经前体细胞系¹²在培养过程中，我们发现iNPC表现出比WT-NPC更高的增殖率，并且在50多代细胞中可以保持类似的增殖率、自我更新和分化潜能（数据未显示）。所有实验均使用第5代至第10代之间的iNPC。为了确定iNPC和WT-NPC之间的相似性，我们在标准鼻咽癌生长条件下培养和扩增iNPC，并用鼻咽癌标记基因特异性抗体进行免疫染色分析。我们的结果表明，无论是在贴壁（生物极性）还是悬浮（神经圈）培养条件下培养，iNPC和WT-NPC都具有相似的细胞形态(图1，右侧面板）。此外，免疫化学数据还显示，包括Sox2、Nestin和Pax6在内的鼻咽癌标记基因在iNPC中的表达水平和分布与WT-NPC中相似(图1，左侧三个面板）。为了进一步证实相似性，我们使用SYBR-Green-based定量实时PCR和特定引物对(表1)检测Nestin等鼻咽癌特异性标记基因表达水平，以及成纤维细胞、WT-NPC和iNPC中成纤维细胞标记基因的表达。我们的结果证实了Nestin、Sox2、Musashi-1（Msi-1）、CD133、Ncan、Sox1和Gpm6a的转录，这些都是NPC的特征标记¹⁶(图2A). 重要的是，与皮肤成纤维细胞（Fbb）相比，来自我们的转录因子混合物的iNPC显示成纤维细胞特异性基因（包括DKK3、Snail1、Twist1和Col1α1）降低到与WT-NPC类似的水平(图2B)这表明iNPC与WT-NPC具有相似的标记基因表达谱，并且iNPC中成纤维细胞特异性转录程序下调。此外，我们观察到iNPC中Sox1、Msi-1和Pax6的转录水平低于WT-NPC，Pax6转录水平与iNPC的蛋白水平一致(图1下部面板），表明外源基因可能会补偿iNPC中表达水平较低的内源性基因的功能。我们对iNPC中包括Brn2、Sox2、Bmi1、Nr2e1和c-Myc在内的转基因和内源性基因转录水平的实时分析支持了这种可能性(图S1A和S1B). 此外，我们比较了iNPC早期和晚期的分化潜能以及转基因和内源性基因表达谱。我们的结果表明，晚期传代的iNPC仍具有类似于早期传代iNPC的三元分化潜能(图S5A)，除c-Myc外，用于直接重编程的大多数转基因表达下调，而内源性Brn2、Sox2、Bmi1和Nr2e1在后期传代与早期传代相比显著上调(图S5C和图S5D). 此外，一些鼻咽癌特异性标记基因表达水平在传代后期显著上调，如Sox1和Gpm6a，其中一些没有显著变化，如Nestin和CD133，其他基因包括Msi-1、Pax6和Ncan下调(图S5B). 这些结果表明，内源性基因网络在传代后期已经被激活，iNPC将逐渐独立于转基因的表达。

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图1

iNPC、WT-NPC和Fbb的光图像和免疫染色分析。

对iNPC、WT-NPC和Fbb进行悬浮培养或贴壁培养（涂有聚-D-赖氨酸/纤维粘连蛋白），并通过明亮视野显微镜（右侧）评估细胞形态。电池（5×10⁴)在含有涂有聚-D-赖氨酸/纤连蛋白的盖玻片的24孔板中培养，用4%PFA固定，并用PBS中的0.2%Triton X-100透化，然后用Nestin（红色）、Sox2和Pax6（绿色）抗体进行免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行核染色（左图）。（比例尺：50μm）。

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图2

iNPC中神经前体细胞标记基因的表达及其分化潜能。

（A） 用SYBR-Green定量RT-PCR和特异引物对分析iNPC、Fbb和WT-NPC中NPC特异基因的转录谱（参见表1). 误差条对应于SEM。（B）通过SYBR-Green定量RT-PCR和特定引物对分析Fbb、iNPC和WT-NPC中成纤维细胞特异性基因的表达水平（参见表1). GAPDH被用作内部控制。（C） 在胶原IV包被的盖玻片上培养的iNPC分别在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化条件下孵育，然后用多克隆β-微管蛋白III（上图）、单克隆GFAP（中图）和多克隆O4（下图）抗体进行免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行核染色（比例尺：50μm）。

