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致癌物。作者手稿；PMC 2014年7月30日发布。
以最终编辑形式发布为：
致癌物。2014年1月30日；33(5): 556–566.
2013年1月28日在线发布。 数字对象标识：1038年10月10日/2012.635年1月1日
预防性维修识别码：项目经理3918885
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院550043
PMID：23353822

肿瘤抑制因子Rb对谷氨酰胺代谢的控制

米里亚姆·R·雷诺兹,1,2,5 安德鲁·莱恩,1,6 布赖恩·罗伯逊,1,5 沙林肯普,1,5 刘永清,三，5 布拉德福德·G·希尔,1,2,4 道格拉斯·C·迪恩,2,三，5和布赖恩·F·克莱姆1,2,5,*
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摘要

视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白是一种在大多数人类癌症中失调的肿瘤抑制因子。Rb部分通过直接禁用细胞周期促进转录因子E2F家族来抑制细胞周期进展。因为从头开始细胞周期进展需要合成多种谷氨酰胺衍生的合成代谢前体，我们假设Rb也可能直接调节参与谷氨酰胺代谢的蛋白质。我们检测了从所有三个Rb家族成员（Rb-1、Rbl1和Rbl2）都有三重敲除基因（TKO）的小鼠中分离出来的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的谷氨酰胺代谢，发现整体Rb功能的丧失导致13部分通过上调谷氨酰胺转运体ASCT2的表达和谷氨酰胺酶1（GLS1）的活性，C-谷氨酰胺摄取并并入谷氨酸和TCA循环中间产物。Rb-controlled transcription factor E2F-3通过直接调节ASCT2 mRNA和蛋白表达来改变谷氨酰胺摄取，并且观察到E2F-3与ASCT2启动子相关。接下来，我们研究了谷氨酰胺摄取和利用增加所观察到的功能后果，发现谷氨酰胺暴露会显著增加耗氧量，而谷氨酰胺剥夺会选择性降低Rb TKO MEF中的ATP浓度，但不会降低WT MEF。此外，TKO MEF表现出外源性谷氨酰胺产生的谷胱甘肽增加，并且相对于WT MEF，γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶的表达增加。重要的是，Rb TKO MEF的增殖需要向谷氨酰胺利用的代谢转变，而WT MEF则不需要。最后，向Rb TKO MEF中添加TCA循环中间产物α-酮戊二酸，可以逆转谷氨酰胺剥夺对ATP、GSH水平和生存能力的抑制作用。总之，这些研究表明，Rb/E2F级联直接调节肿瘤生长所需的主要能量和合成代谢途径。

关键词：视网膜母细胞瘤蛋白、代谢、谷氨酰胺、癌症、肿瘤抑制剂

介绍

肿瘤细胞的特点是不受控制的增殖，这取决于它们增加细胞新陈代谢的能力，以产生ATP，并减少能力，以驱动细胞分裂所需的大分子合成(1). 几十年来，人们对代谢失调进行了广泛的研究，主要关注肿瘤细胞激活有氧糖酵解的能力(2–5). 这种代谢变化最终导致乳酸的糖酵解通量增加，TCA循环和其他下游生化过程的葡萄糖碳可用性降低。因此，肿瘤细胞需要谷氨酰胺等营养源来补充TCA循环中维持细胞快速分裂所必需的回补碳(6–8). 在肿瘤细胞中，谷氨酰胺碳被用于线粒体TCA循环、谷胱甘肽合成和脂肪酸生成(6,9–12). 重要的是，谷氨酰胺限制或谷氨酰胺分解酶抑制剂会降低细胞增殖在体外和体内(7,13–15). 虽然两者都是原癌基因MYC公司肿瘤抑制因子p53被发现有助于控制谷氨酰胺的摄取和谷氨酰胺的分解，而人类癌症中谷氨酰胺代谢的精确调控尚不完全清楚(6,16–20). 肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）是参与细胞周期调节的几种转录因子的主调节因子，但Rb口袋蛋白参与谷氨酰胺代谢尚不清楚。

Rb转录因子家族（Rb-1、Rbl1和Rbl2）具有多个相互关联的靶基因，这些靶基因在细胞周期调节器上聚合。由于细胞周期蛋白依赖性激酶的突变或失活过度磷酸化导致Rb家族功能的丧失是所有肿瘤的标志，了解Rb功能的全谱可能有助于识别可用于开发抗癌药物的蛋白质。经典观点认为Rb家族与E2F转录因子相互作用以调节细胞周期进程。Rb家族成员具有重叠和补偿功能，因此，所有三个Rb家族成员的基因组缺失（三重敲除，TKO）是成纤维细胞失去细胞周期控制所必需的(21,22). 除了在细胞周期控制中的作用外，Rb家族在培养和细胞接触抑制中调节细胞衰老，因此TKO MEF是不朽的，缺乏细胞接触抑制(21,22). 此外，Rb/E2F已被证明具有扩大的作用，包括潜在地将细胞增殖与某些生化途径联系起来（在(23)). 鉴于功能失调的Rb级联促进增殖控制的丧失，我们假设Rb途径也可能直接调节谷氨酰胺的摄取和转化为肿瘤细胞生长和生存所需的合成代谢前体。

