赖氨酸-6C^洛单核细胞衍生的巨噬细胞在最大程度的纤维化消退过程中占主导地位，并代表MMP-表达的主要亚群。

在确定了早期和最大纤维化消退时间（72小时）后，我们确定了特定肝巨噬细胞亚群是否存在相关变化。在流式细胞仪上，总的肝巨噬细胞被鉴定为来自消化肝脏非实质细胞部分的活的CD45+Ly-6G−NK1.1−CD3−B220−CD11B+F4/80+细胞(图S2A–E). 重要的是，与最大纤维化消退同时，肝巨噬细胞总数在72小时达到峰值(图2A类)巨噬细胞与肝瘢痕密切相关(图2B类).

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图2。

赖氨酸-6C^洛巨噬细胞在最大纤维化消退过程中占主导地位，是MMP表达的主要亚群。(A–G)最终CCl后24小时（炎症/纤维生成）、72小时（早期和最大瘢痕消退）和168小时（晚期消退）肝巨噬细胞的分析₄注入。对对照（未受伤）小鼠进行比较。(A类)用流式细胞术测定相对于对照肝脏中巨噬细胞平均数的肝巨噬细胞总数(n个=两个独立实验的每个时间点8–12）。(B类)F4/80免疫组织化学显示，72小时时巨噬细胞定位于瘢痕周围（比例尺：100μm）(C类)80层/四层^你好川11B^整数损伤和消退期间的常驻库普弗细胞（代表性百分比表示F4/80^你好川11B^整数细胞占总巨噬细胞的比例）。(天)CD11B的子集分析^你好80层/四层^整数单核细胞衍生的巨噬细胞根据Ly-6C的差异表达识别出两个不同的群体：Ly-6C^你好和Ly-6C^洛随着损伤和消退过程中的动态变化（代表性百分比表示每个亚群占肝巨噬细胞总数的比例）。(E类)Ly-6C的定量^你好，Ly-6C^洛和常驻巨噬细胞亚群占肝巨噬细胞总数的比例(n个=四个独立实验的每个时间点10–17）。(F类)每个时间点每个巨噬细胞亚群的每个肝脏相对数量相对于对照肝脏中平均总巨噬细胞数量的表达(n个=四个独立实验中每个时间点12–17）。(G公司和H（H）)CCl 4周后₄小鼠分别在0和48小时给予荧光基质金属蛋白酶底物（MMPsense）或溶媒对照，24和72小时收获。(G公司)通过流式细胞术在24和72小时鉴定MMPsense阳性巨噬细胞。(H（H）)24和72小时MMPsense阳性巨噬细胞群的巨噬细胞亚群分析(n个= 3–4). 所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）< 0.001. 显示了具有代表性的流式细胞仪图、直方图和图像。

肝巨噬细胞的流式细胞术分析能够识别不同的亚群。功能4/80^你好川11B^中间的巨噬细胞在对照组（未受损）肝脏中占主导地位，代表库普弗细胞群(22) (图2C类). 在活动性炎症/纤维生成期间（24小时），常驻巨噬细胞的比例降低，在消退期间逐渐增加(图2C类和E类). CD11B^你好80层/四层^中间的子集表示招募的单核细胞衍生巨噬细胞群(22). 对该亚群中Ly-6C表达的分析确定了两个明显不同的肝脏募集巨噬细胞群：Ly-6C^你好和Ly-6C^洛(图2天). 在纤维生成和消融过程中，这些巨噬细胞的数量发生了动态变化(图2天和E类). 而在纤维形成期间（24小时），Ly-6C^你好（纤维化前）巨噬细胞是主要的亚群(21) (图2E类)在最大瘢痕溶解时间（72小时），当巨噬细胞数量达到峰值时，Ly-6C减少^你好人口和Ly-6C的显著增加^洛巨噬细胞成为优势种群(图2E类). 总的来说，当绝对巨噬细胞数量被量化时，这些变化也很明显(图2F类). 因此，Ly-6C^洛最大瘢痕溶解时的单核细胞衍生巨噬细胞是整个损伤和恢复期内最多的巨噬细胞群（比未损伤肝脏中巨噬细胞总数增加4.13±0.5倍）。

