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关节炎研究与治疗。2013; 15（1）：R24。
2013年1月29日在线发布。 数字对象标识：4158年10月186日
预防性维修识别码：项目经理3672796
PMID：23363614

小鼠关节炎症模型成纤维细胞样滑膜细胞的特征

罗文·S·哈代，通讯作者1,2 克劳迪娅·胡尔索，1 刘英玲，1 西尔维亚·J·加斯帕里尼，1 科莱特·方烨，1 《金文图》，1 什哈尼·斯通，1 保罗·M·斯图尔特，2 卡里姆·拉扎，三 马克·S·库珀，2 马库斯·塞贝尔，1,4和洪州通讯作者1
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关联数据

补充资料

摘要

介绍

成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）在炎性关节疾病的基质环境中起着关键作用。尽管越来越多地使用从小鼠炎症模型中分离的FLS，但尚未对这些细胞进行详细的表征。

方法

在本研究中，从表达T细胞受体转基因KRN和MHC II类分子Ag7（K/BxN小鼠）的小鼠炎症关节中分离出FLS，并通过免疫荧光和实时逆转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）测定其培养纯度。通过实时RT-PCR测定促炎基因的基本表达。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定分泌的白细胞介素6（IL-6），并用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和皮质酮（啮齿动物的主要糖皮质激素）相对于其他间充质细胞群测定其调节作用。

结果

通过纤维连接蛋白、脯氨酰4-羟化酶、分化簇90.2（CD90.2）和248（CD248）在98%以上人群中的阳性表达来鉴定FLS培养的纯度。培养的FLS能够通过基质凝胶迁移和侵袭，在TNF-α的存在下这一过程增强。与从非炎症组织中分离的FLS相比，从K/BxN小鼠中分离的FLS具有显著更高的炎症标志物IL-6、趋化因子配体2（CCL-2）和血管细胞粘附分子1（VCAM-1）的基础表达（IL-6，3.6倍；CCL-2，11.2倍；VCAM-1，9倍；P（P）< 0.05). 与其他间充质细胞系（K/BxN；IL-6，40.8倍；CCL-2，1343.2倍；VCAM-1，17.8倍；ICAM-1，13.8倍；P（P）<0.05），分泌的IL-6反映了这些结果（K/BxN；con，169±29.7 vs TNF-α，923±378.8 pg/ml/1×105细胞；P（P）< 0.05). 剂量反应实验证实，皮质酮的有效浓度在10至100 nmol/l之间，TNF-α的有效浓度为1至10 ng/ml，而FLS中炎症基因的表达在第四代和第七代之间是稳定的。

结论

本研究建立了一组特征明确的关键炎症基因，用于在体外FLS培养物，从K/BxN小鼠和无火焰野生型对照中分离。经评估，它们对促炎和抗炎信号的反应与人类FLS培养中的反应非常相似。此外，本研究为小鼠FLS培养物的有效特性、持续时间和治疗提供了指南。

介绍

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症疾病，可导致关节和关节周围结构的渐进性损伤。其特征是滑膜内成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）的增生和驱动炎症过程的多个白细胞群的聚集[1]. 通过动物模型的使用，我们对炎性关节病的病因和病理学的理解得到了极大的提高[2-7]. 尽管炎症的靶向和严重程度不同，但这些模型都会对关节软骨或周围骨骼造成一定程度的损伤。重要的是，它们都表现为滑膜增生，以FLS过度增殖为特征。因此，这些模型在研究FLS在炎症性骨丢失中的作用方面具有重要意义[8-11]。

FLS是间充质来源的基质细胞，表现出高度活跃的行为，产生一系列细胞外基质成分和分泌因子，帮助维持滑液和关节表面的正常环境[12-14]. 此外，这些细胞被证明是滑膜炎期间维持炎症和驱动关节破坏的关键介质。在关节炎症过程中，FLS表现出侵略性、侵袭性表型，通过基质金属蛋白酶的作用分解软骨，同时其分泌因子的产生，如核因子κ-B受体活化剂配体（RANKL）促进破骨细胞分化、存活和活性，导致骨侵蚀和关节旁骨质疏松[15，16]。

从炎症RA关节分离的人FLS中多种炎症前粘附标记物和细胞因子的表达上调，从而影响白细胞迁移、存活和活化[17-20]. 在FLS分泌的细胞因子中，IL-6已被证明在RA的病理学中起着重要作用，并在炎症过程中强烈上调，在局部和全身发挥着不同的作用[21，22]. 在人类FLS中观察到的这种激活的炎症表型已被证明在长时间的细胞培养中得以维持，即使在缺乏促炎细胞因子的情况下也是如此[23-27]. 因此，FLS是疾病修饰和抗炎药物的靶点，这导致了大量工作，确定了这些细胞的特征，并使用明确的分离方法检查了它们在人类疾病中的作用[28]. 相反，由于受影响组织的尺寸较小，从小鼠炎症模型中分离FLS更具挑战性。因此，小鼠FLS分离方法和由此产生的细胞培养物尚未像人类FLS一样具有良好的特性。这种知识的缺乏阻碍了利用这些细胞的研究在体外，用于描述炎症性关节病小鼠模型的病理学。

本研究的目的是全面表征从炎症性关节病的K/BxN模型中分离和培养的FLS的炎症表型。特别是，我们有兴趣研究与正常间充质细胞群体相关的炎症标记物的表达，并确定这种炎症表型是如何在长时间细胞培养中保持的。