表1

SYBR-Green-based定量实时RT-PCR的引物对

目标（鼠标）	正向底漆	反向底漆	退火温度
内斯汀	5′GTCTCAGGACAGTGCGAGCCTTC3′	5′TCCCCTGAGGACCAGGAGTCTC3′	60摄氏度
第6页	5′GCGGAGTATGATACCACC3′	5′GAAATGAGTCCTGTTGAAGTGG3′	60摄氏度
武藏1	5′GATGGCTCCCCCCCCCAGGTT3′	5′CATTGGTGAAGGCTGTGGCA3′	60摄氏度
CD133型	5′TCGTACTGTGGCTGTGGC3′	5′ACCCAAGGATCATCATACCAG3′	60摄氏度
Sox2系统	5′CCTCCGGGACATCATGTA3′	5′GCAGTGTGCCGTTAATGGCGTG3′	60摄氏度
Ncan公司	5′GCACCGTGTATGTCTGTAGT3′	5′ATTCTCGCAGCGTGCATA3′	60摄氏度
Sox1系列	5′GAGATGATCAGCATGTACCTGCC3′	5′GTAGTGCTGTGGCAGCGAGT3′	60摄氏度
Gpm6a公司	5′GCTTGGACAAGTGGACTGC3′	5′标记	60摄氏度
丹麦克朗3	5′ACAGTGAGGCTGTGGAGACCAGC3′	5′TCCCTCTGGTTGTCACAGATGGTC3′	60摄氏度
蜗牛1	5′gtctgcacgacctggaa3′	5′AGCCAGACTCTCTGGTGCTTG3′	60摄氏度
扭转1	5′GAGGTCTGCCAATCAGCA3′	5′CCAGTTGATCCCAGTTT3′	60摄氏度
第1a1列	5′CTGACGCATGGCAAGAAGA3′	5′ATACCTCGGGTTTCCACGTC3′	60摄氏度
GAPDH公司	5′AAGGGCTCATGACCACAGTC3′	5′GGATGACTTGCCCACAG3′	60摄氏度

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为了研究iNPC的三元潜能，我们检测了iNPC分化为三种主要神经谱系的能力。用10%FBS培养细胞诱导星形胶质细胞分化。分化7天后，培养系统中约30-40%的细胞显示出典型的星形胶质细胞形态，GFAP染色均匀(图2C中间面板）。当iNPC在添加2%B27的神经基底细胞培养基中培养7天时，在培养中观察到约80%的β-Tubulin III阳性细胞(图2C，上面板）。虽然在我们之前的研究中，iNPC已经被证明容易生成神经元和星形胶质细胞¹²它们的少突胶质分化潜能尚未被探索，这引起了人们对其三位一体性的担忧。在这里，我们的数据进一步验证了来自小鼠皮肤成纤维细胞的iNPC确实是三元的。在用FGF2、血小板衍生生长因子（PDGF）和forskolin进行增殖后，在三碘甲状腺原氨酸（T3）和抗坏血酸存在下进行分化，iNPC可以生成少突胶质细胞(图2C，下部面板）。此外，对于成熟的神经元分化，培养的iNPC没有EGF，但存在BDNF，浓度增加（20 ng/ml至30 ng/ml），FGF-2浓度逐渐降低（10 ng/ml到6.7 ng/ml和5 ng/ml）。大多数分化细胞表现出神经元形态和神经元标记物β-Tubulin III的表达，MAP-2⁺（微管相关蛋白）细胞数量占50%(图3A，上面板）。为了进一步确定神经元的亚型，我们检测了亚型神经元标记物胆碱乙酰转移酶（ChAt）（胆碱能神经元）、5-羟色胺（5-HT）（血清素神经元）、GAD67（GABA能神经元）和酪氨酸羟化酶（TH，多巴胺能神经元）的表达。结果表明，iNPC分化为TH的比例相对较低⁺和GAD67⁺BDNF存在下的细胞(图3A（中下部面板），但在含有BDNF的培养条件下未观察到ChAt和5-HT阳性神经元（数据未显示）。这些结果表明，人工iNPC确实是三能细胞，可以根据分化过程分化为选定的神经元亚型。

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图3

来自iNPC的神经元之间的成熟神经元分化和突触形成。

iNPC在胶原IV包被的玻璃盖玻片上培养，并进行亚型神经元分化。分化三周后，用4%的PFA和（A）固定细胞，然后用β-微管蛋白III和MAP-2（上面板）、β-微管蛋白III和TH1（中面板）以及β-微微管蛋白II和GAD67（下面板）进行双重免疫染色。（B） β-微管蛋白III和突触体素抗体双重免疫染色。（a，a′）β-微管蛋白III（绿色）；（b，b′）突触体素（红色）；（d，d′）表示（c，c′）的放大倍数，箭头表示神经元之间形成突触。DAPI核染色（蓝色）。（比例尺：50μm）。