在此，我们报道了Rb家族缺陷的成纤维细胞增加谷氨酰胺的消耗，以通过无修复维持线粒体功能，并维持细胞内谷胱甘肽的升高。重要的是，谷氨酰胺摄取增加是通过特定E2F家族成员对谷氨酰胺分解酶的直接活性介导的，而增强的谷氨酰胺分解是Rb-功能障碍细胞生长和存活所必需的。这些数据扩大了我们对肿瘤细胞操纵营养途径以促进增殖的机制的理解，并支持将谷氨酰胺代谢靶向Rb缺乏型肿瘤作为一种潜在的治疗策略。

结果

Rb家族缺失部分通过谷氨酰胺转运蛋白ASCT2和GLS1活性的表达增加谷氨酰胺摄取和转化为谷氨酸

Rb TKO细胞包含Rb家族三个成员（Rb1、Rbl1和Rbl2）的基因缺失，并表现出肿瘤细胞的几个典型特征，包括增强增殖和永生(22). 最初，我们检查了基底14Rb WT的C-谷氨酰胺摄取，Rb-1为零（Rb-1−/−)和Rb-TKO小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。鉴于Rb-1−/−细胞对谷氨酰胺的摄取增加了4倍，Rb-TKO细胞消耗了6倍以上14相对于Rb WT MEF的C-谷氨酰胺(图1a). 为了证实Rb-1在调节谷氨酰胺摄取方面的功能的特异性，在两个Rb-1中都重建了Rb-1−/−和TKO MEF(图1b&图S1a). 如所示图1b，Rb-1表达显著抑制两种细胞类型的谷氨酰胺摄取，而Rb-1的摄取−/−细胞相对减少到WT细胞中观察到的水平。这些数据表明，尽管Rb-1功能的丧失足以导致MEF中谷氨酰胺摄取量的显著增加，但Rbl1和/或Rbl2要么有助于抑制谷氨酰胺摄取，要么可以补偿Rb-1表达的丧失。重要的是，人类癌症中的常见突变可以抑制整个Rb家族(例如第16页INK4A（墨水）(24,25))因此，我们选择通过直接比较Rb WT和完全缺乏Rb的TKO细胞，继续研究Rb功能障碍的代谢效应。为了确定观察到的谷氨酰胺摄取增加是否是一个调节过程，我们检测了几种谷氨酰胺转运体的mRNA表达。谷氨酰胺转运体ASCT2和SLC38A5先前已在肿瘤组织中被证实升高，并且其表达已被证明受特定癌基因的转录调控(9,26). 在Rb TKO细胞中，与Rb WT细胞相比，只有ASCT2而不是SLC38A5的mRNA水平升高，并且发现在Rb-TKO细胞ASCT2蛋白表达增加了6倍(图1c). 与Rb-1在调节谷氨酰胺摄取中的功能作用一致，Rb-1的重新表达也导致ASCT2表达显著降低(图S1b). 对将谷氨酰胺转化为谷氨酸的谷氨酰胺酶（GLS）亚型的检测表明，GLS1 mRNA仅在MEF细胞中表达，但Rb家族的基因缺失并未导致GLS1转录水平的增加(图1d). 然而，蛋白质分析显示GLS1表达增加(图1d)表明谷氨酸解酶通过Rb途径进行转录和转录后调节。鉴于Rb TKO细胞中GLS1表达增加，我们预计这些细胞会将更多的谷氨酰胺转化为谷氨酸，从而产生更高水平的氨，氨是GLS1活性的另一产物。如所示图1e，新罕布什尔州4+TKO的排泄量明显高于WT MEF。为了确认这些结果并确定WT和TKO MEF中的特定谷氨酰胺代谢途径，我们使用[13C类5,15N个2]-谷氨酰胺（2D-NMR）。如所示图1f与WT MEF相比，TKO MEF将相对较多的细胞外谷氨酰胺转化为谷氨酸。总之，这些结果首次表明，Rb家族的基因缺失通过调节参与谷氨酰胺分解途径的特定酶，直接诱导谷氨酰胺的吸收和利用。

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Rb家族的缺失通过提高ASCT2表达和GLS1活性促进谷氨酰胺的摄取和转化为谷氨酸

