干细胞移植医学。2013年1月；2(1): 68–80.
注射血管源性干细胞预防扩张型心肌病并促进血管生成和内源性心脏干细胞增殖mdx/utrn−/−但未老化中密度纤维板杜氏肌营养不良小鼠模型
，一 ，b条 ，一 ，c（c）和
c中，日期：，e（电子） Blake F.Wondrasch公司
c（c）比较生物科学系，
苏珊·贝瑞
c（c）比较生物科学系，
d日基因组生物学研究所
e（电子）美国伊利诺伊州乌尔班纳伊利诺伊大学神经科学项目
一动物科学系，
b条兽医临床医学系，
c（c）比较生物科学系，
d日基因组生物学研究所
e（电子）美国伊利诺伊州乌尔班纳伊利诺伊大学神经科学项目
通讯作者。 通信：Suzanne E.Berry，博士，比较生物科学系，3812 VMBSB，2001 South Lincoln Avenue，University at Urbana-Champaign，Urbana，Illinois 61802，USA电话：217-333-4246; 传真：217-244-1652; 电子邮件：乌德·塞内利@esyrreb 2012年8月30日收到；2012年10月29日接受。
版权©AlphaMed出版社1066-5099/2012/20.00/0美元 据推测，在杜氏肌营养不良（DMD）动物模型中，中成血管细胞干细胞（主动脉衍生中成血管干细胞[ADMs]）将恢复肌营养不良蛋白并减轻或预防扩张型心肌病（DCM）。研究发现，ADMs可延缓或阻止肌营养不良蛋白缺乏心脏DCM的发展，导致肌营养不良素的表达、血管生成、内源性心脏干细胞分裂的刺激以及巢蛋白的出现+宿主来源的心肌细胞。研究还发现，干细胞移植的时机对DMD心肌细胞治疗的疗效至关重要。
关键词：细胞治疗、肌营养不良、血管生成、心脏、细胞增殖、神经干细胞、细胞移植
摘要
杜氏肌营养不良症（DMD）是肌营养不良最常见的形式。DMD患者缺乏肌营养不良蛋白，并出现骨骼肌病理和扩张型心肌病（DCM）。约20%死于心脏受累。我们假设，在DMD动物模型中，中成血管细胞干细胞（主动脉衍生中成血管干细胞[ADMs]）将恢复肌营养不良蛋白并减轻或预防DCM。ADMs可以诱导表达心脏标志物，包括Nkx2.5、心肌原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白I和α-肌动蛋白，并采用心肌细胞形态学。ADM移植到心脏mdx/utrn（通用）−/−根据超声心动图测量，DCM发生前的小鼠可预防心肌病的发生，并导致CD31表达显著升高，与新血管形成一致。肌营养不良阳性心肌细胞和内源性巢蛋白增殖增加+在ADM注射的心脏中检测到心脏干细胞。内斯汀+在五分之四的患者中也检测到了条纹细胞mdx/utrn（通用）−/−心脏注射ADMs。相反，当ADM注射到老年人心脏时中密度纤维板超声心动图显示，晚期纤维化小鼠无功能改善。相反，ADM加剧了DCM的一些特性。无肌营养不良蛋白、CD31表达增加或Nestin增加+老年人注射ADM后检测到细胞增殖中密度纤维板心脏。ADM移植到年轻人心脏后观察到肌萎缩蛋白中密度纤维板然而，小鼠表明老年人的病理学中密度纤维板心脏可能改变供体干细胞的命运。总之，ADMs延缓或阻止肌营养不良蛋白缺乏心脏DCM的发展，但干细胞移植的时机可能对DMD心肌细胞治疗的疗效至关重要。
关键词：细胞治疗、肌营养不良、血管生成、心脏、细胞增殖、神经干细胞、细胞移植
我介绍
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种X染色体连锁的致命性肌肉萎缩性疾病，大约每3500名出生的男孩中就有1名患有这种疾病[1]; 它是由肌营养不良蛋白基因突变引起的。患者骨骼肌出现严重的进行性病理改变，以及扩张型心肌病（DCM）。DMD患者发展为心肌病的发病率有所增加。过去十年的医学进步，包括正压通气和脊柱融合手术，极大地延长了患者的寿命，因此，几乎所有DMD患者现在都发展为DCM[2–7]。
目前，血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、β受体阻滞剂和类固醇对治疗DMD患者肌营养不良蛋白缺乏性心肌病的症状是有益的。仅ACE抑制剂延缓心功能丧失[8]，正常收缩功能障碍[9]和延长使用寿命[10]. 使用β受体阻滞剂治疗可改善心功能并减少心动过速[11]ACE抑制剂和β受体阻滞剂联合治疗可提高心脏功能[12–15]，心室扩张减少[14，15]以及在观察到心脏功能下降之前给予药物可提高生存率[16]. 类固醇治疗也很有效，导致心脏功能下降的患者减少[17–20]并降低扩张型心肌病的发病率[21]. 因此，ACE抑制剂、β受体阻滞剂和类固醇是目前治疗DMD心肌病的标准药物。
另一种有希望的治疗方法是在缺乏肌营养不良蛋白的情况下使用膜封闭剂来稳定心肌细胞膜。这已被证明可以保护DMD动物模型的心脏免受多巴酚丁胺诱导的应激[22]和异丙肾上腺素诱导的心肌病[2]预防Duchenne肌营养不良犬模型的左心室重构和减少纤维化[23]。
尽管上述治疗对心脏有益，并可能延缓心肌病，但它们并没有解决肌营养不良蛋白的潜在缺乏或心肌细胞的丢失。在肌营养不良蛋白缺乏的心脏中，恢复肌营养不良蛋白质和/或替换丢失或受损的心肌细胞对于预防或逆转心室重塑和病理学是必要的。因此，除了基因或细胞治疗外，上述策略的组合可能为DMD患者、具有部分功能性肌营养不良蛋白的Becker肌营养不良患者和X连锁心肌病患者提供最佳的潜在结果，只在心肌中失去肌营养不良蛋白表达的人[24–27]。
研究了多种方法来恢复DMD动物模型心脏中的肌营养不良蛋白。重组腺相关病毒（rAAV）在DMD小鼠模型中通过病毒传递微小型肌营养不良蛋白基因[28，29]在多巴胺应激试验中改善心脏功能和保护心脏[28]. 然而，测试的微肌营养不良蛋白基因不能完全补偿心肌中的肌营养不良蛋白质功能[30，31]一些病毒载体在犬和人类肌肉中引发免疫反应[32–35]. 外显子跳跃是恢复功能性肌营养不良蛋白的另一种方法，并在体内产生了功能性益处[36]，但仅对具有特定类型的肌营养不良蛋白突变的患者有用。