在晚期消退（168小时）期间，巨噬细胞亚群的相对比例恢复到对照肝脏，尽管Ly-6C的比例仍然增加^洛子集(图2E类). 我们之前已经证明巨噬细胞MMP的表达对纤维化的消退至关重要(12). 为了确定主要的肝脏MMP表达巨噬细胞亚群，我们使用pan-MMP底物（MMPsense），该底物在体内被活性MMPs裂解后变成荧光(23)，使我们能够通过流式细胞术鉴定MMPsense阳性的肝巨噬细胞群(图2G公司). 在纤维形成（24小时）和最大基质降解（72小时）期间对这些细胞的亚组分析表明，在这两个时间点，主要表达MMP的活性巨噬细胞群是Ly-6C^洛巨噬细胞(图2H（H）). 因此，Ly-6C^洛单核细胞来源的巨噬细胞在纤维化消退的最快阶段积聚最多。此外，它们代表了纤维化发生和纤维化消退期间MMP表达的主要人群。

CD11B-阳性巨噬细胞的耗竭定义Ly-6C^洛细胞对疤痕修复至关重要。

为了确定不同巨噬细胞亚群在介导瘢痕溶解中的功能作用，我们使用了一种精心设计的选择性体内巨噬细胞耗竭策略(11).川11B将启动子-白喉毒素受体（CD11B-DTR）转基因小鼠给予CCl₄持续4周。为了确保在疤痕快速消退的整个阶段最大限度地消耗巨噬细胞，在最终CCl后48、72和96小时，静脉注射白喉毒素（DT）（或PBS对照）₄注射后120小时收获(图3A类). 与以前的数据一致(17)，DT的给药可有效消耗两种循环单核细胞（Ly-6C^你好和Ly-6C^洛) (图S3A类和B类). Ly-6C的耗竭程度更为严重^洛与之相一致的单核细胞是Ly-6C分化形成的更成熟的细胞类型^你好单核细胞(15)因此，耗竭后需要更长的时间来补充(24).

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图3。

CD11B阳性巨噬细胞的耗竭定义Ly-6C^洛细胞对于疤痕的消退至关重要。(A类)通过给药DT（或PBS对照）在CD11B-DTR小鼠纤维化解决期间巨噬细胞耗竭模型的示意图。(B类)来自PBS和DT处理小鼠肝脏的流式细胞术数据，这些小鼠以CD45+Ly-6G−CD11B为受体^你好80层/四层^整数肝巨噬细胞（每个亚群的代表性百分比占所示巨噬细胞总数的比例）。(C类)PBS处理肝脏中每个巨噬细胞亚群相对数量相对于平均总巨噬细胞数量的定量(n个=11–13，来自两个独立实验）。(天)巨噬细胞耗竭或控制后胶原1、胶原3和α-SMA的典型PSR染色和免疫组织化学。（比例尺：100μm）(E类)通过像素分析量化PBS治疗肝脏中相对于平均百分比面积的组织学变化(n个=10–12，来自两个独立实验）。(F类)PSR、胶原1和胶原3面积评估的纤维化程度与Ly-6C相对数量的相关性^洛巨噬细胞(n个=22，来自两个独立实验）。所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001. NS，无显著性。显示了具有代表性的流式细胞仪图和图像。

