基于Evid的补体交替医学。2012; 2012: 732578.
咖啡酸苯乙酯通过调节基质金属蛋白酶-2和丝裂原活化蛋白激酶途径抑制口腔癌细胞转移
,1,2 ,1,2 ,三 ,1,2 ,4 ,1,2 ,5 ,5 ,三,6,*和2,7,*
池玉鹏
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惠文阳
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学术编辑：Shrikant Anant
2012年9月30日收到；2012年11月10日修订；2012年11月19日接受。
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摘要
咖啡酸苯乙酯（CAPE）是从蜂箱中提取的一种活性成分，具有抗炎和抗癌活性。然而，CAPE影响口腔癌细胞转移的分子机制尚未阐明。在本研究中，我们探讨了CAPE对SCC-9口腔癌细胞侵袭能力影响的潜在机制。结果表明，在非细胞毒性浓度（0μM至40μM） ●●●●。Western blot和明胶酶谱分析结果进一步表明，CAPE下调基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表达并抑制其酶活性。CAPE通过上调金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）对MMP-2的表达和活性产生抑制作用，并通过降低黏着斑激酶（FAK）磷酸化及其下游信号分子p38/MAPK和JNK的活化而有效降低迁移。这些数据表明，CAPE有可能作为一种化疗药物来预防口腔癌转移。
1.简介
口腔癌具有高度的局部侵袭性和区域颈部淋巴结的高转移率。口腔鳞状细胞癌（OSCC）是最常见的头颈部癌症，其特点是预后差，生存率低[1]. 转移是癌症死亡的主要原因，涉及多种过程，包括细胞外基质（ECM）的重塑和降解[2]. 各种蛋白酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）、组织蛋白酶和纤溶酶原激活剂（PA），参与了癌细胞与ECM之间的相互作用[三,4]. 基质金属蛋白酶在ECM结构蛋白的降解中起作用，并调节多种细胞功能，包括生长、侵袭、转移和血管生成[5]. 在被认为与人类疾病有关的各种基质金属蛋白酶中，研究人员对明胶酶（MMP-2和MMP-9）进行了深入研究。基质金属蛋白酶-2和MMP-9是参与基底膜主要结构成分IV型胶原降解的主要酶[6,7]. 几项研究表明，明胶酶在几种人类癌症中过度表达，例如乳腺癌[8]，胰腺[9]，前列腺[10]，肺[11]、和口腔[12]癌症。先前的研究也发现癌症患者的尿液和血浆MMP-2浓度显著增加[13,14]MMP-2和MMP-9被认为是转移风险或复发的预测因子或癌症预后标志物[15].
咖啡酸苯乙酯（CAPE）是蜂胶提取物的活性成分之一[16]. 先前的研究表明，CAPE具有抗氧化、抗炎和抗癌活性[17]. 此外，CAPE抑制二十烷酸的合成并抑制花生四烯酸从细胞膜中的释放[17,18]. 其抗炎活性源自COX-2表达的下调[19,20]. Chuu等人发现，CAPE通过抑制Akt抑制人类前列腺癌细胞增殖[21]. 其他研究表明，CAPE通过激活Fas和Bax以及抑制NF诱导细胞凋亡-κB类[22,23]. 然而，它对OSCC侵袭和转移的影响及其潜在机制尚未完全阐明。
本研究探讨CAPE治疗与SCC-9口腔癌细胞侵袭的关系。我们的结果表明，CAPE可能通过抑制FAK磷酸化及其下游p38和JNK信号通路抑制口腔癌细胞的迁移和侵袭。结果还表明，CAPE的抗侵袭活性部分通过调节MMP-2的表达和活性介导，从而降低口腔癌细胞降解细胞外基质成分的能力。
2.材料和方法
2.1. 细胞培养和CAPE治疗
SCC-9是从ATCC（Manassas，VA，USA）获得的人舌鳞状细胞癌细胞系，在补充有营养混合物的Dulbecco改良Eagle’s培养基中培养，该营养混合物包括F-12 Ham’s培养基（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）、10%胎牛血清（Hyclone Laboratories，Logan，UT，USA）、2mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。所有细胞培养物均保持在37°C、5%CO的增湿环境中2对于CAPE处理，将适量的CAPE储备溶液加入培养基中以达到指定的浓度，然后与细胞孵育指定的时间段，而不含CAPE的二甲基亚砜溶液用作空白试剂。
2.2. 细胞活性测定（MTT法）
为了进行细胞活性实验，采用微培养四唑（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）比色法测定CAPE的细胞毒性[三]. SCC-9细胞以5×10的密度接种在24孔板中4细胞/孔，用0至40浓度的CAPE处理μ在37°C下培养24和48小时。暴露期结束后，取出培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，然后用20μL MTT（5 mg/mL）（Sigma chemical Co.，St.Louis，MO，USA）静置4 h。每个培养皿中的活细胞数与formazan的产量成正比，在与异丙醇溶解后，可在563 nm处用分光光度法测定。