通过移植外源性干细胞进行细胞治疗是恢复肌营养不良蛋白的另一种机制，并带来了产生新的肌肉细胞以取代丢失或受损的内源性细胞的额外益处。我们和其他人已经证明，具有肌营养不良蛋白基因功能拷贝的干细胞可以恢复肌营养不良素缺乏小鼠骨骼肌中肌营养不良因子的表达[37]还有狗[38]. 只有两项研究用于确定干细胞是否会取代受损的心肌细胞或为肌营养不良蛋白缺乏的心肌提供功能益处。Koh等人[39]将胎儿心肌细胞注入心脏中密度纤维板小鼠和营养不良的狗，恢复心脏中的营养不良蛋白，并形成与宿主心肌电耦合的缝隙连接。然而，胎儿人类干细胞的使用存在争议，这些细胞很可能很难在临床上使用。在另一项研究中，Payne等人[40]将骨骼肌源性干细胞（MDSC）注射到心脏mdx公司DMD小鼠模型。MDSC表达肌营养不良蛋白，但许多MDSC在移植后仍致力于骨骼肌表型，这表明需要进行额外的研究，以找到替代干细胞来源，用于治疗肌营养不良素缺乏的心脏。
在当前的研究中，我们将具有肌营养不良蛋白基因功能拷贝的主动脉衍生中血管母细胞（ADM）注射到DMD小鼠模型的心脏壁中，并确定它们是否恢复了肌营养不良素的表达并预防或缓解了心肌病。肌营养不良蛋白缺乏中密度纤维板小鼠在12至21个月大时心脏和心室扩张发生病理变化[41–43]由于该菌株的预期寿命接近正常值，因此可以进行长期研究。然而，考虑到心脏病理学发展所需的延长时间[42，43]心肌病可能发生的时间范围很广[42，43]和小鼠心脏病变严重程度的变化中密度纤维板应变，应变[41]，我们还使用了mdx/utrn（通用）−/−用于我们研究的老鼠。mdx/utrn（通用）−/−小鼠同时缺乏肌营养不良蛋白和utrophin，这是一种功能上补偿小鼠肌营养不良素的肌营养不良激素同源物[44]严重进行性骨骼肌病理和受损坏死的心肌细胞[45]. 我们最近报道说mdx/utrn（通用）−/−小鼠在15周龄时发展成与DMD患者相似的DCM[46]. 尽管mdx/utrn（通用）−/−小鼠的寿命缩短，心肌病的持续发展和快速发作使其成为使用我们的干细胞进行短期临床前研究的理想模型。ADMs在体外和体内都是肌源性的，已被用于恢复大鼠骨骼肌中高达50%的野生型肌营养不良蛋白水平mdx/utrn（通用）−/−小鼠，导致移植后受损肌肉纤维减少约50倍[37]. 我们现在报道，ADM也可以被诱导在体外表达心脏标记物，延迟DCM的发生，并促进心脏中可能有助于功能受益的意外变化。
M（M）材料和M（M）方法论
细胞培养
本研究使用了来自克隆的ADM群体。如前所述，从C57Bl/10小鼠的外植体培养物中分离出ADMs，并表征其在体内外分化为平滑肌细胞和骨骼肌细胞的能力[37]，并且之前已经报道过细胞的标记谱（CD34+，Sca1+，CD90.1+，CD31负极，CD45负极，CD13负极，CD146负极) [47]. ADMs在含有20%胎牛血清（FBS）、0.1 U/ml青霉素、0.1μg/ml链霉素、2.0 mM我-谷氨酰胺、0.1 mM非必需氨基酸、来自Gibco（加利福尼亚州卡尔斯巴德）的最低必需培养基维生素溶液，网址：http://www.invitrogen.com)和20 ng/ml纯化白血病抑制因子（LIF）（Chemicon，Temecula，CA，http://www.chemicon.com网站)，以下简称增殖介质。将细胞在0.1%明胶涂层板上扩增，并在37°C、5%CO的湿润培养箱中维持2.来自新生大鼠心脏（心室）的大鼠原代心肌细胞（目录号R6200；加州圣地亚哥科学细胞研究实验室，http://www.sciencellonline.com)在含有5%FBS的DMEM中培养，并在37°C和5%CO中保持2
体外心肌细胞分化
将ADM和大鼠原代心肌细胞（RCs）接种在涂有0.1%明胶的玻璃盖玻片上，置于增殖培养基（ADMs）或含5%FBS的DMEM（RCs，公司推荐）中。细胞附着后，将分化培养基添加到ADM中，而大鼠心肌细胞则保存在含有5%FBS的DMEM中。分化培养基包括（a）含有2%马血清的DMAM，（b）补充有5%FBS和心肌细胞生长补充剂（100×）（ScienceCell Research Laboratories，目录号6252）的DMAM和（c）DMEM补充了10μl/ml NDiff Neuro-2增补剂（200×）（目录号SCM012；Chemicon）和20μl/ml B27无血清增补剂（50×）（产品目录号17504-044；Gibco）。细胞在这些条件下保持14天，每隔一天更换培养基。每隔一天采集一次图像。
免疫细胞化学
培养细胞的免疫组织化学检测如下：玻璃盖玻片上的细胞在3.7%甲醛中固定10分钟，并在室温下用0.25%Triton X-100渗透10分钟。然后在RT时用封闭溶液（1×磷酸盐缓冲液[PBS]/2%马血清/5%牛血清白蛋白）孵育细胞1小时，然后在RT中用一级抗体孵育1小时。心脏标记物的主要抗体是小鼠单克隆抗肌萎缩蛋白I（MAB1691；1:300；Millipore，Billerica，MA，网址：http://www.millipore.com)，绵羊多克隆抗原肌球蛋白（ab5441；1:300；Abcam，Cambridge，MA，http://www.abcam.com)和小鼠单克隆抗肌动蛋白（MAB1682；1:100；Millipore）。兔多克隆antinconnexin 43（C6219；1:300；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，网址：http://www.sigmaaldrich.com)用于检测缝隙连接。接下来，用1×PBS清洗细胞，并用二级抗体孵育（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，http://www.jacksonimmuo.com)室温下放置1小时，然后使用Vectashield安装介质（包括4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI））安装盖玻片（Vector Laboratories，加利福尼亚州伯灵盖姆，网址：http://www.vectorlabs.com).