材料和方法

鼠标模型

库斯科夫（Kouskoff）先前描述的自然发展为关节炎的K/BxN小鼠等。[29，30]. 雄性KRN转基因小鼠（由Le Centre Européen de Recherche en Biologie et en Médecine善意提供）与雌性NOD小鼠杂交。结果K/BxN小鼠在60天时表现出显著的可重复的关节炎症。根据机构动物福利指南和批准的方案，动物被饲养在ANZAC研究所的动物设施中。悉尼当地卫生区动物福利委员会根据第2008/043号和第2012/006号议定书给予了伦理批准。使用巴特雷特和李描述的方法确定关节肿胀的临床评分等。[31，32]. 关节肿胀评分如表所示​表1。1为了产生一个FLS细胞系，将来自同一窝的至少三只小鼠的所有四肢的组织合并。来自相同背景的野生型（WT）小鼠被用于从无火焰关节生成FLS。

表1

K/BxN临床评分。

平均临床得分(n个=每窝3只）
重量腕部（L）腕部（右）踝关节（左）脚踝（右）总计
K/BxN垃圾127.43 + 2.232.832.832.6711.33 ± 0.6
K/BxN垃圾223.26 + 3.52.6732.67311.33 ± 0.3
K/BxN垃圾328.36 + 2.62.6733311.66 ± 0.4
WT垃圾124.31+1.100000 ± 0
WT垃圾225.01 + 2.900000 ± 0

FLS隔离和培养

从滑膜组织中分离FLS的方法是从先前描述的方法中改进的[33]. FLS品系1、2和3分别从K/BxN窝1至3窝中分离。在分离炎症关节之前，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。前肢和后肢分别在肱骨/尺骨/桡骨和股骨/腓骨/胫骨连接处分离。肢体在补充了10%热灭活FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM、高糖、谷氨酸MAX（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）中清洗。所有进一步的解剖都是用浸泡在培养基中的组织进行的。通过显微解剖去除附着的皮肤、指甲、肌肉和肌腱，小心避免损伤骨骼。立即从细胞分离过程中移除任何受损的骨骼，以防止来自骨髓室的细胞污染FLS培养物。然后通过解剖分离爪子的单个骨骼，以打开关节间隙并暴露滑膜组织。在含有1 mg/ml胶原酶4型（美国新泽西州弗里霍尔德沃辛顿生化公司，220 U/mg）和0.1 mg/ml脱氧核糖核酸酶I（澳大利亚新南威尔士州卡斯尔希尔西格玛阿尔德里奇）的20 ml培养基中培养带滑膜组织的解剖骨，并在37°C下剧烈摇晃1小时。组织高速旋转，将培养基移到新鲜试管中。然后将组织重新悬浮在20毫升新鲜介质中，再次旋涡并与前者结合，留下组织和骨骼。将组合培养基以1200 rpm离心3 min，细胞颗粒重新悬浮在20 ml新鲜培养基中，并在37°C、5%C0下培养2培养基每三天更换一次，细胞在第四代鉴定之前在80%至90%的汇合处传代。

细胞培养

分离的FLS和小鼠间充质C2C12细胞系（ATCC，Manassas，VA，USA）在补充有10%热灭活FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM高糖、谷氨酸MAX（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）中生长。部分分化的小鼠成骨前细胞系MC3T3-E1细胞（美国ATCC）在补充10%热灭活FBS、100 U/ml青霉素、100 g/ml链霉素和1%L-谷氨酰胺的MEMα（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）中培养。所有细胞均在37°C、5%C0下培养2媒体每三天换一次。细胞在80%至90%的汇合处进行亚培养。除非另有说明，否则在收获前用10 ng/ml肿瘤坏死因子（TNF）-α（英国阿宾顿研发系统公司）或100 nmol/l皮质酮（澳大利亚新南威尔士州卡斯尔希尔Sigma-Aldrich公司）处理成纤维细胞24小时。

免疫荧光

在细胞培养的第4代对FLS进行荧光免疫组化。细胞固定在2%多聚甲醛中，然后与一级抗体在室温下孵育1小时。使用以下多克隆抗血清对细胞进行染色：纤维连接蛋白1:400（F3648，Sigma-Aldrich，Castle Hill，NSW，Australia），CD248 1:200(PAB13304型，台湾台北市Abnova），CD90.2 1:100（550543；美国新泽西州富兰克林湖BD Biosciences Pharminogen），CD31 1:50（ab28364，英国剑桥Abcam）和CD68 1:100（H-255，美国加州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。以下二级抗体在室温下使用1小时：用FITC 1:400标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（sc2012，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA）和用Alexa Fluor 633 1:400标记大鼠抗鼠IgG（A21094，Invitrogen，Grand Island，NY，US）。使用TO-PRO™-3 1:400（T3605，澳大利亚维多利亚州墨尔本市生命科技公司）在室温下对Nuclei进行1小时的复染。使用奥林巴斯（Olympus Corp.，Tokyo，Japan）FV5-PSU共焦显微镜进行免疫荧光检测，并使用FLOVIEW软件进行分析。