iNPC功能神经元突触的形成及其电生理特性

突触是神经系统内传递电气或化学信号的神经元之间的连接。为了评估iNPC衍生的神经元相互形成连接的能力，我们在有利于原代神经元培养的条件下将神经元与iNPC区分开来，并观察到来自iNPC的神经元以点状分布表达突触体素(图3B，上面板：b和d）类似于在WT-NPC中观察到的突触体素的表达模式和分布(图3B，下部面板：b′和d′），表明体外iNPC神经元形成突触。为了分析iNPC产生的神经元是否具有NPC神经元的功能膜特性，我们进行了电生理记录。在电流灯模式下，注入去极化电流（160 pA）诱发动作电位样尖峰(图4A和4B)20%（12/60）的神经元样细胞。此外，该峰值可被1μM TTX、Na阻断⁺通道阻断剂(图4C). 在电压灯模式下，电压依赖向外K⁺在培养7–10天后，在iNPC衍生神经元中记录到由−60 mV至+30 mV电压阶跃产生的电流。向浴液中添加10 mM TEA和1 mM 4-AP，以记录A型(图4D)和D型(图4E)K（K）⁺电流。此外，全细胞斑贴灯记录显示神经元样静息膜电位（−66.0±1.4 mV，n=10；图4F)和膜电容（21.3±1.1 pF，n=10；图4G)在iNPC衍生的神经元中，进一步表明与初级脑NPC相比，其功能膜性质和活动类似。

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图4

通过全细胞斑贴灯记录评估iNPC衍生神经元的电生理特性。

贴在培养的iNPC分化神经元（A）膜上的贴片吸管的相位对比图。电流注入步骤在（B）和（C）1μM TTX处理之前和之后诱导的动作电位样尖峰的典型痕迹。（D） A型K⁺通过初始超极化（电压从−60 mV的保持电势逐步升高到−90 mV，并在第一步中恢复到−60 mV）诱导电流，然后在10 mM TEA存在下以10 mV（500 ms持续时间）的增量逐步升高到+30 mV。（E） D型K⁺电流是由初始去极化引起的（电压阶跃从−60 mV到−30 mV，在第一步中恢复到−60 m V），然后在1 mM 4-氨基吡啶存在下以10 mV（500 ms持续时间）的增量阶跃到+30 mV。条形图显示了iNPC衍生神经元的静息膜电位（F）和膜电容（G）。（比例尺：50μm）。

讨论

最近的研究表明，定义的转录因子或微小RNA的组合可以直接将体细胞转化为谷氨酸能、多巴胺能、GABA能和运动神经元^{7,8,10,17,18,19}将这些体细胞直接转化为诱导神经细胞（iNC）或自我更新神经祖细胞（iNPC）的亚型，在神经退行性疾病的治疗中有着重要的应用。然而，iNC不能自我更新，这限制了可用于研究和临床研究的细胞数量。在这方面，国际NPC比国际NC更有吸引力。

尽管已经制定了各种策略来从胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）中获得NPC或区域特定的神经祖细胞^20,21,22,23ESC的伦理问题和iPSCs形成畸胎瘤的风险限制了其临床和研究应用。最近有报道称，成纤维细胞可以通过Yamanaka因子结合鼻咽癌培养条件直接重组为NPC²⁴或者有几个因素^13,15,16在后一种方法中缺少临界多能性因子Oct4，这可能会降低畸胎瘤形成的风险。此外，Sox2是神经祖细胞鉴定和维持的关键调节基因，也已成功用于将成纤维细胞直接转化为神经祖细胞¹⁴上述研究与我们的发现一致，即小鼠成纤维细胞可以直接转化为具有典型原发性鼻咽癌特性和分化能力的iNPC。然而，我们早期的研究采用了五种因子（Brn2、TLX、Sox2、Bmi1和c-Myc）的新组合，并成功地将成人皮肤成纤维细胞转化为iNPC¹²此外，与其他研究相比，我们的系统和Wernig博士的系统¹⁶通过观察GFP的形成，为监测iNPC直接转化过程的动力学提供了有价值的工具⁺殖民地(图S2). 重要的是，我们的iNPC重编程程序缩短了iNPC生成的过程，通过该过程GFP⁺菌落出现在第9天，而不是第25天¹⁶或更长时间¹⁵此外，与单因素系统相比，我们的程序也独立于培养条件¹⁴在本研究中，我们进一步证明了我们的iNPC细胞系不仅具有三能分化潜能和分化为具有突触形成的成熟神经元的能力，而且具有独特的电生理特征(图2,图3和图4).