对于心脏组织的免疫组织化学，收集心脏，称重，在液氮冷却的2-甲基丁烷中冷冻，并在−80°C下储存。将冷冻心脏的连续切片切成10μm厚的切片，并收集在编号的载玻片上。按照上面列出的玻璃盖玻片上的细胞固定和堵塞部分。除Nestin和Ki67抗体在4°C下孵育过夜外，其余切片在RT下与一级抗体孵育1小时。使用的主要抗体为肌营养不良蛋白（ab15277；1:1000；Abcam）、CD31（ab28364；1:300；Abcam）、DDR2（sc-7555；1:100；Santa Cruz Biotechnology Inc.，加州圣克鲁斯，网址：http://www.scbt.com)，Ki67（#550609；1:300；BD Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥，http://www.bdbiosciences.com/index_us.shtml)Nestin（CH23001；1:100；Neuromics，明尼苏达州埃迪纳，网址：http://www.neuromics.com)和心肌肌钙蛋白I（MAB3150；1:100；Millipore）。
免疫组织化学数据分析
对于数字图像，使用Retiga 2000R数码相机（QImaging，Surrey，BC，Canada，网址：http://www.qimaging.com)与徕卡（瑞士海尔堡，网址：http://www.leica.com)倒置DMI 4000B显微镜。使用Image Pro Plus软件（MediaCybernetics，Bethesda，MD，http://www.mediacy.com网站)也用于计数和测量主要抗体阳性区域。随机选取10个视野进行Ki67定量+，嵌套+和DDR2+心肌细胞、CD31区和DDR2数量+和心肌肌钙蛋白I（cTpI）+DiI-标记细胞。×40物镜的视场测量值为260×225μm，×20物镜的视野测量值为540×450μm。对于巢蛋白阳性和DDR2阳性细胞，使用×40物镜，数据以每个视野表达标记的细胞数表示。基辅67+细胞以Ki67的每个视野中细胞的百分比表示，使用×20物镜。Ki67细胞的百分比通过除以Ki67的数量得到+每个场的细胞数乘以同一场中DAPI标记的细胞核数。使用×20物镜获得每个视野的CD31-阳性区域。DiI的百分比+表达DDR2或cTpI的ADMs，表达这些标记的DiI-标记细胞的数量除以DiI-标签细胞的总数。
逆转录聚合酶链反应表达心脏特异性基因
通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测分化培养14天后ADMs心肌特异性转录因子的表达。用Trizol试剂（目录号15596-018；Invitrogen，Carlsbad，CA，http://www.invitrogen.com网站)，并且使用LongRange 2Step RT-PCR试剂盒（目录号205920；Qiagen，Hilden，Germany，网址：http://www.qigen.com)按照制造商的说明。RT-PCR中使用的引物如在线补充图5所示。
ADM稳定绿色荧光蛋白转染剂的制备
为了制备绿色荧光蛋白（GFP）标记的ADM，将细胞保存在增殖培养基中的明胶涂层板上。用pIRES2-AcGFP1（Clontech，Palo Alto，CA，网址：http://www.clontech.com)根据产品说明手册使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）。转染后，细胞在含有400 mg/ml G418的增殖培养基中培养。使用iCyt自动成像细胞仪（Sony Biotechnology Inc.，Champaign，IL，网址：http://www.i-cyt.com)基于阳性GFP信号。使用未转染的对照细胞设置背景荧光。使用520λ通道检测GFP阳性细胞，并以每秒2000个细胞的纯度进行分类。分选后，GFP阳性细胞保存在含有20 ng/ml LIF和400 mg/ml G418的增殖培养基中。
用DiI标记ADM
将ADM进行胰蛋白酶化、洗涤，并与浓度为1×10的DiI（1,1′-二十八烷基-3,3,3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐）孵育6在37°C、5%CO的增湿培养箱中，每毫升细胞和5μl DiI/ml在增殖培养基中培养30分钟2移植前。在用Hanks的平衡盐溶液（HBSS）洗涤三次后，DiI-标记的ADM在HBSS中以5×10的速度再次悬浮6每50μl的细胞数。对于双标记GFP转染的ADM，在移植前使用相同的方案用DiI标记。
老鼠
所有小鼠均按照伊利诺伊大学动物护理和使用委员会批准的方案进行处理。mdx/utrn（通用）−/−肌营养不良蛋白和utrophin缺乏小鼠是Duchenne型肌营养不良症的表型模型；他们在骨骼肌和心肌中形成渐进性病理，心室扩张，并导致心脏功能下降[45，46]。mdx/utrn（通用）−/−小鼠是通过杂交产生的mdx/utrn（通用）+/−老鼠[45]，并且按照之前的描述对后代进行基因分型[48]。中密度纤维板采用相同的繁殖方案获得小鼠。因为mdx和utrn−/−用于生成mdx/utrn（通用）+/−小鼠均维持在C57Bl背景下，我们使用C57Bl/10小鼠作为年龄匹配的野生型对照。
ADM的心脏注射
如前所述，将标记的ADM移植到小鼠左心室壁[49，50]. 简单地说，小鼠被氟烷麻醉（Halocarbon，River Edge，NJ，http://www.halocarbon.com)混合在矿物油（7.5 ml氟烷/40 ml矿物油）和Bactoshield CHG 4%溶液（Steris、Mentor、OH、，网址：http://www.steris.com)用于擦洗小鼠胸前区。胰岛素注射器（0.3-ml注射器，带29 gaug针头），5×106将50μl HBSS中的细胞注入胸骨左侧的第五肋间，即左室壁所在的位置。柱塞被缓慢推动，针被轻轻收回。注射细胞后，将小鼠置于加热垫上，观察其状况，直至完全康复。