Matrigel侵犯分析

通过涂有基质的跨腔插入物检查FLS的侵入。八个微米孔径的基质涂层插入物（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）在24孔板中的正常FLS培养基中培养2小时。然后将3000个FLS接种在transwell系统的内部隔室中的0.5毫升含有0.1%BSA的FLS培养基中。然后将0.75毫升含有10%FBS和50 ng/ml血小板衍生生长因子（PDGF）的FLS培养基加入外部隔室，该培养基含有或不含10 ng/ml IL-1或TNF-α刺激物（R&D systems，Abingdon，UK）。FLS在37°C、5%C0下培养224小时。然后分离插入膜并将其固定在10%的福尔马林缓冲液中，然后在PBS中洗涤并用哈里斯苏木精染色。对侵入基质凝胶并通过8微米孔的FLS进行计数。

RNA提取/逆转录

按照制造商的方案，使用InnuPREP迷你试剂盒（德国耶拿Analytik Jena AG）进行RNA分离。在寡核苷酸（dT）启动后，用SuperScript III逆转录酶（Invitrogen，Mulgrave，VIC，Australia）在50°C下孵育1小时，从1μg总RNA合成第一链cDNA。

实时PCR

根据制造商的说明，使用IQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad Laboratories，Regents Park，NSW，Australia）评估IL-6、趋化因子配体2（CCL-2）、血管细胞粘附分子1（VCAM-1）、细胞间粘附分子1（ICAM-1）和骨γ-羧基谷氨酸含蛋白（BGLAP）的mRNA表达，使用Bio-Rad iCycler iQ5实时PCR检测系统。18S引物用于cDNA归一化。反应如下：95°C持续2分钟，40次95°C循环10秒，60°C持续15秒，72°C持续30秒。数据以Ct值（对数PCR图穿过计算阈值线的循环数）获得，并用于确定ΔCt值，作为基因表达的原始数据。基因表达的倍数变化通过从各自的对照样品中减去处理细胞的ΔCt值来确定。然后使用所得的ΔΔCt值根据表达式2计算基因表达的倍数变化ΔΔCt表中总结了使用的引物序列​表22.

表2

引物序列。

基因前轮驱动卢比
18秒CATGATTAGAGAGAGCGGC公司TTCAGCTTGCAACCATACTC公司
白介素-6AGTTGCCTTCTTGGGACTGA公司GGTAGCATCCATCATTTTTTA公司
CCL-2型AGAAGTCATAGCACTCTCAAGG公司TGAACTCTCAGAGCGAGG公司
VCAM-1型GGAGACCTGTCACTGCAACTG公司TCCATTTCACCACTGTGTAACC公司
ICAM-1公司AGACACAAGCAAGAAGACACA公司TGACCAGTAGAGAACCCTCG公司
BGLAP公司GCTCTGTCTCTCTGACCTCACA公司TAGATGCGTTGTAGGCGG公司
CD68型GCTTCTGCTGTGGAAATGC公司GGTAGTTGATTGTGTCTGC公司
第4页GATTGTGAGTTCAGTGAGCC公司TTCATAGGTCCTGTTGTCTG
CD248型GCCAGCAGATGTGTGTCAAGTAGGTGCCAGCATAGAT公司

免疫组织化学

对无火焰对照组和炎症K/BxN踝关节的同窝婴儿进行CD248和纤维连接蛋白表达的免疫组织化学评估。简言之，在EDTA中脱钙后，切割石蜡包埋切片，并用纤连蛋白1:400（F3648，Sigma-Aldrich，Castle Hill，NSW，Australia）或CD248 1:400染色(PAB13304型，Abnova，台北市，台湾）初级抗体。生物素化的抗兔免疫球蛋白（Vectastatin ABC试剂盒，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）用作第二抗体。用于过氧化物酶的DAB底物试剂盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）用于显色剂开发。样品用吉尔苏木精复染。

IL-6酶联免疫吸附试验

根据制造商的说明（英国阿宾顿研发系统），使用商用夹心ELISA法测量培养细胞上清液中的IL-6水平。数据表示为pg IL-6/1×105细胞。

统计分析

数据报告为单独的小鼠幼崽细胞培养物的重复平均值的平均值±标准误差（SE）。使用SPSS数据编辑器（SPSS Inc.，Santa Clara，CA，USA）进行方差的单向方差分析。

结果

FLS文化特征

为了描述特征，只使用了在培养中存活并在第四代之后积极增殖的细胞。K/BxN FLS表现出典型的纺锤形成纤维细胞表型，当融合时形成平行簇（图​（图1a）。1a个). 通过定量PCR对细胞进行分析，发现脯氨酰4-羟化酶（一种纤维母细胞胶原合成所需的酶，以前被证明是一种有效的FLS标记物）的mRNA显著表达[34])以及本研究中使用的三个K/BxN FLS系中的滑膜成纤维细胞表面标记物CD248（图​（图1b，1亿，其他文件1). 相反，成骨细胞产物骨钙素和巨噬细胞标记物CD68的mRNA表达完全缺失。当通过免疫组织化学分析时，>98%的FLS对间质间质标志物纤维连接蛋白和滑膜成纤维细胞表面标志物CD90.2和CD248呈阳性染色（图1小时). 相反，只有不到2%的细胞对内皮标记物CD31或巨噬细胞标记物CD68呈阳性染色（附加文件2). 对FLS侵入行为的检查表明，无火焰对照FLS和K/BxN FLS都通过基质涂层插入物迁移（图​（图1i）。1个). 播种前用TNF-α预处理24小时，导致穿过基质凝胶插入物的K/BxN FLS侵入增加（con，2.16%±0.5 vs.TNF-；P（P）= 0.06). 对钙粘蛋白-11的PCR分析证实，当归一化为看家基因18S（WT-con-FLS，4.08±0.24；K/BxN-FLS，4.38±0.34ΔCt；NS）时，WT对照组和K/BxN-FLS组在22个周期内均呈阳性mRNA表达，各组间无显著差异（图​（图1j）。1日). 与TNF-α预孵育24小时后，未观察到钙粘蛋白-11 mRNA表达的差异（附加文件三).