我们继续分析CD11B-DTR小鼠的肝巨噬细胞亚群(图3B类和C类). 重要的是，当Ly-6C达到最大纤维化程度时，给予DT^洛肝内巨噬细胞占主导地位，导致该亚群在收获前显著耗竭，导致120h时相对数量减少76.7±3.16%(图3B类和C类). 肝脏Ly-6C的小群体没有消耗^你好可以看到巨噬细胞，但常驻巨噬细胞数量略有增加(图3C类). 相比之下，当Ly-6C和^你好和Ly-6C^洛肝巨噬细胞大量存在。CD11B-DTR小鼠在最终CCl后8小时服用DT_4,在24小时收获的情况下，使用该策略，我们观察到两种Ly-6C的普遍消耗^你好和Ly-6C^洛单核细胞源性巨噬细胞亚群(图S3C类). 因此，个体占主导地位的时间消耗对选择性至关重要。从这些数据中可以明显看出，Ly-6C^洛肝巨噬细胞亚群在DT后比Ly-6C更容易耗竭^你好子集。这一结果可能反映了Ly-6C中CD11B表达水平较高^洛巨噬细胞比Ly-6C^你好子集(图S3天). 重要的是，在纤维化退行期给予DT不会引起肝中性粒细胞或CD3阳性细胞数量的变化(图S3E类和F类). 此外，这种耗竭策略导致持续的纤维化，表明未能重塑肝疤痕(图3天和E类). 巨噬细胞耗竭后，α-SMA区域未检测到差异，表明观察到的表型是基质降解减少而非肌成纤维细胞活化增加的结果(图3天和E类). 为了证实这些发现的特异性，我们按照相同的时间表给WT小鼠注射DT（或PBS对照）(图3A类). WT小鼠服用DT对巨噬细胞亚群或肝纤维化没有影响(图S3G公司和H（H）). 进一步显示肝脏Ly-6C的特异性作用^洛巨噬细胞对纤维化的回归，我们发现Ly-6C的数量在统计学上显著负相关^洛巨噬细胞与纤维化程度(图3F类)表明该亚群的耗竭程度与残留瘢痕的数量直接相关。至关重要的是，Ly-6C的数量之间没有显著相关性^你好或常驻巨噬细胞和纤维化程度(图S3我和J型).

这些发现表明Ly-6C^洛巨噬细胞是解决肝纤维化和恢复正常组织结构的关键。此外，考虑到Ly-6C的时间和数值关联^洛瘢痕降解时间最大的子集(图2天–F类)事实上，他们是主要的MMP表达人群(图2H（H）)，我们假设这些代表了难以捉摸的恢复性巨噬细胞。

CD11c+树突状细胞（DC）与肝损伤的缓解有关(25,26)与巨噬细胞共享一些细胞表面标记(27). 72小时时恢复性巨噬细胞亚群仅表达中等水平的CD11c(图S4A类). 此外，对慢性损伤的CD11c-DOG小鼠给予DT，剂量已知会耗尽肝DC(28)对确定的肝巨噬细胞亚群没有影响(图S4B类和C类)表明肝树突状细胞对这些人群没有显著贡献。

赖氨酸-6C^洛巨噬细胞来源于招募Ly-6C的原位表型转换^你好单核细胞。

纤维前体Ly-6C^你好巨噬细胞亚群已被证明来源于趋化因子（C-C基序）受体2（CCR2）依赖性循环Ly-6C的募集^你好单核细胞(21). 考虑到肝脏Ly-6C^洛巨噬细胞也是单核细胞衍生的(图2天)，恢复性巨噬细胞必须来源于补充的Ly-6C^你好或Ly-6C^洛单核细胞。血液分析表明，在纤维形成活跃期（24小时），循环单核细胞的数量增加，而在最大分辨率（72小时）期间，只有Ly-6C^你好单核细胞保持升高(图S5A–C).