mdx/utrn−/−在病理和扩张型心肌病发病之前，在5-6周龄的小鼠体内注射细胞[44]5周后实施安乐死。在我们之前的研究中，我们发现在骨骼肌中mdx/utrn−/−小鼠注射后9周与5周的比较[37]. 然而，许多小鼠在注射后没有存活9周。因此，我们选择在移植后5周对小鼠进行检查，以进行本研究。中密度纤维板小鼠在5周龄时注射GFP/DiI双标记ADMs，以确定细胞是否存活并表达心脏标记物。随后，为了确定ADMs是否缓解扩张型心肌病，将DiI-标记的ADMs注射到老年人的心脏中中密度纤维板14至16个月大的小鼠。因为中密度纤维板小鼠通常存活至2岁，我们选择移植后9～10周对其进行观察，以分析心脏功能和组织学。
超声心动图
二维M型超声心动图用于测量心功能。5周龄时进行基线超声心动图检查mdx/utrn（通用）−/−小鼠和14-16个月大中密度纤维板细胞移植前的小鼠。细胞移植后5周再次进行超声心动图检查mdx/utrn（通用）−/−小鼠和细胞移植后10周中密度纤维板老鼠。GE/Vingmed超声波Vivid7（英国Little Chalfont，GE Healthcare）。，http://www.gehealthcare.com)用于进行超声心动图检查中密度纤维板鼠标和超声波可视超音速Vevo 2100（Visualsonics，多伦多，安大略省，加拿大，http://www.visualsonics.com)用于执行超声心动图mdx/utrn（通用）−/−老鼠。如上所述，用矿物油中的氟烷麻醉小鼠。剪下胸毛，在换能器上放置超声凝胶，将换能器放置在胸部顶部，并采集图像。中密度纤维板和mdx/utrn（通用）−/−将年龄匹配的野生型小鼠随机交给超声心动图仪（R.O.），后者对小鼠的基因型一无所知。
超声心动图统计分析
SAS的程序混合程序（SAS Institute，Inc.，Cary，NC，网址：http://www.sas.com)用于分析超声心动图数据。统计模型包括基因型、年龄、进行超声心动图检查的时间点的影响，以及它们作为固定影响的相互作用。当主要效应显著时，通过两两比较来测试每个基因型内细胞移植前后以及每个超声心动图检查时间点内基因型间的差异。
R（右）结果
主动脉衍生中成血管细胞在体外表达心肌细胞标记物
通过使用市售心肌细胞培养基、使用无血清培养基补充物或向培养基中添加2%马血清，诱导ADM采用心肌细胞样形态。增殖介质中的ADM呈纺锤形(A） 如之前报道的克隆衍生的未分化中血管母细胞[37，47]. 然而，当ADMs在分化培养基中培养时，观察到类似于对照大鼠心肌细胞的形态，细胞质大而扁平，与相邻细胞紧密接触(B） ●●●●。在这些接触点，检测到连接蛋白43（Cx43），这是一种缝隙连接蛋白，对心脏中心肌细胞的电耦合很重要(C） ●●●●。
ADMs采用心肌细胞样形态，体外表达心脏标志物。体外将ADMs分化为心肌细胞，并评估心肌特异性基因和蛋白的表达。（答：，
B） ：生长介质中ADMs的形态（A）和心脏分化培养基（B）.（C，D）：分化培养基中的ADM在相邻细胞相遇的区域表达连接蛋白43（白色箭头）（C）并随着时间的推移慢慢采用心肌细胞形态（D）.（E） ：分化培养基中的ADMs表达心肌特异性mRNA，包括Nkx2.5、cTnI和cTm。心脏组织作为阳性对照，脂肪作为阴性对照。GAPDH被用作内部负荷控制。（F–L）：ADMs在分化培养基中表达心脏蛋白，包括心脏cTm（J），α-肌动蛋白（K）和cTnI（左）。原代大鼠心肌细胞被用作心脏蛋白的阳性对照（G–I）.（F） ：表达cTm的细胞数量。蓝色输入（C、G–L）表示DAPI染色的细胞核。缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；CMGS，心肌细胞生长补充剂；cTm，心肌原肌球蛋白；cTnI，心肌肌钙蛋白I；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；DM，分化培养基；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GM，生长培养基；HS，马血清。
形态的变化是渐进的。在分化培养基中第9天，不到40%的细胞具有心肌细胞样形态，但到第14天，97.82%的细胞具有心肌病细胞样形态(D） ●●●●。ADMs也在分化培养基中表达心肌特异性mRNA和蛋白。通过RT-PCR检测分化ADM中心脏特异性同源盒转录因子Nkx2.5、心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心肌原肌球蛋白（cTm）(E） ●●●●。此外，免疫组化还检测到cTnI、cTm和α-肌动蛋白蛋白(F–1L）。在N2B27分化培养基中，第14天，69%的ADMs表达cTm蛋白，而在增殖培养基中表达的ADMs=7%(F） ●●●●。
主动脉衍生中成血管细胞在年轻人移植后表达心肌细胞标记物中密度纤维板心脏
未分化ADM移植到5周龄的心肌中中密度纤维板老鼠(n个= 2). GFP稳定转染ADMs（96.33%的细胞）(A、，B） 在注射前与亲脂染料DiI混合，注射后立即在心室中检测到(C–2F）。在随后的实验中，ADMs被单独标记为DiI，因为ADMs随着时间的推移沉默了GFP的表达，GFP稳定的转染剂在体内没有分化为一些成熟的细胞类型（数据未显示）。
主动脉衍生间充质干细胞（ADM）标记、移植和心脏标记物表达。ADM被标记并移植到心脏中密度纤维板用荧光显微镜检测移植后ADM中心肌特异性蛋白的表达。（答：，
B） ：用pIRES2-AcGFP1稳定转染ADMs，并通过荧光激活细胞分选选择GFP表达强度。（C–F）：GFP转染的ADM（绿色【D、F】)涂上了DiI（红色[中、英])并在5周龄时注入心脏壁中密度纤维板老鼠。5周后，在心脏心室中检测到双标记GFP+DiI+细胞。（G–J）：DiI（红色，【H、I、K、L】)在表达心肌肌钙蛋白I蛋白的细胞中检测到（绿色【G，I】)和肌营养不良蛋白（绿色【K，L】)在心室的心肌中。（J） ：仅与次级FITC-结合抗体孵育的组织。蓝色输入（E–J，L）表示DAPI染色的细胞核。缩写：cTpn I，心肌肌钙蛋白I；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；异硫氰酸荧光素；FSC，正向散射；绿色荧光蛋白。
注射DiI标记的ADMs 6周后，在心脏的DiI标记细胞中检测到心肌细胞标记物cTnI(G–2J）。DiI和肌营养不良蛋白在脑室中也被观察到共定位中密度纤维板ADM移植后心脏(K、，L） 。然而，肌营养不良蛋白仅在心脏的有限区域检测到，而不是整个心室。
ADM移植预防心脏病患者心室扩张和心功能下降mdx/utrn（通用）−/−心肌