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FLS培养的验证.（a）观察到K/BxN（成纤维细胞样滑膜细胞）FLS的融合单层在体外放大10倍。（b）在一个无火焰对照FLS野生型（WT）、三个K/BxN FLS系（FLS 1至3）、初级颅骨成骨细胞（OBs）和巨噬细胞系RAW 264.7（MΦ）中，通过标准RT-PCR在35个周期测定18S、P4H、CD248、骨钙素（OCN）和CD68的mRNA表达。CD248（蓝色）、CD90.2（品红色）和纤连蛋白（红色）在非炎症FLS中的表达（c、e、g）和K/BxN FLS（d、f、h）共聚焦荧光免疫组化检测。（i）在存在或不存在TNF-α（ng/ml）的情况下，相对于未经处理的非燃烧对照FLS，经基质涂层的跨腔插入物的FLS侵入。（j）家政基因18s钙粘蛋白-11的ΔCt mRNA表达正常。所提供的数据来自三个单独的WT对照FLS和三个K/BxN FLS，在加载25ng的用于RT-PCR的mRNA后。对于图1 c-h，所示结果代表了三条单独的K/BxN FLS线。图1b已裁剪，以便呈现多个凝胶。

CD248和纤维连接蛋白表达体内

为了更好地确定CD248和纤维连接蛋白作为FLS识别标记物的使用，我们通过免疫组织化学染色评估了无火焰对照和炎症K/BxN关节的组织定位。CD248在无火焰对照小鼠关节内的滑膜染色相对较弱，阳性染色细胞很少（图​（图2a）。2a个). 相比之下，炎症K/BxN关节滑膜的CD248染色与非炎症对照组相比显著升高（图2b、c). 同样，纤维连接蛋白阳性基质细胞在非炎症对照关节中基本上不存在，但在K/BxN炎症关节滑膜中其表达升高（图2d、e、f).

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滑膜CD248和纤连蛋白的表达体内脱钙石蜡包埋关节切片进行CD248和纤维连接蛋白染色，并用吉尔苏木精复染。在无火焰对照中检查染色（a、d）和发炎的K/BxN（b、e）接头。（c、f）放大后显示K/BxN关节滑膜发炎。黑色箭头分别表示CD248和纤维连接蛋白阳性染色。棒材=100μm。

成纤维细胞炎症基因表达

我们检测了促炎细胞因子IL-6、趋化因子CCL-2以及表面标记物VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达，以获得从K/BxN小鼠分离的FLS炎症特征的基本测量值。结果显示，在对照野生型小鼠（WT对照FLS）中，相对于从正常关节分离的FLS的折叠变化可以更好地评估炎症标记物的基础激活。K/BxN FLS中IL-6、CCL-2和VCAM-1的基础表达显著高于WT对照FLS（IL-6，3.6±0.25倍；CCL-2，11.2±0.28倍；VCAM-1，9±0.1倍；P（P）<0.05），而ICAM-1无差异（图3a、b、c、d). 与未经治疗的对照组相比，抗炎糖皮质激素皮质酮治疗后，IL-6和VCAM-1的表达均显著降低（IL-6，5.3±0.04倍；VCAM-1，3.3±0.07倍；P（P）<0.05），导致CCL-2表达下降（1.9±0.9倍；P（P）=0.09）（图3a、b、c、d). K/BxN FLS中IL-6、VCAM-1和CCL-2的这些降低导致它们的表达与在未治疗的WT对照FLS中观察到的相当。

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皮质酮和TNF-α对FLS炎症基因的调控实时RT-PCR测定FLS（成纤维细胞样滑膜细胞）炎症基因mRNA表达的折叠变化。在皮质酮预处理后16小时，测定IL-6、趋化因子配体2（CCL-2）、血管细胞粘附分子1（VCAM-1）和细胞间粘附分子1的mRNA表达（a-d）（100 nmol/l）或TNFα（e-h）（10 ng/ml）持续24小时。对看家基因18S rRNA水平的数据进行标准化，并显示为相对于未经处理的野生型（WT）对照FLS的表达变化倍数（±标准误差）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001与各自未经治疗的对照组相比#P（P）>0.05与未经处理的WT对照FLS。结果显示为三条独立FLS线和两条WT控制FLS线的组合副本。

与未经治疗的WT对照FLS相比，WT对照FLS和K/BxN FLS对促炎细胞因子TNF-α的反应均显著增加（IL-6，40.8±2.8倍；CCL-21332.2±362.2倍；VCAM-1，25.3±2.6倍；K/BxN FLS中ICAM-1，13.8±2.4倍；P（P）<0.05）（图3e、f、g、h). 相对于WT对照组FLS的增加，K/BxN FLS中IL-6和CCL-2的增加明显更大（IL-6，3.45±1.3倍；CCL-2，5.7±1.4倍，而WT对照FLS中TNF-α的诱导；P（P）< 0.05).