2.3. Annexin V/PI双重染色
FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I用于量化细胞死亡不同阶段的细胞数量。简言之，1×105100个细胞被重新悬浮μL 1x结合缓冲液（0.01 M Hepes/NaOH（pH 7.4）、0.14 M NaCl和2.5 mM CaCl2). 添加了5个μFITC附录V和5的LμL PI，细胞悬液在室温黑暗中孵育15分钟μ将L of 1x结合缓冲液添加到每个试管中，然后在1小时内进行流式细胞术分析。
2.4. 体外伤口闭合
SCC-9细胞（1×105细胞/孔）在6孔板中放置24小时，用吸管尖端刮伤，然后用含有0.5%FBS的DMEM培养基培养，并用或不用CAPE（0、5、10、20和40μM） 在0、24、48和72小时内，使用相控显微镜（×100）拍摄细胞照片。
2.5. 细胞迁移和侵袭检测
根据Yang等人描述的方法分析细胞迁移和侵袭[4]. 使用CAPE治疗后（0、5、10、20和40μM） 在24小时内，收集存活细胞，并于10点将其接种到Boyden室（Neuro Probe，Cabin John，MD，USA）4 细胞/微孔置于无血清培养基中，然后在37°C下培养24小时。对于侵袭试验，10μL Matrigel（25 mg/50 mL；BD Biosciences，MA，USA）适用于8μm孔径的聚碳酸酯膜过滤器，并且底部腔室包含标准介质。然后在层流罩中对过滤器进行空气干燥5小时。侵入细胞用100%甲醇固定并用5%Giemsa染色。在光学显微镜下计算细胞数量。迁移试验按照侵入试验中的描述进行，无Matrigel涂层[三].
2.6. 明胶酶谱法测定MMP-2
如前所述，通过明胶酶谱蛋白酶测定法测定条件培养基中MMP-2的活性[三]. 简单地说，用SDS样品缓冲液制备适当体积的收集培养基（根据重要细胞数调整），不煮沸或还原，并进行0.1%明胶和8%SDS-PAGE电泳。电泳后，用2.5%Triton X-100清洗凝胶，然后在反应缓冲液中培养（40 mM Tris–HCl，pH 8.0，10 mM CaCl2，和0.01%的NaN三)在37°C下保持12小时。然后用考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色。
2.7. 全细胞裂解液的制备
对于总细胞裂解物的制备，用PBS冲洗细胞两次，用0.2 mL含蛋白酶抑制剂的冷RIPA缓冲液混合物刮除，然后在4°C下旋转10分钟。细胞裂解物在4°C下以10000 rpm离心10分钟，并丢弃不溶性颗粒。用Bradford分析法测定总细胞裂解物和细胞核部分的蛋白质浓度[三].
2.8. Western Blot分析
细胞裂解物在10%聚丙烯酰胺凝胶中分离，并转移到硝化纤维素膜上。随后用5%脱脂牛奶在Tris缓冲盐水（20 mM Tris，137 mM NaCl，pH 7.6）中培养印迹1h阻断非特异性结合，然后用针对MMP-2、TIMP-2、caspase 3、8和9的多克隆抗体、三种MAPK（ERK 1/2、JNK 1/2和p38）、Akt或FAK与对应ERK 1/2，JNK 1/2，p38，Akt和FAK的非磷酸化或磷酸化形式的特异性抗体孵育过夜。然后用辣根过氧化物酶山羊抗兔或抗鼠IgG孵育斑点1h.然后，使用增强化学发光（ECL）商业试剂盒（Amersham Biosciences）检测信号，并通过扫描凝胶记录和分析系统上的照相底片来量化相对照相密度（AlphaImager 2000，Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA）。
2.9. 统计分析
通过Student’st吨-测试（Sigma-Stat 2.0，Jandel Scientific，San Rafael，CA，USA）。不同之处在于P（P）<0.05被认为具有统计学意义，实验重复三次。
3.结果
3.1. CAPE对SCC-9细胞活性的影响
显示不同浓度CAPE（0μM–40岁μM） 在SCC-9细胞上培养24小时和48小时。MTT试验结果表明，所有浓度，包括最高测试CAPE浓度（40μM） 与对照组相比，对SCC-9细胞活性无显著影响(P（P）> 0.05). 此外，CAPE在不同浓度（0–40）下也不会改变正常牙龈成纤维细胞的细胞活性μM） 24小时(). 因此，所有随后的实验都使用了这个CAPE浓度范围。
CAPE对细胞活力的影响。（a） 用CAPE（0、5、10、20和40）处理SCC-9细胞μM） 持续24小时和48小时，然后进行细胞活力的MTT测定。（b） 用CAPE（0、5、10、20和40）处理正常牙龈成纤维细胞μM） 24小时后进行MTT细胞活性测定。这些值表示至少三个独立实验的平均值±SD。
我们进一步研究了CAPE对Annexin V翻转和caspase裂解的影响。我们的结果表明，CAPE（0–40）处理SCC-9细胞μM） 24小时并没有增加细胞凋亡的发生率，膜联蛋白V/PI双染色没有显著变化()以及caspase 3、8和9的表达水平()对照组和CAPE处理的SCC-9细胞之间(P（P）> 0.05).