心脏超声用于评估ADM移植前后的心功能和心室扩张。mdx/utrn（通用）−/−小鼠在大约5-6周龄时注射ADM或等量的盐水溶液作为对照。年龄匹配的野生型小鼠也被注射生理盐水作为对照。注射盐水的年龄匹配野生型小鼠和mdx/utrn（通用）−/−注射ADMs的小鼠在10-11周龄时，通过射血分数（EF）、舒张末期容积（EDV）和缩短分数（FS(A–3D；在线补充图1中提供的原始数据；注射盐水的野生型小鼠，n个= 4;mdx/utrn（通用）−/−注射盐水的小鼠，n个= 4;mdx/utrn−/−注射ADM的小鼠，n个= 5). 相反，左室壁厚度在统计学上显著减少(A） 舒张和收缩时左心室直径增加(B类；在线补充图1），以及EDV的大幅增加(C） ，在中观察到mdx/utrn（通用）−/−注射盐水的小鼠(A–3D），与扩张型心肌病的发展相一致。注射前各组动物EDV和左心室内径的基线值不同，但与注射干细胞时各组动物的体重相关(E） 与之前的一份报告一致，该报告显示了不同物种的体重和这些超声参数之间的线性关系[51]. 安乐死时各组小鼠的心脏重量/体重比没有显著差异(F） ●●●●。
ADM移植到mdx/utrn（通用）−/−心脏延迟扩张型心肌病的发病。控制和mdx/utrn（通用）−/−小鼠接受心内注射生理盐水或ADMs，并使用心脏超声测量心功能、心室大小和心壁厚度。（A–C）：
mdx/utrn（通用）−/−对照组小鼠注射生理盐水（dko/HBSS；n个=4）LVPWd显著变薄（A），LVIDd增加（B）室间隔变薄（C）而年龄匹配的野生型小鼠（wt/HBSS；n个=4）和mdx/utrn（通用）−/−注射ADM的小鼠（dko/ADMs；n个=5）没有。（D） ：EDV也大幅增加mdx/utrn（通用）−/−注射生理盐水的小鼠，但年龄匹配的野生型小鼠注射生理盐水或mdx/utrn（通用）−/−注射ADM的小鼠。（A–D）：灰色条，注射前值；黑色条，注射后值。（E） ：注射ADM或生理盐水时，不同治疗组小鼠的体重不同。（F） ：在最后一次心脏超声检查和随后的安乐死时，所有组小鼠的心重和体重比率没有差异。*，对< .05. 缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；dko，双淘汰赛mdx/utrn（通用）−/−; 舒张末期容积；HBSS，Hanks平衡盐水溶液；IVSd，舒张期室间隔；LVIDd，舒张时左室内径；LVPWd，舒张期左室后壁；wt，野生型。
ADM注射导致Dytrophin表达和CD31表达增加mdx/utrn（通用）−/−ADM注射后的心脏
肌营养不良蛋白表达(A、，B、 在ADM注射中检测到野生型心肌(C中，D） 但不含盐mdx/utrn（通用）−/−心脏(E、，F） 或ADM注入中密度纤维板心脏(G、，H、 下面将更详细地讨论）。因为外源性干细胞移植的功能益处通常来自间接效应，包括血管生成[52]，我们检测了内皮细胞标记物CD31的表达(我，J） ●●●●。CD31表达在mdx/utrn（通用）−/−心脏注射ADMs与mdx/utrn（通用）−/−注射生理盐水或年龄匹配的sham注射野生型对照小鼠的小鼠(K） ●●●●。在野生型对照小鼠和mdx/utrn（通用）−/−注射生理盐水的小鼠(K） ●●●●。
肌营养不良蛋白表达和血管生成在mdx/utrn（通用）−/−注射ADM的小鼠。用荧光显微镜分析野生型心脏中dystrophin和CD31的表达，mdx/utrn（通用）−/−、和中密度纤维板细胞移植或盐水注射后的小鼠。（答：，
B） ：使用注射盐水的野生型对照小鼠作为肌营养不良蛋白表达（绿色）的阳性对照。（C，
D） ：肌营养不良蛋白在心肌的一些细胞中检测到mdx/utrn（通用）−/−注射ADM后的小鼠(n个= 5).（E、，
F） ：在中未检测到肌营养不良蛋白mdx/utrn（通用）−/−注射盐水的小鼠(n个= 4).（G，
H） ：心肌中未检测到肌萎缩蛋白中密度纤维板注射ADM后的小鼠(n个=4）。（I–K）：CD31（绿色）是内皮细胞的标记物，通过免疫荧光显微镜检测并在所有组小鼠中定量。（A、C、E、，
G） ：肌萎缩蛋白（绿色）。（B、D、F、，
H） ：肌营养不良蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）的合并图像。（本人，
J） ：野生型对照心肌中CD31的代表性图像。（K） ：CD31表达的定量分析显示CD31在mdx/utrn（通用）−/−心肌注射ADM（dKO/ADM；n个=5）比inmdx/utrn（通用）−/−心肌注射生理盐水（dKO/HBSS）；n个=4）或在年龄匹配的野生型小鼠中注射盐水（WT/HBSS；n个= 4). *, 统计显著差异(对<.05）。缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；dKO，双淘汰赛mdx/utrn（通用）−/−; HBSS，Hanks平衡盐水溶液；WT，野生型。
ADM注射使巢蛋白数量正常化+间质分裂细胞及其与巢蛋白外观的关系+心脏中的条纹细胞mdx/utrn（通用）−/−老鼠
为了评估ADM是否通过刺激内源性心脏干细胞分裂以修复和再生心脏来预防DCM，我们检测了心脏中的细胞增殖。成年心脏主要是有丝分裂后的心脏，但它含有大量分裂的心脏前体细胞，这些细胞在损伤后会膨胀，并被认为有助于体内平衡[53]. 正如所料，在野生型成人心脏中，大量Ki67+在心脏的心室中检测到细胞(A、，B、，G–5J；n个= 4). 出乎意料的是mdx/utrn（通用）−/−心脏注射盐水(C中，D、，J；n个= 4). 然而，ADM注射使mdx/utrn（通用）−/−心脏(E、，F、，J；n个= 5). 基辅67+心肌细胞不表达Sca-1，这是许多固有心脏干细胞的标志物，但表达巢蛋白(K、，五十） ，正常和梗死心肌中神经嵴源性干细胞的标记物[54–57]. 尽管巢蛋白增殖增加+ADM注射中的细胞mdx/utrn（通用）−/−心肌中，巢蛋白的总数显著减少+ADM注射心肌间质中的细胞(A） ●●●●。量化巢穴时+在ADM或sham注射小鼠的心肌间质细胞中，我们观察到nestin+五分之四的心脏中表达心肌肌钙蛋白I的横纹细胞mdx/utrn（通用）−/−注射ADM的小鼠(B–6F）。在四个心脏中的一个心脏中也观察到少量mdx/utrn（通用）−/−注射盐水的小鼠(G） ，但nestin+年龄匹配的野生型sham注射小鼠的心肌中没有纹状体细胞(H、，n个= 4).