FLS中IL-6表达的调控

检测IL-6 mRNA表达对促炎细胞因子、TNF-α和抗炎糖皮质激素、皮质酮的反应。对两种FLS品系的时程分析显示，TNF-α（10 ng/ml）在8到24小时之间以及皮质酮（100 nmol/l）在8和16小时之间的最大反应（附加文件三). 因此，本研究中的所有实验均将治疗时间定为16小时。在两条FLS线中进行了剂量反应实验（图4a、b). TNF-α导致IL-6 mRNA表达在1 ng/ml时显著增加（3.9±0.41倍；P（P）< 0.05). IL-6 mRNA表达继续以剂量依赖性的方式增加，直至研究中使用的最大超生理剂量为25 ng/ml（8±0.23倍；P（P）< 0.001). 皮质酮治疗导致IL-6 mRNA表达的剂量依赖性降低，在10 nmol/l时显著降低（1.9±0.04倍；P（P）<0.05），最大抑制浓度为100 nmol/l（11.1±0.02倍；P（P）< 0.05). 对于本研究中的所有实验，TNF-α和皮质酮治疗分别固定在10 ng/ml和100 nmol/l。

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FLS中IL-6的调节用RT-real-time-PCR测定K/BxN小鼠分离的（成纤维细胞样滑膜细胞）FLS中IL-6 mRNA表达的剂量-反应分析（a）皮质酮（0、1、10、100、500、1000 nmol/l）或（b）肿瘤坏死因子α（0，0.1，1，5，10，25纳克/毫升）。（c）实时RT-PCR测定野生型（WT）对照FLS、C2C12、MC3T3-E1和K/BxN FLS中IL-6 mRNA表达的折叠变化。所有mRNA数据均按看家基因18S rRNA的水平进行了标准化，并呈现为相对于未处理对照组或未处理WT-con-FLS的表达折叠变化（±标准误差）。（d）通过特异性ELISA测定白细胞介素-6在WT-con-FLS、C2C12、MC3T3-E1和K/BxN-FLS培养基中的分泌（pg/ml/100000细胞，±标准误差）。在对照组TNFα（10 ng/ml）或皮质酮（100 nmol/l）治疗后16小时收集mRNA和条件培养基*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001与各自未经治疗的对照组相比#P（P）与未经处理的WT对照FLS相比，<0.05。剂量反应实验是两个K/BxN FLS的组合副本。所有其他数据是三个单独的FLS系、两个WT对照FLS系、两个C2C12重复和两个MC3T3-E1重复的组合重复。

为了检测从炎症组织中分离的FLS的炎症表型与从非炎症组织以及未分化和部分分化的间充质细胞系中分离的细胞之间的比较，我们建立了一个观察IL-6在一系列细胞类型中表达的治疗组。这些包括从对照小鼠正常关节分离的FLS，以及未分化的肠系膜前体细胞系C2C12和部分分化的成骨细胞系MC3T3E-1。在mRNA水平上，WT对照组FLS、C2C12和MC3T3-E1具有相似的IL-6基础表达（图​（图5c）。5厘米). 与未经治疗的WT对照组FLS相比，所有品系均显著增加了IL-6的表达，以应对促炎细胞因子TNF-α（WT对照FLS，11.8±2.7倍；C2C12，15.6±1.3倍；MC3T3-E1，11.4±1.2倍；P（P）< 0.01). 皮质酮治疗导致MC3T3-E1细胞系中IL-6 mRNA表达显著降低（与未治疗对照组相比为5.1±0.05倍；P（P）<0.05），而在WT对照FLS或C2C12中未观察到显著降低。与这些细胞系相比，从炎症组织中分离出的K/BxN FLS的IL-6 mRNA基础表达显著升高。同样，用TNF-α治疗K/BxN-FLS，与其他细胞系相比IL-6 mNA表达显著上调（与未治疗的WT对照FLS相比增加40.8±2.8倍；P（P）< 0.001). 与未经治疗的对照组相比，皮质酮治疗显著降低了K/BxN FLS中IL-6 mRNA的表达（6.7±0.1倍；P（P）< 0.01). 这与WT对照FLS中观察到的水平相当。

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炎症标记物对长时间培养的调节成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中炎症基因mRNA表达的倍数变化，通过实时RT-PCR在第2代和第8代（P2至P8）之间测定。在16小时时测量mRNA的表达（a）IL-6，（b）趋化因子配体2（CCL-2），（c）血管细胞粘附分子1（VCAM-1）和（d）细胞间粘附分子1（ICAM-1）。对每个基因的产品数据进行归一化处理，以获得管家基因18S rRNA的水平，并表示为相对于P2对照的表达变化倍数（±标准误差）*P（P）与第2段相比，<0.05#P（P）与第3段相比，<0.05。显示的结果是两个K/BxN FLS的组合副本。