核孤儿受体TLX通过miR-9的负调控环决定神经祖细胞的命运，但也有助于NPC的增殖和自我更新^25,26,27.Brn2还通过与Sox2或Sox11合作在确定巢蛋白基因表达方面发挥重要作用^28,29,30因此，在我们的研究中，应用Brn2和TLX作为鼻咽癌命运决定因素，以及其他因素作为细胞增殖和自我更新的调节器，可能会提供更好的iNPC重编程。然而，我们之前的研究并未证明这些iNPC的详细特性。这里我们表明，五种因素组合产生的iNPC是三元的、自我更新的iNPCs，可以产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(图2C). 此外，这里的iNPC来自皮肤成纤维细胞（E/Nestin：EGFP转基因小鼠），在转化后最初表达EGFP，并在第5代之前保持绿色荧光。之后，我们观察到EGFP消失与WT-NPC一致(图S3A)然而，iNPC中EGFP的消失并不影响特定NPC标记基因的表达，如Sox2、Nestin和Pax6(图1,图2和图S4)和iNPC的分化潜能(图2和图S5A). 转基因沉默可能导致EGFP的消失。为了验证这种可能性，我们使用EGFP特异性引物通过RT-PCR分析了iNPC早期和晚期的外源性EGFP表达，并通过实时RT-PCR检测了内源性Nestin表达。结果表明，EGFP在传代后期表达消失。然而，内源性巢蛋白的表达仍然保持高水平(图S3 B和C)间接支持转基因沉默的可能性。有人提出，DNA甲基化可以通过直接干扰转录因子与DNA的结合而引起转录抑制，这一点已被许多不能结合甲基化识别元件的转录调控因子的鉴定所证实³¹此外，发现转基因沉默与基因启动子CpG岛DNA甲基化的开始有关³²与转基因启动子相比，在正常细胞中，甲基化主要涉及CpG贫乏区域，而CpG岛似乎受到保护，不受这种抑制性修饰的影响³³我们的DNA甲基化分析清楚地表明，晚期传代iNPC的转基因启动子中DNA甲基化水平高于早期传代iNFC，可能导致EGFP的消失(图S6). 与DNA甲基化分析一致，我们发现DNA甲基化抑制剂（5-AZa）而非组蛋白脱乙酰酶抑制剂（TSA）逆转了早期和晚期传代iNPC培养物中EGFP的表达（数据未显示）。在本研究中，我们使用了两个NPC命运决定因子Brn2（Pou3f2）和Sox2，据报道，这两个决定因子通过巢蛋白增强子内Sox2和Brn2之间的协同作用来确定巢蛋白的表达²⁹早期转基因表达和后期内源基因表达的高水平基因可能有助于Nestin的表达。此外，我们推测，外源基因可能在直接重编程后沉默并失去与nestin第二内含子增强子的结合活性，并且负责维持稳定细胞命运的NPC相关基因（包括Pax6、Msi-1 Ncan、Sox1和Gpm6a）的内源性表达被激活。然而，iNPC中转基因和内源性基因的转录分析表明，用于成纤维细胞直接转化的转基因在重新编程后并没有沉默(图S1A)，但一些转基因在长期传代后会在iNPC中下调(图S5C和S5D)并且负责维持鼻咽癌特性的选定内源性基因上调，如Sox1和Gpm6a(图S5B). 此外，与成纤维细胞相比，成纤维细胞特异性基因Dkk3、Snail1、Twist1和Col1α1在iNPC和WT-NPC中均显著下调(图2A和B)这表明重组的iNPC抑制了成纤维细胞特异性转录网络并建立了新的转录网络。此外，我们观察到NPC相关基因Pax6、Msi-1和Sox1的内源性表达水平低于WT-NPC。据报道，Pax6通过直接调节Sox2的表达，是神经元命运决定和NPC增殖的关键调节因子³⁴Msi-1和Sox1也有助于维持神经祖细胞的未成熟状态和自我更新活性^35,36因此，有可能更多外源性表达Sox2和其他基因(图S1)补偿iNPC中Pax6、Msi-1和Sox1的低表达。迄今为止，尚不清楚起始细胞的表观遗传记忆是否决定iNPC的生成效率及其未来的分化潜能。为了解决这些问题，我们已经从其他起始细胞（如星形胶质细胞）中开发出iNPC（未公开的数据），并将对来自不同胚层的起始细胞的iNPC进行比较。

除了我们的报告¹²，四个使用不同因子组合的研究小组报告了可诱导产生神经前体细胞^13,14,15,16这可能表明转录因子不是决定从成纤维细胞诱导NPC的唯一因素。相反，这些研究表明，如果细胞命运决定因素与相关监管机构协同工作，NPC的直接转化将得以实现。未来的研究需要确定使用不同的重编程鸡尾酒是否会改变iNPC细胞系的特征。长期目标应继续侧重于开发人类神经祖细胞在神经退行性疾病治疗中的临床应用程序。

方法

作者贡献

C.T.设计了实验，进行了所有的实验，并撰写了手稿；Q.L.和J.W.进行电生理记录和数据分析；K.M、R.A和Y.W.帮助构建、实时分析和免疫化学分析；K.M.、Y.L.、Y.H.和Q.C.提供了补充数据；D.K.帮助进行DNA甲基化分析；J.D.参与了数据讨论；J.Z.监督了项目并撰写了手稿。

补充材料

致谢

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