a。野生型的谷氨酰胺摄取，Rb-1−/−TKO细胞通过14C-谷氨酰胺标记。数据表示为nmol/min/mg蛋白质。三种独立细胞制剂的三次重复测量的平均值±标准差*p<0.005.b。在Rb-1中测定谷氨酰胺摄取−/−Rb-1表达重建后的TKO细胞。数据表示为nmol/min/mg蛋白质。三种独立细胞制剂的三次重复测量的平均值±标准差*p<0.01.c。WT和TKO MEF之间ASCT2和SLC38A5的mRNA表达。对于ASCT2和SLC38A5比较，数据表示为WT水平设置为1的相对mRNA。WT和TKO MEF之间ASCT2的蛋白表达表示为WT水平设置为1的相对蛋白表达。对于蛋白质表达，显示了三个独立实验的代表性图像*p<0.01.d。对于GLS，mRNA水平与设置为1的WT GLS1的表达相关。对于mRNA，所示为三种独立RNA制剂的平均值±标准差。WT和TKO MEF之间GLS1的蛋白表达表示为WT水平设置为1的相对蛋白表达。对于蛋白质表达，显示了三个独立实验的代表性图像*p<0.01.e、。在WT和TKO细胞培养基中测定分泌氨水平。数据表示为nmol/min/mg蛋白质，显示为两个独立实验三次测量的平均值±标准差*p<0.005.f、。通过稳定同位素标记WT和TKO细胞，用[13C类5,15N个2]-谷氨酰胺，如方法中所述。所示为代表谷氨酸的峰的代表性二维核磁共振谱。这些盒子连接13谷氨酸的C卫星峰和指示的中心峰12C来自谷氨酸，不含13C、。

Rb家族缺失导致谷氨酰胺碳再补体升高和线粒体功能增强

为了确定谷氨酰胺碳在转化为谷氨酸后是否进入TCA循环，我们接下来进行了分析13C并入天门冬氨酸，天门冬胺酸由13C-标记草酰乙酸通过天冬氨酸转氨酶的活性。我们在Rb-TKO细胞中观察到63±4.2%的天冬氨酸碳来源于谷氨酰胺，而在Rb-WT细胞中只有29±2.4%被标记(图2a). 然而，在Rb TKO细胞或培养基中未观察到谷氨酰胺的乳酸标记（数据未显示），这表明这些细胞中苹果酸酶活性较低，谷氨酰胺碳优先代谢以补充TCA中间体。

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Rb通路缺失增加谷氨酰胺碳的TCA再补体并刺激线粒体代谢

a。通过稳定同位素标记WT和TKO细胞，用[13C类5,15N个2]-谷氨酰胺，如方法和图1所示为对应于天冬氨酸C2-C3和13C卫星。该模式表示通过Krebs循环的第一圈完全标记的天冬氨酸和在OAA与来自未标记葡萄糖的未标记乙酰辅酶a缩合后显示Krebs循环的第二圈的天冬氨酸的混合物，如图1.b。WT与TKO细胞中的稳态ATP水平。数据表示为pmol/mg蛋白质，显示为三个独立实验重复测量的平均值±标准差*p<0.01.c。O（运行）2在Seahorse XF 24分析仪上测量WT和TKO细胞的消耗量，并将耗氧率（OCR）归一化为蛋白质含量，数据表示为pmol/min/µg蛋白质。所示为两个单独实验的五个重复的平均值±标准偏差。ATP连接、最大（储备）和非线粒体O2分别通过添加寡霉素、FCCP和AA/鱼藤酮来测定组分*p<0.01.d。O（运行）2将外源性谷氨酰胺添加到WT和TKO细胞后测量消耗量。所示为基线耗氧量百分比（设定为100%）与两个独立实验的5个重复时间的函数关系。e、。使用线粒体或核特异性基因的引物，通过实时PCR测定WT和TKO细胞之间线粒体DNA与核DNA的相对数量。图中所示为四种不同细胞制剂中mtDNA/核DNA的比率，WT设置为1*p<0.005.

我们还测量了Rb-WT和Rb-TKO细胞的稳态ATP水平和耗氧率。Rb家族的缺失导致细胞内ATP水平升高1.8倍(图2b)基础O增加2消耗率(图2c). 此外，OCR的增加与ATP生成直接相关，与WT细胞相比，Rb TKO细胞的线粒体质子泄漏没有差异(图2c). 这些测量没有区分谷氨酰胺氧化对线粒体功能的贡献与其他碳前体的氧化，如葡萄糖或脂肪酸。为此，我们测定了在不含葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养的两种细胞类型的基线OCR，然后测量了OCR对添加外源性谷氨酰胺（最终浓度为4 mM）的反应。与WT MEF不同，Rb TKO细胞能够增强其O2补充谷氨酰胺的摄入，表明缺乏Rb功能的细胞可以通过TCA补充谷氨酰胺碳来增加线粒体代谢(图2d). 最后，值得注意的是，与Rb-WT细胞相比，Rb-TKO细胞中观察到的耗氧量和ATP水平的增加可能是线粒体数量增加的结果。然而，线粒体基因组分析表明，与WT细胞相比，Rb TKO细胞含有的线粒体明显较少(图2e). 总之，这些数据表明TKO细胞中的线粒体更加活跃，这可能是由于谷氨酰胺代谢的可用性和能力增加。