为了确定哪些循环单核细胞群体有助于恢复性巨噬细胞的形成，进行了过继转移和体内标记实验。过继移植时，C57BL/6小鼠（CD45.2+）可诱导肝纤维化；最终CCl后4小时₄注射，我们注射了9×10⁵FACS分类骨髓衍生CD45.1+Ly-6C^你好单核细胞（Ly-6G−CD115+CD11B+Ly-6C^你好单元格）(图S5天)或通过尾静脉控制车辆，24、72和168小时收获(图4A类). 过继转移CD45.1+Ly-6C^你好在纤维形成活跃期（24小时）和早期消退期（72小时），可以在肝脏中检测到单核细胞，但在消退后期不能检测到(图4B类). 即使在24小时时，这些单核细胞也已分化为Ly-6C^洛巨噬细胞(图4C类–E类). 该群体仍然是72小时时过继转移单核细胞形成的主要巨噬细胞群体(图4C类–E类). 确定Ly-6C的相对贡献^洛单核细胞到肝巨噬细胞亚群，我们使用了一种经过验证的体内标记技术(29,30). 慢性损伤后4周CCl₄给小鼠200μL荧光乳胶珠（选择性标记循环Ly-6C^洛单核细胞）在最终CCl后4小时通过尾静脉₄注入。在24、72和168小时收获动物(图4F类). 该技术导致循环Ly-6C的选择性标记^洛单核细胞(图S5E类和F类)如前所示(29,30). 尽管循环Ly-6C同时阳性，但在24或72小时时仍无法在肝脏中发现乳胶阳性细胞^洛单核细胞(图4G公司). 然而，在晚期消退（168小时）期间出现了肝内乳胶阳性细胞群(图4H（H）)，主要在常驻巨噬细胞群中(图4H（H）和我).

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图4。

赖氨酸-6C^洛肝巨噬细胞来源于招募的Ly-6C^你好单核细胞。(A类)CD45.1+Ly-6C过继转移模型示意图^你好最终CCl后4 h，单核细胞（或载体对照）进入C57BL/6小鼠（CD45.2+）₄注射，在24、72和168小时收获肝脏(B类)在24和72小时的时间点鉴别消化肝脏中注射的CD45.1+细胞（对存活的CD45.2-细胞进行门控）。(C类)肝CD45.1+细胞主要分化为CD11B^你好80层/四层^整数单核细胞衍生的巨噬细胞。(天)CD45.1+单核细胞在很大程度上形成了恢复性Ly-6C^洛巨噬细胞亚群。(E类)确定形成每个巨噬细胞亚群的CD45.1+肝巨噬细胞比例的量化(n个=每个时间点3）。(F类)循环Ly-6C原位标记模型示意图^洛在最终CCl后4小时通过注射荧光乳胶珠（或载体对照）获得单核细胞₄注入。(G公司)乳胶阳性巨噬细胞仅在168小时时在肝脏中被发现（通过活体CD45+Ly-6G−肝巨噬细胞进行门控）。(H（H）)乳胶阳性细胞形成了常驻CD11b^整数80层/四层^你好巨噬细胞数量。(我)在168小时时，形成每个肝巨噬细胞亚群的晚阳性细胞比例的量化（以晚阳性细胞的百分比表示；n个= 4). (J型和K（K）)K（K）_我-67最终CCl后24、72和120小时肝巨噬细胞染色₄受伤4周后服用。(J型)K（K）_我-流式细胞术鉴定67阳性巨噬细胞。(K（K）)在指定时间点所述巨噬细胞亚群的百分比确定为K（K）_我-67–阳性(n个= 3–6). 所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001. 显示了具有代表性的流式细胞仪图和比例。

最近的研究也表明，在慢性炎症过程中，巨噬细胞的聚集对局部增殖起着关键作用(31). 鉴于Ly-6C的数量急剧增加^洛巨噬细胞最大分辨率(图2F类)，我们确定了局部巨噬细胞增殖对该人群的贡献。使用流式细胞仪K（K）_我-CCl 4周后肝脏非实质细胞的67染色₄，我们可以识别增殖的肝巨噬细胞(图4J型). 有趣的是，募集的促炎性Ly-6C^你好在最终CCl后24、72和120小时，巨噬细胞群代表了最增殖的巨噬细胞亚群₄注入(图4K（K）). 事实上，Ly-6C的数量^你好巨噬细胞迅速下降(图2E类和F类)在主动增殖的背景下，强调该群体在体内经历表型转换。