WT对照组FLS、MC3T3-E1和K/BxN FLS的IL-6分泌到培养基中的模式非常相似（图​（图5d）。5天). WT对照组FLS、C2C12和MC3T3-E1的基础表达无显著差异（47.6±2.3、51.3±5.4和39.7±9.4 pg/ml/1×10）5细胞；NS）。与WT对照组FLS、C2C12和MC3T3-E1细胞相比，K/BxN FLS的IL-6基础产生量显著增加（169±29.7 pg/ml/1×105细胞；P（P）< 0.05). 与未经治疗的对照组相比，观察到所有品系的IL-6分泌均显著增加（WT对照组FLS，338±39.4；C2C12 194±10.2，MC3T3-E1，285.9±122；K/BxN FLS，886.9±378.3 pg/ml/1×105细胞；P（P）< 0.05). K/BxN FLS的诱导作用明显大于WT对照FLS和MC3T3-E1细胞的诱导作用(P（P）< 0.05). 皮质酮治疗对WT对照组FLS或MC3T3-E1细胞的IL-6分泌无显著影响，但导致K/BxN FLS和C2C12显著降低（K/BxN:Con，169±29.7 vs皮质酮，79.5±71.3 pg/ml/1×105细胞；P（P）< 0.05).

进行性继代培养的炎症基因表达

为了评估炎症基因随时间的维持，我们从第二代和第八代之间的一个具有代表性的FLS培养物中收集了两份mRNA（图5a、b、c、d). 在这些时间点上评估IL-6、CCL-2、VCAM-1和ICAM-1。在培养基中，IL-6、CCL-2和VCAM-1在第三代与第二代相比急剧下降（IL-6，4.3±0.3倍；CCL-2，7.1±0.05倍；VCAM-1，1.7±0.02倍，P（P）< 0.05). IL-6 mRNA的表达在这一点之后一直保持稳定，直到第八代。同样，CCL-2、VCAM-1和ICAM-1的表达在第三代至第七代后保持稳定，第八代的表达相对于第三代显著下降（CCL-2，15.3±0.01倍；VCAM-1，3.01±0.03倍；ICAM-1，7.1±0.01倍于第三代；P（P）< 0.05). 巨噬细胞标志物CD68的表达在第三代之后也显示出显著下降（附加文件三).

讨论

成纤维细胞样滑膜细胞在炎症性关节疾病的基质环境中起着关键作用，并且是关节破坏和持续炎症的介质[26，35，36]. 迄今为止，利用从接受关节置换术患者的滑膜组织中分离出的人类FLS进行了广泛的研究。这些细胞在多种疾病状态下都有很好的特征，包括类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、青少年发作性关节炎和晶体关节病[34，37]. 相反，尽管越来越多地使用从小鼠炎症模型中分离的FLS，但对小鼠FLS的类似彻底表征仍有待进行。在本研究中，我们成功地从K/BxN小鼠中分离出FLS，并表征了多种炎症标记物。根据多种标准对细胞进行表征，以提供对其来源和纯度的最佳确认。这些包括一般基质成纤维细胞标记物，如纤维连接蛋白和脯氨酸4-羟化酶[38]和更特异的FLS标记，如CD90.2[39，40]和CD248[41]. CD90.2单独对多种细胞类型进行染色，包括胸腺细胞群、神经元、上皮细胞和成纤维细胞亚群[42]. 相比之下，CD248已被证明是一种相当有选择性的标记物，存在于炎症损伤、淋巴组织、胎儿组织和肿瘤等增殖组织中的基质成纤维细胞和周细胞中[43-45]. 特别有趣的是，与健康对照组相比，有报道显示类风湿和银屑病滑膜组织的FLS和周细胞中CD248表达升高[41]. 我们在炎症K/BxN关节滑膜内观察到类似的结果，与非炎症对照组相比，CD248和纤维连接蛋白阳性细胞的表达更高。炎症滑膜中CD248和纤维连接蛋白的相关性以及在我们的在体外细胞培养强烈表明这些细胞来源于该组织。然而，CD90.2、CD248与脯氨酰4-羟化酶和纤维连接蛋白的结合表明这些细胞是真正的FLS。有趣的是，我们发现CD248在我们的无火焰对照FLS中表达。尽管该标记在健康对照组滑膜中的表达显著降低，但我们无法通过免疫荧光法确定非炎症性和炎症性FLS之间的表达差异。流式细胞术对不同组CD248表达的分析可以更好地测量相对表达的差异，并使我们能够更好地区分异位淋巴结构中的CD248-阳性细胞。然而，积极培养无火焰对照FLS的过程本身可能诱导CD248表达，在增殖组织的基质细胞中观察到CD248升高。我们希望用这种方法分离的FLS更好地解决的最后一个问题是，它们是否代表内膜或内膜下FLS人群。通过一些特征明确的标记物，可以将内膜FLS与内膜下成纤维细胞区分开来。其中包括尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDPGD）、表面标记物VCAM-1和钙粘蛋白-11的高表达[46，47]. 对钙粘蛋白-11和VCAM1的mRNA分析证实，这两个标记物在无火焰和炎症的K/BxN FLS培养物中均高表达。虽然这些发现并没有消除内膜下成纤维细胞污染的可能性，但它们确实表明我们的培养物主要是内膜。更严格的方法是对这些细胞进行钙粘蛋白-11和UDPGD染色，以评估其纯度。最后，作为FLS培养物特征的一部分，我们能够证明，使用Boyden腔方法，使用PDGF作为化学引诱剂，这些细胞能够通过基质凝胶膜迁移。TNF-α的存在进一步增强了这一作用。FLS侵入软骨的能力是从类风湿关节炎患者分离的炎症滑膜成纤维细胞的一个明确特征[15]. PDGF和TGF-α被认为是成纤维细胞迁移和侵袭行为的有力刺激物[48]. 进一步研究小鼠FLS特性的实验可能会更仔细地检查它们对这些分泌因子的反应。