Rb家族缺陷导致活性氧生成增加和谷胱甘肽减少比率降低

由于Rb TKO细胞相对于Rb WT细胞表现出较高的线粒体功能，我们推测Rb缺失细胞中活性氧（ROS）的产生，如超氧物和过氧化氢，将显著增加。基于DCF荧光，与WT（13.5%）相比，TKO细胞（60.3%）对ROS形成呈阳性反应(图3a)Rb TKO细胞的平均荧光强度升高(图3b). 此外，TKO细胞中ROS生成率也增加(图3b). 为了确定这些细胞内线粒体ROS的产生，Rb WT和Rb TKO细胞都用MitoSOX标记，这是一种专门针对线粒体的ROS指示剂(27). 如所示图3c与Rb-WT细胞相比，Rb-TKO细胞产生的线粒体ROS明显更多。

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Rb-家族缺陷细胞的ROS水平升高，谷胱甘肽总量增加，GSH与谷胱甘苷总量的比值降低

a。测量DCF荧光的WT或TKO的代表性流式细胞术直方图。%阳性细胞是指染色细胞数超过未染色细胞数。b。通过FlowJo软件测定WT和TKO细胞之间的平均荧光强度（MFI）。数据表示为来自两个单独实验的重复测量的平均值±标准差*p<0.01通过测量作为时间函数的DCF荧光来确定整个WT或TKO细胞中ROS产生的速率。数据表示为相对FU/min/mg蛋白质，表示为三个独立实验中5个重复的平均值±标准差*p<0.01.c。线粒体特异性ROS指示剂MitoSOX染色WT和TKO MEF的MFI。数据表示为来自两个单独实验的三个重复的平均值±标准差。d。按照材料和方法中的描述测量总谷胱甘肽。数据表示为WT和TKO细胞之间的µg/mg蛋白质。所示为两个单独实验的三个重复的平均值±标准差。*p<0.005 e、。γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCLC）的蛋白表达。图中所示为来自三种独立细胞裂解液制剂的代表性图像，表达比率通过密度分析确定，WT表达设置为1。f、。GSH/总谷胱甘肽的比率按照材料和方法中的描述进行测量。数据表示为WT和TKO细胞之间GSH/总谷胱甘肽的比率。所示为两个单独实验的三个重复的平均值±标准差。p<0.01.

谷氨酰胺除了是TCA再补体的前体外，还是多细胞系统中谷胱甘肽生物合成的主要碳源(9,10). 为了确定Rb是否抑制谷胱甘肽的生成，我们首先测量了谷胱甘苷的总水平，发现Rb TKO细胞与WT细胞相比谷胱甘蛋白显著升高(图3d). 代谢组学分析进一步证实了这一点13C-谷氨酰胺，Rb TKO细胞标记的谷氨酰胺掺入GSH的量增加(图S2a&b). 我们还发现，这种增加可能部分由γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCLC）在Rb-TKO细胞中的高表达驱动，这是谷胱甘肽合成的速率限制步骤(图3e). 然而，TKO细胞内GSSG形成的增加导致Rb-TKO中还原性谷胱甘肽（GSH）到总谷胱甘苷的水平降低(图3f). 总之，这些数据表明，Rb缺乏细胞不仅可以增加谷氨酰胺代谢，为增强线粒体功能提供补充碳，还可以合成谷胱甘肽。

Rb功能障碍细胞的生长和存活依赖于谷氨酰胺代谢

我们的结果表明，Rb功能的丧失增强了线粒体代谢和谷胱甘肽生成的谷氨酰胺代谢，这是肿瘤细胞生长和生存所必需的两条途径。为了确定Rb WT与Rb TKO细胞对谷氨酰胺的相对依赖性，我们接下来在没有谷氨酰胺的情况下培养细胞，并在48小时内量化活细胞数。我们发现，即使在48小时后停止使用谷氨酰胺，Rb WT细胞的生长也相对不受影响，而Rb TKO细胞在缺乏谷氨酰胺的情况下无法存活和生长(图4a). 此外，虽然siRNA介导的ASCT2或GLS1抑制降低了谷氨酰胺摄取和NH4+WT和Rb TKO MEF中的分泌，只有Rb TKO细胞的生长受到负面影响(图S3). 这些结果进一步突出了这些酶的小分子拮抗剂在Rb缺乏肿瘤中作为抗癌药物的潜在用途。有趣的是，GLS1的抑制导致这些细胞对谷氨酰胺的摄取显著减少。虽然GLS1抑制能够减少谷氨酰胺摄取的机制尚不明确，但此前已观察到其他生化途径中初级代谢酶的抑制可抑制营养素摄取（例如，抑制HK2和胆碱激酶对葡萄糖和胆碱转运的影响）(28,29). 此外，为了支持对谷氨酰胺的需求，以维持高增殖的能量需求，谷氨酰胺的退出也导致稳态ATP水平快速下降（3小时），而在相同条件下，Rb-WT细胞的ATP水平在48小时前保持不变(图4b). 然后，我们在培养基中添加了细胞通透性α-酮戊二酸（α-kg），这是一种TCA循环中间产物，并观察到Rb-TKO细胞中ATP水平的显著降低以及谷氨酰胺撤除引起的细胞毒性(图5a&b). 此外，与谷氨酰胺是谷胱甘肽生物合成的主要碳源以及Rb TKO细胞增加谷氨酰胺碳并入GSH的观察结果一致(图S2)谷氨酰胺缺乏显著降低了谷胱甘肽水平，并导致Rb TKO细胞中细胞活性氧生成的总体增加(图5c–e). 已经报道了类似的观察结果，其中GLS1的小分子抑制导致淋巴瘤细胞中GSH水平降低和ROS水平增加(10). 然而，添加α-kg降低了ROS水平，并导致Rb-TKO细胞中GSH水平的部分恢复(图5c-e). 综合起来，我们的数据表明，Rb通路的缺失直接刺激谷氨酰胺的利用，以提供增强细胞分裂和存活所需的能量和大分子前体。