这些数据表明，恢复性Ly-6C^洛巨噬细胞来源于循环的Ly-6C^你好单核细胞是纤维化前巨噬细胞的常见来源，体内表型转换导致纤维化修饰能力。此外，Ly-6C^洛单核细胞对分解前的群体没有贡献，但在分解后期对常驻巨噬细胞池的重新聚集有贡献。

赖氨酸-6C^洛巨噬细胞显示有利于疤痕分离的特征基因表达谱。

确定Ly-6C^洛巨噬细胞，来源于Ly-6C的表型转换^你好单核细胞对肝纤维化的消退至关重要，我们试图确定这种新发现的巨噬细胞亚群产生的介质，赋予其恢复功能。Affymetrix小鼠基因微阵列在FACS分选的恢复性72-hLy-6C上进行^洛巨噬细胞，并与24小时前纤维化Ly-6C进行比较^你好巨噬细胞具有共同的起源、不同的功能作用以及在纤维生成分解模型的关键时间点的相对优势。通过定量PCR确认特定的微阵列点击。

已确定了一些差异调节基因，完整列表可在表S1和S2系列.与巨噬细胞MMP表达在纤维化解决中的关键作用相一致(12)，转化为前分辨率巨噬细胞表型与MMPs上调相关(图5A类). 此外，一些促炎细胞因子和趋化因子下调，同时与抗炎巨噬细胞程序相关的基因[例如趋化因子（C-X3-C）受体1（CX3CR1）](32)或抗纤维化作用（例如巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）和CD74）(33)增加了(图5A类). 在恢复性巨噬细胞群中，TGF-β和凝血酶原反应蛋白-1（Thbs1）（潜在TGF-(34). 我们还发现了其他促分辨机制，如胰岛素样生长因子1（Igf1）的表达强烈增加，这被认为是抗纤维化的(35) (图5A类). 因此，向恢复性巨噬细胞表型的转变提供了许多促分辨率特征，突出了组织纤维化消退的细胞机制的重要性。

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图5。

赖氨酸-6C^洛巨噬细胞显示出有利于瘢痕溶解的基因表达谱。(A类和B类)炎症性Ly-6C的微阵列分析^你好和恢复性Ly-6C^洛最终CCl后24和72小时通过FACS分类从肝脏中分离出的肝巨噬细胞群₄分别注入。(A类)炎症和恢复性巨噬细胞群之间细胞因子、趋化因子、趋化因子受体、生长因子和基质降解酶的差异调节（表示为两个巨噬细胞亚群之间的倍数变化）。(B类)微阵列上巨噬细胞亚群之间调理蛋白、吞噬相关基因、PPAR-γ靶基因和巨噬细胞表型标记（M1，经典；M2，替代）的差异表达（表示为两个巨噬细胞群体之间的倍数变化）。所有微阵列数据基于n个=每组3个，取自两个独立的实验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (C类)流式细胞术分析比较炎性Ly-6C的表达^你好和恢复性Ly-6C^洛肝巨噬细胞。在收获前24小时给予MMPsense，以比较巨噬细胞亚群与炎症巨噬细胞亚群平均MFI表达的MMP活性(n个= 3–6). MFI，平均荧光强度*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (天)24和72小时时小鼠肝脏和肝硬化人类肝脏微阵列上差异调节基因的免疫组织化学（所示为典型图像）。（比例尺：100μm）