CAPE对SCC-9细胞Annexin V翻转和caspase裂解的影响。用CAPE（0–40）处理SCC-9细胞μM） 24 h，然后进行Annexin V和PI双染色流式细胞术（a）或Western blotting分析caspase 3、8和9（b）的蛋白水平。
3.2. CAPE对SCC-9细胞运动、迁移和侵袭的抑制作用
在创伤愈合试验中，CAPE显著降低SCC-9细胞的细胞运动性，且呈剂量和时间依赖性(P（P）<0.05）（图和). 40岁时μM、 CAPE在24小时、48小时和72小时分别使迁移细胞数减少38%、56%和82%。利用Boyden室进行的细胞迁移和侵袭实验表明，CAPE以浓度依赖性的方式显著降低SCC-9细胞的迁移和侵袭(P（P）<0.05）（图和). 在侵袭试验中，抑制率为16–64%()培养不同浓度（0–40）的细胞后μM） 我们的结果表明，随着CAPE浓度的增加，对细胞迁移的抑制作用增强。
CAPE对口腔癌细胞体外伤口闭合的影响。（a） 损伤SCC-9细胞，然后用载体（DMSO）或CAPE（0、5、10、20和40）治疗μM） 在含0.5%FBS的培养基中培养0小时、24小时、48小时和72小时。在0、24、48和72小时，对三个不同位置的伤口进行相位对比照片拍摄。（b） 用虚线作为时间零点计算迁移到伤口区域的细胞数。剥蚀区中平均细胞数的定量评估为平均值±SD(n个= 3).
CAPE对SCC-9细胞迁移和侵袭的影响。（a） 细胞迁移和（b）细胞侵袭分别使用带有聚碳酸酯过滤器的Boyden室进行16 h和24 h的测量。SCC-9细胞的迁移和侵袭能力通过计算侵袭到多孔聚碳酸酯底部的细胞数量来量化，如第2节.这些值表示至少三个独立实验的平均值±SD*P（P）与车辆组相比<0.05。
3.3. CAPE对MMP-2和TIMP-2蛋白表达及MMP-2酶活性的影响
为了证实MMP-2在抑制细胞迁移中起着至关重要的作用，我们比较了CAPE处理和对照SCC-9细胞中MMP-2蛋白的表达。如图所示和，用CAPE以浓度依赖的方式下调MMP-2酶活性治疗SCC-9细胞(P（P）< 0.05). 40岁时μM、 CAPE在24小时时将MMP-2酶活性降低了57%。CAPE还显著降低了MMP-2蛋白的表达，并增加了TIMP-2在western blotting中的表达（图和). CAPE（40μM） 24小时时TIMP-2表达增加约1.58倍。
CAPE对MMP-2活性和蛋白水平以及内源性抑制剂TIMP-2蛋白水平的影响。（a-b）用CAPE（0、5、10、20和40）处理SCC-9细胞μM） 24h后进行明胶酶谱分析MMP-2的活性。（c-d）用CAPE（0、5、10、20和40）处理SCC-9细胞μM） 24小时后进行western blotting分析MMP-2和TIMP-2的蛋白水平。MMP-2和TIMP-2蛋白水平的定量结果，用β-肌动蛋白水平。这些值表示至少三个独立实验的平均值±SD*P（P）与车辆组相比<0.05。
3.4. CAPE对黏附斑激酶激活的影响
我们对细胞迁移的分子调控的研究表明FAK参与了CAPE活性。在证明CAPE抑制SCC-9细胞迁移和侵袭后，我们进一步旨在使用针对FAK磷酸化位点Tyr397的抗体评估这些细胞中FAK激活的任何变化。如所示，CAPE降低SCC-9细胞中FAK磷酸化。抑制率为20–42%()这些结果表明，CAPE通过调节FAK磷酸化至少部分抑制SCC-9细胞迁移。
CAPE对FAK磷酸化水平的影响。（a） 用CAPE（0、5、10、20和40）处理SCC-9细胞μM） 24小时后进行western blotting分析FAK水平。（b） FAK磷酸化水平的定量结果，用FAK总蛋白水平进行调整。这些值表示至少三个独立实验的平均值±SD*P（P）与车辆组相比，<0.05。
3.5. CAPE对MAPK和PI3K/Akt通路的影响
我们使用western blot分析研究了CAPE对MAPK和PI3K/Akt通路的影响。结果表明pERK的组成性磷酸化()和pAKT()未经处理的SCC-9细胞和p38的下调()和pJNK()CAPE处理细胞中磷酸化的剂量依赖性(P（P）< 0.05). 40岁时μM、 CAPE使p38和JNK的磷酸化水平分别降低51%和40%。