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Rb功能丧失导致细胞依赖谷氨酰胺维持细胞生存和生长以及维持细胞稳态ATP水平

WT和TKO细胞在无谷氨酰胺培养基中培养指定的时间段。a。台盼蓝染色后用血细胞计数仪计数活细胞数。数据表示为来自三个独立实验的三次重复测量的平均活细胞数±标准差*p<0.005 b条根据材料和方法中的描述，在WT和TKO细胞之间测定稳定状态的ATP。所示为两个不同实验三次读数的平均值±标准偏差*p<0.01.

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α-酮戊二酸钠在缺乏Rb家族细胞谷氨酰胺撤除期间拯救ATP生成、GSH水平和细胞存活

TKO细胞在无谷氨酰胺培养基中培养指定的时间段，添加或不添加7mM二甲基-α-酮戊二酸。a。台盼蓝染色后用血细胞计数仪计数活细胞数。数据表示为来自三个独立实验的三次重复测量的平均活细胞数±标准差*p<0.005.b条根据材料和方法中的描述，在WT和TKO细胞之间测定稳定状态的ATP。数据以µM/mg蛋白质表示，所示为两个不同实验三次读数的平均值±标准偏差*p<0.01.c。在完全培养基、缺乏谷氨酰胺的培养基或缺乏谷氨酰胺并添加α-KG的培养基中培养24小时的TKO MEF的代表性流式细胞术直方图。d。在没有或存在谷氨酰胺或α-KG的情况下培养的TKO MEF的平均荧光强度。数据以两个单独实验的三份读数的平均值±标准差表示*p<0.01.e（电子）在指定的培养基条件下培养24小时后，TKO MEF中的GSH水平。数据表示为不同条件下的相对谷胱甘肽水平，+GLN样本设置为1，所示为两个单独实验三次测量的平均值±标准差*p<0.005.

E2F家族成员在缺乏Rb功能的情况下调节谷氨酰胺代谢升高

已知Rb家族通过与E2F家族成员的直接相互作用负调控基因表达，Rb的功能是抑制E2F-1、2和-3的活性以转录激活下游靶基因(24). 为了确定这些E2F成员是否在没有Rb家族的情况下发生改变，我们检查了Rb-WT和Rb-TKO细胞之间每个成员的表达水平。TKO细胞中E2F-1和E2F-2 mRNA（数据未显示）和蛋白表达均显著升高，而E2F-3水平变化不大(图6a). 由于我们对Rb WT和Rb TKO细胞的分析检查了Rb功能障碍对谷氨酸分解的影响，我们试图确定这些E2F家族成员中是否有任何一个在调节Rb TKO细胞的这些变化中发挥作用。我们用E2F-1、-2和-3 siRNA转染细胞，并测量ASCT2和GLS1的表达。我们发现只有E2F-3基因敲除显著降低ASCT2的表达，而针对任何E2F成员的siRNA对GLS1水平没有影响(图6b). 这些结果并不令人惊讶，因为发现ASCT2而不是GLS1在缺乏Rb的情况下受到转录调控(图1b). 有趣的是，抑制E2F成员的表达揭示了对Rb TKO细胞谷氨酰胺消耗的不同影响，其中E2F-2和E2F-3分别减少了20%和35%的摄取，而E2F-1没有产生显著差异(图6d). 然而，E2F-1和E2F-3 siRNA降低了细胞增殖，而E2F-2抑制并没有显著改变Rb TKO细胞的生长(图6c). E2F蛋白对谷氨酰胺摄取和细胞生长的这些不同影响表明，它们对多种细胞途径的调节参与，无论是细胞周期还是代谢控制，或两者兼而有之，累积决定了它们对细胞增殖的影响程度。接下来，进行染色质免疫沉淀分析，以评估E2F对ASCT2基因表达的直接调节潜力。使用针对每个E2F家族成员的特异性抗体，观察到E2F-3与近端ASCT2启动子显著相关(图6e). E2F-1、-2和-3与已知靶基因启动子cdc2结合的ChIP分析(30)，以评估E2F与ASCT2启动子关联的特异性。如所示图6e在这些条件下，与cdc2启动子相关的所有三种E2F蛋白与E2F-1和E2F-3表现出最强的相互作用。此外，作为阴性对照，未发现E2F家族成员与GAPDH公司基因启动子(图6e)如之前在Rb TKO细胞中证明的E2F-1(31). 这些结果与我们的蛋白质和谷氨酰胺摄取分析相关，因为E2F-3单独抑制会降低ASCT2的表达，并对谷氨酰胺消耗产生显著影响。综上所述，这些结果表明，Rb途径通过特定E2F介导的靶基因转录（如ASCT2、，部分通过参与谷氨酰胺水解的蛋白质的未知替代调节机制（即转录后GLS1）(图7).