使用这些特性良好的FLS培养物，我们生成了一个炎症基因集，重点关注IL-6、CCL-2、VCAM和ICAM-1。这些细胞因子、趋化因子和粘附分子被认为在RA和炎症疾病的病理学中起着重要作用[17-22，49]。

在人类RA和骨关节炎（OA）FLS培养物中，相对于从非炎症组织（如真皮和骨髓成纤维细胞）中分离的成纤维细胞，这些标志物的表达升高[35]. 我们的FLS培养反映了这些发现，与从非炎症滑膜分离的成纤维细胞相比，炎症标记物的表达更高。这表明这些细胞是与人类疾病相关的有用模型。同样，糖皮质激素能够消除这些升高的炎症标记物，将其表达降低到与其他间充质细胞系相匹配的水平[25]。

RA滑膜中TNF-α表达高度上调[25，26，35]并调节促炎细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）[50，51]. 特别是，其重要性已通过TNF-α消耗抗体在RA治疗中的疗效得到证明[52]. 在这项研究中，我们检测了小鼠FLS中的一组关键炎症基因。对于TNF-α，所有标记物均显著增加。与非炎症关节相比，从炎症组织分离的FLS中IL-6和CCl-2的增加更大[35]. 相比之下，VCAM-1和ICAM-1在从炎症组织和非炎症组织分离的FLS中显示出相似的TNF-α诱导作用。这些数据表明，炎症环境在小鼠FLS上引发的持续变化似乎指向IL-6和CCL-2介导的单核细胞群体的全身或局部化学吸引作用。FLS衍生的IL-6具有重要意义，因为这种细胞因子已被证明在RA中驱动辅助性T细胞（Th）17的分化和激活[21，22]. 因此，这些数据表明，K/BxN关节炎可能存在类似的机制。FLS分泌IL-6的方式与mRNA表达的变化相同。这些数据突出了IL-6作为有效标记物的使用，反映了我们在整体炎症基因集中的结果。事实上，在多种细胞类型中，包括未分化间充质细胞系C2C12、部分分化成骨细胞系MC3T3-E1和对照FLS分离的非燃烧FLS，与从炎症关节分离的FLS相比，IL-6水平都显著降低。当然，与其他间充质细胞系相比，K/BxN FLS对TNF-α具有更大的反应能力，证实这些细胞保持激活的炎症表型。

由于基础IL-6在K/BxN FLS中的表达相对较高，并且对促炎和抗炎干预均敏感，我们得出结论，该细胞因子可能是小鼠FLS炎症激活的有用标记。皮质酮和TNF-α对IL-6 mRNA表达的时间过程分析和剂量反应表明，在生理范围和/或炎症组织中，IL-6 mRNA表达随时间和剂量发生变化[53]. 本研究的发现有助于选择合适的剂量和时间点，以便使用小鼠FLS进行读数。

我们还研究了长时间培养FLS中炎症表型的稳定性。我们的数据表明，在第四代之前的原代培养物中存在显著的巨噬细胞污染。从这一点开始，所有被检测的炎症基因在第七代之前都保持稳定。在第七代之后，一些炎症基因的表达开始显著下降。因此，基于这些数据，我们建议在第四代和第八代之间使用小鼠FLS。这些发现与在人类FLS中观察到的亚培养活力非常相似。

除了胶原酶和在体外本文采用FLS分离培养法，其他几种方法已成功应用于人滑膜成纤维细胞培养。特别令人感兴趣的是CD14阴性选择方法，其中使用磁珠从培养物中去除滑膜巨噬细胞[34]. 这可以进一步与CD90.2阳性选择结合，以产生更纯的FLS群体。这样做的优点是可以在FLS培养的早期去除许多主要的污染细胞类型，从而不需要长时间的继代培养和在体外扩展，可能提供更具代表性的细胞群体内滑膜成纤维细胞。K/BxN小鼠的未来研究可能会利用该方法来比较和改进从炎症滑膜分离的FLS的特征。使用滑膜碎片直接进行FLS培养也证明了分离人类炎症疾病的可行方法。不幸的是，由于小鼠关节内炎症滑膜的数量减少，这种方法在小鼠炎症模型中更加复杂。

小鼠FLS的使用有助于描述炎症性骨丢失的机制。其中包括Wei的观察结果等。和李等。证明前炎症介导的信号可以通过FLS诱导RANKL分泌，增加破骨细胞活性[9，11]. 最近，迪亚拉的开创性工作等。已确定炎症前NFκ-B信号在小鼠FLS增加DKK-1分泌、干扰成骨细胞成熟中起重要作用[10]. 更多的研究关注FLS在炎症疾病病理生理学中的作用，探索其对白细胞激活和驱动炎症过程的作用[54-56]. 重要的是，专注于炎症模型中小鼠FLS培养的工作为滑膜细胞存活、迁移、增殖以及人类FLS介导疾病中关节破坏的作用提供了更深入的见解[57-60]。