移植的主动脉源性间充质干细胞（ADM）维持分裂细胞的基本水平mdx/utrn−/−心肌。分析Ki67的表达，以确定野生型和mdx/utrn（通用）−/−注射ADM或生理盐水的小鼠。用免疫荧光显微镜在注射盐水的野生型小鼠（WT/HBSS；n个= 4)（答：，
B），mdx/utrn（通用）−/−盐水注射小鼠（dKO/HBSS；n个= 4)（C，
D）、和mdx/utrn−/−注射ADM的小鼠（dKO/ADMs，n个= 5)（E、，
F）白色箭头表示Ki67+核（A–I、K、，
L）与DAPI共同定位的（B、D、F、I、，
L）.（G–I）：注射生理盐水和Ki67的野生型小鼠心脏组织的高清晰度图像+细胞核（绿色【G】)与DAPI（蓝色【H，I】). Ki67阳性细胞在使用放大镜拍摄的图像中进行定量（G–I）.（J） ：sham注射组心肌中分裂细胞明显减少mdx/utrn（通用）−/−小鼠（灰色条）与年龄匹配的对照野生型小鼠（白色条）进行比较。然而，ADM注入mdx/utrn（通用）−/−心肌中分裂细胞（黑条）的数量明显高于注射盐的心肌mdx/utrn（通用）−/−心肌。ADM注射中分裂细胞的数量mdx/utrn（通用）−/−心脏与野生型心肌的基础水平没有显著差异。对使用Student的t吨测试。使用神经干和祖细胞标记nestin的抗体来确定Ki67+分裂细胞表达nestin。（K，
五十） ：基辅67+在表达nestin（红色）的细胞中检测到细胞核（绿色）。白色箭头表示嵌套+有核分裂细胞Ki67+表达式。黄色箭头表示巢穴+不增殖且不表达Ki67的细胞。（五十） ：合并的图像来自（K）使用DAPI。（B、D，F、 I、L）：Ki-67或Ki-67和巢蛋白的合并图像（左）带DAPI（蓝色）。（J） ：*，表明各组之间存在统计显著性差异(对< .05). 缩写：DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；dko，双淘汰赛mdx/utrn（通用）−/−; HBSS，Hanks平衡盐水溶液；WT，野生型。
内斯汀+ADM移植中的间质干细胞和心肌细胞mdx/utrn（通用）−/−心脏。用荧光显微镜观察巢蛋白+心脏的间质细胞和条纹细胞。（A） ：巢穴明显减少+注射ADM的间质干细胞（dko/ADMs，n个= 5)mdx/utrn（通用）−/−与年龄匹配的注射生理盐水的野生型心脏（WT/HBSS，n个= 4).对使用Student的t吨测试。WT/HBSS与dKO/HBSS之间没有差异(对=.0538）或dKO/HBSS与dKO/ADM(对= .3843).（B–F）：内斯汀+在五分之四的患者中观察到条纹细胞（绿色，用白色箭头表示）mdx/utrn（通用）−/−用ADMs移植的心脏。（C） ：一簇巢穴+条纹细胞（绿色，用白色箭头表示）和周围含有巢蛋白的组织+间质干细胞（也是绿色的，用黄色箭头表示）。（D–F）：相同的嵌套簇+单元格（绿色）如所示（C）高倍镜下，心肌肌钙蛋白I（红色[E，
【F】).（G） ：一些巢穴+在四个中的一个也观察到了条纹细胞mdx/utrn（通用）−/−心脏注射生理盐水。（H） ：内斯汀+在盐水注射的野生型心脏中，纹状体细胞不存在。缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；cTpI，心肌肌钙蛋白I；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；dKO，两次击倒mdx/utrn（通用）−/−; HBSS，Hanks平衡盐水溶液；WT，野生型。
ADM移植后的命运mdx/utrn（通用）−/−心脏
在心肌层检测到少量DiI-标记细胞mdx/utrn（通用）−/−尽管观察到存在肌营养不良蛋白阳性心肌细胞，但注射后5周仍有心脏出现。在心外膜中检测到DiI细胞，其中约一半（54.94±9.23%）表达心脏成纤维细胞标记物DDR2，17.93±2.98%表达心肌肌钙蛋白I（补充在线图2）。因此，心肌中的DiI-标记细胞很可能成为心肌成纤维细胞或心肌细胞。
ADM注射不能预防老年扩张型心肌病的相关变化中密度纤维板老鼠
为了评估ADMs是否缓解现有的心肌病，我们将细胞移植到12-14个月大的婴儿心脏中中密度纤维板小鼠在注射前和注射后10周进行心脏超声检查。心室扩张和室壁变薄不存在于中密度纤维板首次回声时的小鼠(A、，B、 注射盐水的野生型小鼠，n个= 3;mdx公司注射盐水的小鼠，n个= 4;中密度纤维板注射ADM的小鼠，n个= 4). 然而，干细胞注射后，中密度纤维板小鼠表现出与扩张型心肌病发展相一致的变化(; 补充在线图3）。假注射和ADM注射中密度纤维板注射后10周，与野生型小鼠相比，小鼠表现出显著的心室扩张(A） ●●●●。然而，在注射后观察到最大程度的变化中密度纤维板心脏注射ADMs，细胞移植后心室扩张明显增加(A） ●●●●。观察到壁变薄中密度纤维板生理盐水注射后心脏(B） 与早期心室重塑一致[58，59]。中密度纤维板移植后注射ADMs的小鼠心室壁较厚(B类；补充在线图3），与损伤后心室重构的后期阶段一致[58–59]。中密度纤维板通过EF和FS测量，注射盐水或ADMs的小鼠的心功能显著下降，而年龄匹配的野生型小鼠在注射盐水后没有表现出心功能下降(C中，D） ●●●●。在野生型心脏或中密度纤维板假注射后的心脏，并且在对照野生型和中密度纤维板小鼠（补充在线图3）。然而，观察到EDV和ESV在中密度纤维板心脏注射ADM(E；补充在线图3），也与损伤后心室重构的后期阶段相一致，并且在损伤恢复后存活率较低[58–60]。