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E2F家族成员通过直接调节谷氨酰胺水解酶的表达促进无功能Rb细胞谷氨酰胺代谢

a。E2F-1、-2和-3在WT和TKO细胞中的蛋白表达。显示了三个独立实验的代表性图像，以及WT水平设置为1时相对蛋白质表达的密度测定分析*p<0.01.b。用E2F-1、-2或-3特异性siRNA瞬时转染TKO细胞，检测ASCT2和GLS1蛋白的表达。显示了三个独立实验的代表性图像，并将每个蛋白质相对表达的密度测定分析与非siRNA对照进行了比较，后者设置为1。c。在siRNA转染72小时后，台盼蓝染色后，通过血细胞计数仪测定活细胞数。每种情况下的数据均表示为相对活细胞数（平均值±标准差），而无siRNA对照组的数据设置为1*p<0.05.d。谷氨酰胺摄取量由14转染E2F-1、-2和-3 siRNA 72小时后，TKO细胞中的C-谷氨酰胺标记。数据表示为与无siRNA对照相比的谷氨酰胺相对摄取量（平均值±标准日），设定为1*p<0.01.e、。E2F-1、-2或-3与小鼠启动子的关联ASCT2，cdc2和GAPDH公司用染色质免疫沉淀分析法检测TKO细胞中的基因。使用启动子特异性引物对输入或洗脱的染色质进行实时PCR分析。数据表示为来自三种不同染色质制剂的每个基因的免疫沉淀染色质输入百分比。*p<0.005.

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Rb调节谷氨酰胺分解过程中不同节点的谷氨酰胺代谢

Rb途径通过E2F-3介导的谷氨酰胺转运体ASCT2的调节部分控制谷氨酰胺的消耗。在细胞内，谷氨酰胺具有多种下游生化命运，包括谷胱甘肽，作为TCA循环的补体碳，以及核苷酸和氨基酸。Rb级联可以通过调节γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCLC）的表达来调节谷胱甘肽的合成，这是谷胱甘肽生产的限速步骤。对于TCA缺失，谷氨酰胺在线粒体中通过另一种Rb家族调节酶谷氨酰胺酶1（GLS1）转化为谷氨酸，并可以作为α-酮戊二酸进入TCA循环。TCA中谷氨酰胺衍生的碳可进一步代谢为草酰乙酸以转化为其他氨基酸，或与丙酮酸中的乙酰辅酶a（AcCoA）结合以合成柠檬酸，后者是脂肪酸（FA）生产的前体。最终，通过调节葡萄糖和谷氨酰胺代谢，Rb途径可能不仅通过控制细胞周期进程，而且通过促进细胞分裂所需的能量和大分子的产生，有效地调节细胞生长。ASCT2：钠依赖性中性氨基酸转运蛋白2型；半胱氨酸：半胱氨酸；全日空航空公司4+：铵；GSH：还原型谷胱甘肽；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；TCA：三羧酸循环

讨论

在当前的研究中，我们发现所有三个Rb家族成员的基因组缺失导致部分通过谷氨酰胺转运体ASCT2和GLS1向谷氨酰胺代谢增强转变，进而导致细胞增殖和存活依赖谷氨酰胺。重要的是，Rb-1在Rb-功能障碍细胞中的重建降低了谷氨酰胺的摄取并抑制了ASCT2的表达。我们还发现Rb TKO MEF，而不是WT MEF代谢谷氨酰胺以增加线粒体功能、ATP生成和谷胱甘肽合成。此外，在Rb TKO细胞中观察到的ATP和ROS生成增加并不是由于线粒体质量增加，因为实时PCR分析显示线粒体与核DNA的比率降低(图2e)表明Rb TKO MEF中的线粒体更具代谢活性。这与之前关于正常分化脂肪细胞的报告形成对比，其中Rb-1基因缺失导致线粒体拷贝数显著增加导致能量消耗增加(32). 这种差异尚不清楚，但可能是由多种因素造成的，包括细胞类型以及Rb通路功能障碍的程度。总之，我们对Rb丢失和再表达的影响的分析，结合我们对直接E2F启动子占用率的检查，支持Rb通路在调节细胞谷氨酰胺分解中的直接作用。