通过检测K/BxN FLS中的多个促炎基因，我们创建了一个可用于识别这些细胞的炎症基因集在体外这些信息也为研究这种情况如何受到各种促炎和抗炎干预措施的影响提供了一个基准。这将有助于建立一个正常的标准图谱，用于比较从转基因小鼠中分离的FLS。我们检测了从K/BxN小鼠炎症模型中分离的FLS。这有一个优点，即为我们提供了来自长期暴露于炎症的组织的细胞，反映了人类炎症性关节病（如RA）的情况。令人鼓舞的是，在小鼠FLS中观察到的炎症基因表达与人类FLS培养物中的表达非常相似，与之前报道的TNF-α和糖皮质激素皮质酮的反应方式相同[25]. 此外，这些标记物的保存方式与人类长期培养的方式相同[25，34]. 因此，这些数据支持在正在进行的炎症机制研究中使用这些细胞，在炎症机制中，小鼠和人类之间的差异可能是常见的。目前尚不清楚此处分离的K/BxN FLS与从其他炎症模型（如胶原抗体诱导性关节炎（CAIA）和抗原诱导性关节病（AIA））分离的FLS相比如何。在人类疾病中，FLS在OA和RA等疾病状态之间具有不同的炎症特征和反应。因此，未来的研究可能会受益于在一组炎症小鼠模型中FLS的类似特征。

结论

成纤维细胞样滑膜细胞在炎症疾病的病理生理学中起着关键作用。在本研究中，我们对通过胶原酶消化K/BxN炎症小鼠模型滑膜组织分离的FLS进行了表征。这些细胞对促炎和抗炎刺激有反应，并以与人类FLS培养中相似的方式表达基质和炎症标记物。因此，本研究提供了表征和培养指南，以支持小鼠FLS建模人类炎症疾病的不断发展。

缩写

AIA：抗原诱导性关节炎；BGLAP：骨γ-羧基谷氨酸蛋白；BSA：牛血清白蛋白；CAIA：抗体性关节炎；CCL-2：趋化因子配体2；DMEM：Dulbecco改良的Eagle介质；ELISA：酶联免疫吸附试验；FBS：胎牛血清；FLS：成纤维细胞样滑膜细胞；GM-CSF：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；ICAM-1：细胞间黏附分子1；IgG：免疫球蛋白G；IL：白细胞介素；PDGF：血小板衍生生长因子；OA：骨关节炎；RA：类风湿性关节炎；RANKL：核因子κB（NFκ-B）配体受体激活剂；逆转录聚合酶链反应；Th:T助手；TNF-α：肿瘤坏死因子α；UDPGD：尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶；VCAM-1：血管细胞粘附分子1；WT：野生型。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

RSH获得了最初的原代培养物、培养的细胞、提取和分析RNA，并共同撰写了原稿。CH保持细胞培养并进行ELISA分析。YL提取并分析mRNA。SS对动物进行基因分型。JT管理动物处理并确定临床评分。SG进行免疫组化。CFY进行基质凝胶侵入试验。PMS、KR、MSC、MSJ和HZ提出了最初的假设。MJS、MSC和HZ共同编写和分析数据。所有作者阅读并批准了最终手稿。

补充材料

附加文件1：

未编辑的mRNA凝胶图像.未经编辑的凝胶，用于在一个无火焰对照FLS（野生型）、三个K/BxN FLS系（FLS 1至3）、初级颅骨成骨细胞（OBs）和巨噬细胞系RAW 264.7（MΦ）中通过标准RT-PCR在35个周期测定18S、脯氨酰4-羟化酶（P4H）、CD248、骨钙素（OCN）和CD68的mRNA表达。

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附加文件2：

CD31和CD68染色阳性对照图像共聚焦免疫荧光法测定K/BxN成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）培养物中CD31（蓝色）的表达，免疫组织化学法测定小鼠肺中CD68的表达，共聚焦免疫萤光法测定K/BxN FLS和RAW CD68+ve细胞中CD68（红色）的表达。细胞核被复染为绿色。所示图像代表三个单独的FLS细胞系。

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附加文件3：

CD68、钙粘蛋白11和IL-6的mRNA表达.（a）实时RT-PCR测定第3代和第4代K/BxN成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）巨噬细胞表面标记物CD68 mRNA表达的折叠变化。对每个基因的产品数据进行归一化处理，以获得管家基因18S rRNA的水平，并表示为相对于P2对照的表达变化倍数（±标准误差）。显示的结果是两个K/BxN FLS的组合副本。（b）以10 ng/ml的浓度用载体或TNF-α处理16小时后，三个单独的野生型非燃烧细胞系和三个K/BxN FLS细胞系中钙粘蛋白11的mRNAΔCt值。（c）皮质酮（100 nmol/l）或TNF-α（10 ng/ml）治疗后0、2、4、8、16和24小时内IL-6 mRNA表达的折叠变化。显示的结果是三条独立FLS线的组合副本。对看家基因18S rRNA水平的数据进行了标准化，并将其表示为相对于0小时对照组的表达倍数变化（±标准误差）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001与各自未经治疗的对照组相比。

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致谢

我们感谢Mamdouh Khalil及其员工对动物的出色照顾。我们还感谢欧洲生物研究中心提供KRN小鼠。这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（National Health and Medical Research Council，Australia）向HZ、MJS、PMS和MSC提供的项目拨款632818的支持。RSH获得了英国关节炎研究所的支持（参考号19552）。

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文章来自关节炎研究与治疗由以下人员提供BMC公司