CAPE对MAPKs通路和Akt信号的影响。在不同浓度的CAPE（0、5、10、20和40）中培养SCC-9细胞μM） 24小时，然后对细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后用（a）抗ERK1/2、（b）抗p38、（c）抗JNK和（d）抗Akt（总抗体和磷酸化抗体进行免疫印迹，如第2节随后通过密度分析对这些蛋白质的活性进行定量，对照组的活性为100%，如凝胶数据后所示。这些值表示至少3个独立实验的平均值±SD*P（P）与车辆组相比<0.05。
4.讨论
在过去几十年里，恶性肿瘤患者的管理有了很大改进。OSCC患者的5年总生存率约为25%[24]. 然而，患有晚期疾病的患者经常会经历癌症扩散到局部和远处的情况，手术难以控制。我们的结果表明，CAPE可以作为口腔癌转移的抑制剂，从而促进有效抗癌治疗的发展。我们发现CAPE（1）在非细胞毒性浓度下抑制SCC-9口腔癌细胞的迁移和侵袭，（2）下调MMP-2蛋白表达并抑制其酶活性，（3）增加TIMP-2表达，（4）抑制FAK磷酸化，（5）抑制p38 MAPK和JNK激活。
侵袭和迁移被认为是恶性肿瘤最重要的特征。实体瘤转移是人类癌症患者死亡的主要原因，涉及多个复杂的过程。ECM的降解被认为是肿瘤进展的关键[25]. 在导致ECM降解的各种蛋白酶中，基质金属蛋白酶-2在口腔癌中最为重要[26]. 以往的研究探讨了MMP-2在不同种族口腔癌患者中的临床意义。免疫组织化学结果表明，与邻近正常组织相比，恶性组织中MMP-2的表达显著升高。MMP-2过度表达与淋巴结转移呈正相关[27,28]. 淋巴结转移患者恶性组织中MMP-2的激活率高于无淋巴结转移的患者[29]. 口腔鳞癌的侵袭和转移是治疗的主要障碍。因此，CAPE抑制口腔鳞癌的转移可以为口腔癌的预防和治疗提供重要的益处。
本研究结果表明，CAPE显著抑制SCC-9癌细胞的迁移/侵袭能力，下调MMP-2蛋白表达，抑制MMP-2酶活性。然而，我们的数据也表明，SCC-9细胞分泌的MMP-9浓度很低（数据未显示）。MMP在体内的功能取决于它们与其天然抑制剂之间的局部平衡[30]. TIMP是以1:1化学计量结合MMP的生理抑制剂。一些研究表明，测量一些肿瘤中的蛋白酶/蛋白酶抑制剂比率可以准确反映ECM重塑[31]. 然而，转移与TIMP-2之间的关系仍存在争议。在以前的研究中，TIMP-2的过度表达保护了各种肿瘤细胞系中的癌细胞免受凋亡和减少细胞侵袭[32,33]. 在其他临床分析中，TIMP-2的表达与肿瘤复发呈正相关[34]. 我们的数据表明TIMP-2在预防肿瘤细胞侵袭中发挥作用，因为它在CAPE处理的SCC-9细胞中的表达上调。
先前的研究已经明确了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径在调节MMP表达和肿瘤细胞转移中的作用[35–37]. SB203580对p38的抑制显著降低了几种癌细胞的迁移率[38]. 在Huang等人的研究中，JNK的显性阴性突变体抑制了人类角膜上皮细胞的迁移[39]. 在其他研究中，p38和JNK都调节癌细胞中MMP-2的生成[40–42]. 我们的数据表明，CAPE治疗抑制p38和JNK磷酸化，下调MMP-2的表达，表明CAPE抑制MMP-2合成的可能机制。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信号转导通路参与MMP的产生和细胞增殖、存活和迁移[43]; 然而，我们的研究结果表明，CAPE对PI3K/AKT信号通路没有显著影响。
总之，我们的研究结果表明，CAPE通过抑制FAK和MAPK的激活来调节MMP-2的表达，从而对口腔癌细胞发挥部分抗转移作用。总的来说，这些数据表明CAPE有可能用作预防口腔癌细胞转移的化疗药物。
致谢
本研究得到了台湾国家科学委员会（编号：NSC100-2632-B-04-001-MY3）和台湾中山医科大学（编号：G101N0001）的研究资助。
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