我们使用DAVID生物信息学工具对来自两个巨噬细胞群的差异调节基因进行了通路富集分析(36,37). 促炎巨噬细胞群体的途径丰富，包括对创伤的反应、凝血级联反应和趋化性(图S6A类)对纤维生成很重要(38,39). 对恢复性巨噬细胞的分析显示，溶酶体、内吞作用、清道夫受体和抗原呈递等通路丰富，这些通路与吞噬作用有关(图S6B类). 我们还确定了脂肪酸代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路的增强(图S6B类). 吞噬相关基因的富集被单独证实，其中许多视蛋白、受体和参与凋亡细胞识别、结合和清除的基因在恢复性巨噬细胞群中上调(图5B类). 类似地，在这些分解前巨噬细胞中，许多PPAR-γ靶基因被上调(图5B类). 我们还评估了一些先前描述的M1和M2巨噬细胞标记物的表达程度，以确定肝脏炎症和恢复性巨噬细胞如何适应传统范式(图5A类和B类). 尽管Ly-6C^洛恢复性巨噬细胞表现出一些M2基因的表达增加，如巨噬细胞甘露糖受体1（Mrc1）、精氨酸酶1（Arg1）和视网膜色素a（Fizz-1），它们还下调其他特征M2基因，包括Chi3l3（YM-1）、Il-1受体拮抗剂（Il1rn）、Kdm6b（Jmjd3）、Ccl24、Il-10和TGF-β(14,40). 同时，这些Ly-6C^洛巨噬细胞上调传统M1基因，如Ciita（MHC II类反式激活因子）、CD16、CD32和Serpine1（纤溶酶原激活物抑制剂1型）(14,40,41). 因此，这些肝巨噬细胞群不符合M1/M2分类，并代表新确定的巨噬细胞表型(图5B类).

我们继续使用流式细胞术在蛋白质水平上证实了一些基因表达的变化(图5C类). 此外，通过在收获前24小时给予MMPsense，我们发现从炎症表型到恢复性巨噬细胞表型的转变导致活性MMP表达增加(图5C类). 我们的微阵列数据还使我们能够使用Chi3l3、MMP-12和糖蛋白（跨膜）nmb（Gpnmb）的免疫组织化学原位识别功能不同的巨噬细胞亚群(图5天). 我们在CD11B-DTR耗竭模型中证实了这些标记物的特异性，DT的给药在组织学上导致MMP-12阳性细胞的数量显著减少(图S6C类)而Chi3l3阳性细胞的数量没有显著差异(图S6天)，反映了流式细胞仪上的变化(图3B类和C类). 我们进一步发现在肝硬化患者肝脏中存在与瘢痕相关的类似MMP-12和GPNMB表达细胞(图5天)并将其鉴定为人类CD68阳性巨噬细胞的亚群(图S6E类和F类).

这些数据表明，向恢复性巨噬细胞群的表型转换导致促炎基因表达的丢失、基质降解酶的表达增加以及吞噬相关基因的富集。此外，已确定的巨噬细胞表型不属于M1/M2范式，这突出了该分类在体内环境中的局限性。

恢复性Ly-6C^洛巨噬细胞是吞噬后细胞。

在确定吞噬相关通路的上调后，我们确定恢复性巨噬细胞是否为吞噬后巨噬细胞。众所周知，摄入细胞碎片会影响巨噬细胞表型(42). 此外，根据血清ALT和AST评估，在我们的模型中，肝细胞死亡减少后，肝纤维化得到缓解(图1天)表明恢复性Ly-6C的增加^洛人口(图2E类和F类)发生在清除细胞碎片之后。

流式细胞术和免疫组织化学分析表明，与促炎24h Ly-6C相比^你好巨噬细胞，修复性72-h Ly-6C^洛巨噬细胞较大[前向散射面积（FSC-A）]，较复杂[侧面散射面积（SSC-A）(图6A类和B类). 我们FACS对这两个巨噬细胞亚群进行了分类，并对每个亚群进行TUNEL染色，以使用共焦显微镜量化细胞内或细胞外凋亡碎片的存在(图6C类). 与TUNEL阳性碎片相关的每个巨噬细胞亚群的百分比没有差异(图6天). 然而，在促炎性巨噬细胞中，凋亡碎片主要结合在细胞表面，而在恢复性巨噬细胞亚群中，碎片被摄入(图6C类和E类)，确认Ly-6C的吞噬后表型^洛巨噬细胞数量。这些发现与单核细胞结合凋亡碎片的已知能力一致，但在分化为更成熟的巨噬细胞亚型之前，其摄取能力有所延迟(43,44).