我们对E2F对谷氨酰胺代谢功能的分析表明，E2F家族成员可能调节几个独立但必需的细胞过程。E2F-3抑制降低了细胞数量和谷氨酰胺摄取，并在功能上与ASCT2启动子相关。此外，E2F-2部分降低谷氨酰胺摄取，但抑制E2F-2表达对ASCT2或GLS1水平没有影响。这些数据表明，除ASCT2、SLC38A5和GLS1/2外，可能还有其他Rb途径调节酶，这些酶可能有助于Rb功能障碍驱动的谷氨酸分解的整体改变。E2F-1敲除显著降低Rb-TKO细胞的细胞增殖，但对谷氨酰胺摄取几乎没有影响。E2F-1 siRNA对Rb TKO细胞生长的影响可能是由于其广泛参与调节细胞周期介质。然而，最近的一份报告显示，E2F-1可以通过直接转录调节参与氧化磷酸化的多种酶来增强线粒体功能(33). 反过来，这种改变可能会促进通过E2F-3和/或E2F-2调节蛋白靶点的活性产生的可用谷氨酰胺衍生碳的线粒体代谢。此外，还观察到Rb/E2F-1级联通过直接调节PDK4的表达来调节丙酮酸转化为乙酰辅酶A，PDK4控制丙酮酸脱氢酶的活性(34). 这些观察结果表明，Rb功能的丧失可能会抑制葡萄糖衍生碳进入TCA循环的流量，进而可能会增加对补充碳替代来源的依赖。事实上，我们的数据补充了这些结果，将Rb级联的调节功能扩展到谷氨酰胺摄取和代谢，并为参与抑制这种代谢活动的E2F成员提供支持。基于这些新的结果，我们认为Rb途径紧密调节细胞生长的能力不仅源于其众所周知的调节细胞周期检查点的作用，还源于其对ATP和大分子生成的直接代谢控制。

除了所有三个Rb家族成员的基因组缺失外，Rb WT和Rb TKO细胞是等基因的(22). Rb族包含三个不同的成员，已知其具有重叠的功能(35). 这种代偿活性在谷氨酰胺摄取方面很明显，其中Rb-1−/−与WT MEF相比，MEF的谷氨酰胺摄取量增加了4倍，而Rb TKO MEF增加了6倍(图1a). 虽然Rb TKO MEF用于检查Rb功能在谷氨酰胺代谢中的完全丧失，但这些数据表明Rbl1和/或Rbl2也可能在调节谷氨酰胺代谢方面发挥作用。传统上，Rbl1和Rbl2成员与激活剂E2F无关，但主要与E2F-4或-5相互作用(24). 这反过来表明，这些E2F也可能起到将这些Rb蛋白与参与介导谷氨酰胺裂解的靶基因结合的作用。然而，最近已经观察到Rbl1在调节靶基因表达中特异性控制E2F-3活性(36). 由于Rb-1、Rbl1和Rbl2对谷氨酰胺代谢的独立调节机制尚不清楚，因此，阐明每个Rb家族成员及其各自的E2F伙伴在介导谷氨酰胺代谢中的不同贡献是正在进行的研究的重点。所有三个Rb家族成员的基因组缺失导致既定的癌症相关代谢转变为谷氨酰胺依赖性，这有力地支持了这样一个结论，即Rb途径在细胞代谢调节中具有以前未被认识到的作用。本研究中观察到的代谢效应是否仅仅是由于Rb/E2F对代谢靶基因的直接控制，还是通过额外的下游介质引起的，这些介质的表达也因Rb的缺失而改变，还有待确定。

Rb基因缺失或突变存在于100%的视网膜母细胞瘤、90%的小细胞肺癌以及膀胱癌（70%）、前列腺癌（60%）、肝癌（40%）和乳腺癌（30%）中(25). 此外，功能失调的Rb延伸到其他癌症类型，如胰腺癌（70%）、结直肠癌（60%）和黑色素瘤（60%），其中Rb家族通过失调的CDKs的过度磷酸化而失活。累积起来，这些频率表明针对谷氨酰胺分解途径的治疗可能对广泛的肿瘤类型有效。事实上，GLS1抑制剂，如BPTES，正在临床前应用，并已证明在肿瘤异种移植模型中有效(10,15,37). 使用生物信息学药物发现方法(38,39)，我们打算鉴定这些酶的新型小分子拮抗剂，作为抗癌药物进行测试。此外，Rb/E2F通路在特定肿瘤中的功能状态可能是预测这些药物反应性的关键生物标志物。我们的结论是，Rb家族抑制谷氨酰胺代谢的能力有助于其抑癌活性，这些研究可能为抗肿瘤治疗的发展确定新的靶点。

材料和方法

细胞培养

视网膜母细胞瘤蛋白家族三敲除小鼠胚胎成纤维细胞（TKO MEF）或Rb-1空MEF如前所述产生(22). MEF在补充有10%FBS（Hyclone）、25mM葡萄糖、4mM谷氨酰胺和50µg/mL硫酸庆大霉素的DMEM（Gibco）中培养。细胞保持在5%CO237°C时。

谷氨酰胺摄入

重量，Rb-1−/−或清洗TKO MEF并补充1µM[U-14C] -谷氨酰胺5分钟。抽吸培养基，用谷氨酰胺缺乏培养基清洗细胞三次。样品c.p.m.通过液体闪烁计数器采集。