ADM移植到mdx公司心肌不能缓解扩张型心肌病的症状或促进血管生成、肌营养不良蛋白表达或巢蛋白正常化+细胞分裂。心脏超声用于评估野生型或mdx公司用ADMs或生理盐水移植的小鼠。（A） ：两组患者均观察到显著的心室扩张中密度纤维板注射细胞或生理盐水的小鼠与注射假（生理盐水）的野生型小鼠的比较(n个= 3).中密度纤维板与注射前值相比，注射ADMs的小鼠在注射干细胞后心室扩张也显著增加（注射后栏上用星号表示）。（B） ：
中密度纤维板注射盐水的小鼠(n个=4）注射前后左室壁显著变薄，而中密度纤维板注射ADM的小鼠(n个=4）表明注射前后心室壁厚度显著增加。ADM移植后心室壁厚度的增加中密度纤维板小鼠显著高于野生型和中密度纤维板假注射小鼠。（C，
D） ：
中密度纤维板通过EF测量，接受假手术或ADM的小鼠在注射后心脏功能显著下降（C）和FS（D）.（E） ：EDV在中密度纤维板ADM移植后的小鼠。免疫荧光显微镜用于评估野生型或中密度纤维板注射生理盐水或ADM的小鼠。（F） ：胶原蛋白免疫荧光染色定量分析，老年人胶原蛋白含量显著增加mdx公司心脏与年龄匹配的野生型小鼠心脏的比较。（G） ：对照组和ADM注射组小鼠心肌中CD31的表达无差异。（H） 以下为：在中密度纤维板与年龄匹配的野生型心肌相比，ADM注射对这一数字没有影响。（A–E）：灰色条，注射前值；黑条，注射后超声值。（F–H）：白条，注射盐水的野生型小鼠；灰色条，中密度纤维板小鼠注射生理盐水；黑色条，中密度纤维板注射ADM的小鼠。WT/H：注射盐水的野生型小鼠(n个= 3); mdx/高度：中密度纤维板盐水注射小鼠(n个= 4); mdx/ADM：中密度纤维板注射ADM的小鼠(n个= 4). *, 显著差异(对<.05）。（注射后条上的星号表示一组小鼠注射前和注射后值之间存在显著差异，而两组小鼠之间的显著差异由两组之间的线条和星号表示。）缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；舒张末期容积；EF，射血分数；FS，分数缩短；H、 盐水注射；LVIDd，舒张时左室内径；LVPWd，舒张期左室后壁；wt，野生型。
老年人注射ADM后不存在肌营养不良、血管生成和干细胞增殖中密度纤维板心脏
相比之下mdx/utrn（通用）−/−老鼠(C中，D类；n个=5）和年轻中密度纤维板老鼠(K、，L、，n个=2）注射ADMs后，在老年人中未检测到肌营养不良蛋白中密度纤维板心脏注射ADM(G、，H、，n个= 4). 与心脏超声数据一致，表明中密度纤维板两组小鼠的心脏均出现纤维化中密度纤维板小鼠，但不在年龄匹配的野生型心脏中(F） ●●●●。与ADM移植后观察到的CD31增加相比mdx/utrn（通用）−/−心脏，CD31与ADM移植到老年人中没有差异中密度纤维板心脏，或在老年人之间中密度纤维板和野生型心脏(G） ●●●●。类似mdx/utrn（通用）−/−老鼠(G） ，内源性分裂细胞的数量在mdx公司心脏(H） ，但ADM注射没有使其正常化中密度纤维板老鼠(H） ●●●●。
天震荡
在本研究中，我们测试了ADMs在DMD小鼠模型中是否预防或缓解扩张型心肌病。ADMs来源于新生或幼年出生后主动脉，其标记谱类似于来源于胚胎背主动脉和出生后心室的中成血管细胞[47，61–63]. 向心脏注射ADMmdx/utrn（通用）−/−在疾病发作之前，小鼠阻止了左室壁变薄和心室扩张，以及EDV的增加，在对照组中观察到mdx/utrn（通用）−/−老鼠(). 年龄匹配组注射后回声参数无显著差异mdx/utrn−/−10–11周龄的小鼠和野生型小鼠，即使经过sham治疗的小鼠心脏也发生了显著变化mdx/utrn（通用）−/−老鼠(; 补充在线图1）。例如，尽管在对照组中观察到非常显著的心室扩张mdx/utrn（通用）−/−老鼠随着时间的推移(对<.0001），在11周龄时出现最终回声时，心室仍小于野生型对照小鼠。这些变化与野生型小鼠和mdx/utrn（通用）−/−小鼠，因为野生型小鼠更大，因此心室比野生型小鼠大mdx/utrn（通用）−/−以及与体重相关的其他超声参数的差异。
这是干细胞治疗对肌营养不良蛋白缺乏的心脏产生功能益处的首次报道。我们的数据表明，ADMs通过多种机制预防或延缓扩张型心肌病的发病，包括（a）与宿主细胞分化或融合，生成表达肌营养不良蛋白的心肌细胞，（b）诱导血管生成，以及（c）刺激细胞分裂和内源性巢蛋白的潜在心脏分化+心脏中的神经干细胞。这些数据表明，ADM移植可能有直接和间接的临床益处，最近的一项研究报告成功生成诱导的多能干细胞衍生的系膜成血管细胞，支持获得足够数量的患者特异性系膜成纤维细胞用于临床的可行性[64]. 生成特定于患者的血管间充质干细胞还可以进行基因矫正和自体细胞移植，从而降低对供体细胞免疫反应的风险。DiI-标记的ADMs在老年人心肌中很少观察到中密度纤维板老鼠或mdx/utrn（通用）−/−老鼠。DiI数量低+所观察到的供体细胞可能是由于注射后心脏内ADM分裂，导致DiI稀释和/或体内ADM细胞死亡。肌营养不良蛋白阳性心肌细胞的存在表明，一些供体ADM分化为心肌细胞或与宿主心肌细胞融合，但肌营养不良阳性心肌细胞很少。DiI公司+在心外膜中检测到细胞，表达DDR2（54.94±9.23%）和cTnI（17.39±2.98%），但没有显示成熟心肌细胞典型的条纹或形态（补充在线图4）。