实时PCR

使用RNeasy试剂盒（Qiagen）从WT和TKO MEF的三种不同制剂中获得RNA。在Step One Plus RT-PCR系统上使用特异性Taqman基因表达分析（ABI）测定基因表达。

蛋白质表达

使用抗ASCT2（细胞信号）、GLS1（Abnova）、GCLC（Thermoscific）、E2F-1（Cell Signaling）、E2F2（Santa Cruz）、E2F3（Santa Cruz）和β-肌动蛋白（Pierce）的抗体对WT和TKO MEF的蛋白裂解产物进行西方分析。使用Quantity One软件进行密度测定分析。

氨排泄

使用氨测定试剂盒（Biovision）测定中等氨含量。分泌速率表示为来自两个独立实验的三份样品的nmol/min/mg蛋白质。

核磁共振稳定同位素分解代谢组学分析

WT和TKO细胞接种于1×106细胞放在15厘米的培养皿中。然后用补充25mM葡萄糖、10%透析FBS和4mM的DMEM标记MEF进行两次细胞加倍（WT:60小时，TKO:48小时）[13C类5,15N个2]-谷氨酰胺。用10%的TCA提取代谢物两次，然后将混合提取物在LN中闪速冷冻2并冷冻干燥。为了解决13将C-谷氨酰胺掺入谷氨酰胺（Q）、谷氨酸（E）和谷胱甘肽中，如前所述，还进行了在中性pH下提取细胞代谢产物的单独方案(40). 在这两种方案中，核磁共振波谱记录如前所述(38).

耗氧量和ATP水平

如前所述，使用Seahorse Bioscience XF24细胞外通量分析仪测量完整细胞的耗氧量(41–43). 测定介质由DMEM组成，DMEM补充有25mM葡萄糖和4mM谷氨酰胺。在其他研究中，测量了添加外源性4mM谷氨酰胺前后培养的WT和TKO MEF的耗氧量。使用ATP测定试剂盒（Invitrogen）测定ATP浓度。

线粒体DNA定量PCR

如前所述，线粒体与核DNA的比率通过使用线粒体或核基因组特异的两组引物的实时PCR测定(32,44). 对四种分离细胞DNA制剂的连续稀释液进行实时PCR，并进行三次测量。

谷胱甘肽水平

使用谷胱甘肽检测试剂盒（Biovision）、GSH-GLO和GSSG/GSG-GLO检测试剂盒。数据表示为WT和TKO MEF之间的归一化总谷胱甘肽和GSH与总谷胱甘肽的比率，或TKO EMF中的相对GSH水平。

活性氧物种

WT和TKO MEF中的ROS生成由DCF-DA（Invitrogen）荧光、流式细胞术或SpectraMax荧光仪（分子探针）测定。采用流式细胞术用线粒体SOX荧光法测定线粒体活性氧。

细胞增殖和活性

WT和TKO MEF被镀在12孔板中，播种后16小时，培养基被完全DMEM或不含谷氨酰胺的DMEM替换。更换培养基后3、6、24和48小时，用血细胞仪通过台盼蓝排除法和计数法测定细胞数量和存活率。对于α-酮戊二酸的补充实验，在更换培养基的同时添加7 mM二甲基α-酮戊二酸。

细胞转染

按照制造商的方案（Polyplus），使用JetPrime试剂，用编码小鼠Rb-1（Origene:MG227287）的质粒转染细胞。如前所述进行siRNA转染(39)使用了以下siRNA：E2F-1：（Ambion:#s201266）；E2F-2：（环境：#s109846）；E2F-3：（环境：#s65238）。如上所述，在转染48或72小时后分析细胞数量、蛋白表达和谷氨酰胺摄取。

染色质免疫沉淀

根据制造商的方案进行ChIP分析，并进行了微小修改（细胞信号）。使用针对IgG（细胞信号传导）、E2F-1（细胞信号传递）、E2F2（圣克鲁斯）和E2F-3（圣克鲁兹）的抗体进行ChIP。用特异性引物（列于补充材料).

统计

WT和TKO MEF之间的谷氨酰胺摄取、mRNA和蛋白表达、氨分泌、谷胱甘肽水平、ROS生成、活细胞数和ATP生成的统计显著性通过使用Graph Pad Prism的双样本非参数双尾t检验确定。第页<0.05被认为具有统计学意义。

补充材料

1

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2

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三

单击此处查看。（83K，pdf格式）

4

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致谢

作者感谢杰森·切斯尼（Jason Chesney）、苏切塔·特朗（Sucheta Telang）和约翰·伊顿（John Eaton）的富有洞察力的讨论，并感谢泰勒·杰克斯（Tyler Jacks）对TKO MEF的厚礼。核磁共振实验在詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心核磁共振设施进行，部分由布朗基金会和NCCRR拨款1P20 RR18733支持。这项工作得到了国家研究资源中心生物医学卓越分子靶点研究中心（3P20RR018733-09）和RR024489（BGH）的资助。

脚注

利益冲突

作者表示，这些研究不存在利益冲突。

Oncogene网站上的论文附带补充信息(网址：http://www.nature.com/onc)

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