ADM注射后的功能益处也可能部分归因于mdx/utrn（通用）−/−老鼠(I–4K）。血管生成是干细胞治疗缺血性损伤的一个众所周知的间接效应，可改善心脏功能[52，65–67]. 肌营养不良蛋白缺乏型扩张型心肌病并非起源于缺血性，但有数据表明DMD患者和DMD小鼠模型中可能存在缺血[68–72]. 在人类患者中观察到小血管异常，包括内皮细胞肿胀和基底膜增厚，这些情况可能导致缺血[68–69]以及已知在缺血性条件下诱导的血管内皮生长因子在DMD患者的血清中升高。因此，营养不良蛋白缺乏心脏的血管生成可能减轻缺血区域以提供功能益处。
肌营养不良蛋白缺乏肌肉中血管系统的增加也可能通过刺激肌肉再生而产生次要的有益影响。肌卫星细胞数量增加和肌纤维再生，诱导肌营养不良蛋白缺乏骨骼肌的血管生成具有治疗益处[73]. 许多生长因子、细胞因子和趋化因子在杜氏肌营养不良患者的血清中上调mdx公司老鼠[74–78]. 通过血管生成增加这些因素的暴露可能导致巢蛋白的增加+在我们的研究中观察到细胞增殖。Nestin在心脏发育过程中表达[79]出生后心脏处于休眠状态[80]. 内斯汀+梗死大鼠心肌中也存在干细胞[54，55]以及终末期心力衰竭患者的梗死边缘区[56，81]在那里，它们有助于神经元神经支配、重塑和血管生成，并在缺血损伤后产生Nkx2.5阳性心肌细胞[56，57，81]. 我们发现了巢穴+细胞在野生型心肌中增殖，随着dystrophin缺乏，细胞增殖显著下降，这可能导致损伤后参与神经支配、血管生成和新心肌细胞形成的能力下降。这与DMD患者骨骼肌内源性肌源性干细胞增殖潜能下降的报道一致[82，83]2D边缘肌营养不良患者中成血管细胞数量减少[64]. 在肌营养不良动物模型中也有内源性肌干细胞数量减少的报道。Kudryashova等人最近报告了肢体肌肉营养不良小鼠模型中骨骼肌内激活的内源性卫星细胞数量减少、早期衰老和肌源性分化倾向降低[84]. Cassano等人最近的一份报告表明内源性心脏干细胞也可能受到影响[85]. 作者报道，从Duchenne型肌营养不良金毛猎犬模型心脏分离的心脏祖细胞在增殖、自我更新、体外分化为心肌细胞以及早期衰老的能力方面受损[85]. 干细胞再生肌肉的数量和能力的减少已被证明是导致骨骼肌疾病进展的原因之一中密度纤维板老鼠[86]也可能与肌营养不良蛋白缺乏心脏的心脏重塑有关。巢穴减少+我们在中密度纤维板和mdx/utrn（通用）−/−心脏在收缩引起的损伤后可能会导致再生能力下降。ADM注入归一化巢穴数+分裂细胞，我们观察到nestin+五分之四的横纹细胞表达心肌肌钙蛋白Imdx/utrn−/−注射ADM的小鼠。这是nestin的第一份报告+肌营养不良蛋白缺乏心脏中的纹状体细胞和对非缺血性损伤的反应，这表明它们可能参与ADM注射所观察到的DCM延迟。
与…对比mdx/utrn（通用）−/−14-16个月龄小鼠心脏注射干细胞中密度纤维板存在心脏病理学的小鼠没有提供功能益处，事实上加重了扩张型心肌病的某些特征。除了没有观察到ADM注射的功能益处外，我们也没有观察到血管生成、肌营养不良蛋白表达或巢蛋白增加+老年人心脏的干细胞分裂中密度纤维板心脏注射ADM。这些差异可能在一定程度上是由于中密度纤维板和mdx/utrn（通用）−/−老鼠。然而，在将ADM注射到5周大的年轻人的心脏后，检测到肌营养不良蛋白的表达中密度纤维板老鼠(K、，五十） 这表明，注射ADM后观察到的差异可能与小鼠的年龄和/或病理状态有关，而不是与营养不良状态有关。因此，心脏微环境可能对供体细胞的命运起作用。尤其是，纤维化可能会抑制ADM的迁移和存活，以及与心肌的整合。纤维化和瘢痕组织也被证明可以促进外源性干细胞分化为瘢痕组织中的成纤维细胞[87]. 我们没有观察到DDR2的数量增加+心脏成纤维细胞与ADM移植，表明ADM对老年人心脏成纤维纤维细胞没有显著作用中密度纤维板心脏（补充在线图4）。
C类结论
将具有肌营养不良蛋白基因功能拷贝的野生型ADMs移植到肌营养不良素缺乏的心脏可预防扩张型心肌病，诱导血管生成和内源性巢蛋白增殖+心脏中的干细胞，与nestin相关+心脏中的条纹细胞。然而，ADM移植的时机至关重要，因为在存在病理学的老年肌营养不良蛋白缺乏心脏注射后，这些事件不会发生。
A类确认
这项工作得到了伊利诺伊再生医学研究所的部分资金支持。M.H.S.目前隶属于韩国大田中南国立大学动物科学与生物技术系。
A类作者C类贡献
J.L.C.，概念和设计，数据收集和汇编，数据分析和解释，手稿写作；R.O.、数据收集、数据解释；M.H.S.和B.F.W.，数据分析；S.E.B.、构思和设计、财务支持、数据收集和汇编、数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准。
天披露P（P）电势C类关于…的冲突我利息
作者表示没有潜在的利益冲突。
R（右）参考文献
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