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图6。

恢复性Ly-6C^洛巨噬细胞为吞噬后细胞。炎症（24小时Ly-6C）的比较^你好)和恢复性（72小时Ly-6C^洛)CCl 4周后巨噬细胞亚群₄. (A类)通过流式细胞术评估巨噬细胞亚群的大小[正向散射面积（FSC-A）]和复杂性[侧面散射面积（SSC-A）(n个=13，来自三个独立实验）。(B类)F4/80免疫组织化学显示72小时时瘢痕相关巨噬细胞较大（比例尺：50μm）(C–E类)FACS分类亚群的TUNEL染色和共聚焦显微镜。(C类)染色的DAPI、TUNEL、F4/80和巨噬细胞亚群的合并图像。（比例尺：10μm）箭头、细胞表面碎片；箭头，摄入的碎片(天)通过细胞计数与TUNEL阳性细胞核相关的每个亚群的百分比(n个= 3–4). (E类)TUNEL相关巨噬细胞与摄入或细胞表面碎片的百分比(n个= 3–4). 数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. NS，无显著性。显示了具有代表性的图像。

体外巨噬细胞吞噬通过ERK信号诱导基质降解表型。

在确定先前吞噬作用是恢复性巨噬细胞群的关键特征的证据后，我们试图在体外模拟这种表型。考虑到CCl中主要的细胞碎片₄该模型是肝细胞衍生的，我们确定摄入肝细胞碎片是否会引起巨噬细胞表型的类似变化。初级骨髓源性巨噬细胞（BMDM），广泛用于体外研究巨噬细胞生物学(45)在有无应变匹配的原代小鼠肝细胞产生的细胞碎片的情况下培养。共培养后巨噬细胞形态发生显著变化，与肝细胞碎片的摄入一致(图7A类). 单是肝细胞碎片并没有附着在微孔上。摄入后，BMDM上调Mmp12、Mmp9和Igf1，下调Thbs1和Chi3l3(图7B类)，反映了体内的表型转换(图5A类和B类). 为了证实MMPs的活性分泌，并确定这种作用是否是独立于碎片类型的巨噬细胞吞噬作用的一般效应，我们使用了凋亡胸腺细胞的精确吞噬模型(46). 喂食凋亡胸腺细胞12 h的BMDM培养上清液显示明胶酶谱和Western blotting分别检测到活性MMP-9和MMP-12分泌显著增加(图7C类和天).

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图7。

体外巨噬细胞吞噬通过ERK信号诱导基质降解表型。(A类和B类)骨髓基质干细胞与肝细胞碎片的共培养(A类)相差显微镜下巨噬细胞形态的变化。仅肝细胞碎片是不粘附的。(B类)共培养后巨噬细胞基因表达的变化相对于单巨噬细胞的平均表达(n个=11–12，来自两个独立实验）。(C类和天)BMDM与凋亡胸腺细胞的共培养。(C类)平衡蛋白质含量的培养上清液的明胶酶谱显示活性MMP-9（来自n个=4，来自两个独立实验）。(天)蛋白质含量相等的培养上清液上MMP-12的Western blot（来自n个=4，来自两个独立实验）。(E类)最终CCl后72小时小鼠肝脏F4/80和磷酸化-ERK的双重免疫荧光₄受伤4周后服用。箭头，核pERK和F4/80双阳性细胞。（比例尺：10μm）(F类和G公司). 培养BMDMs±MEK1/2抑制剂（PD98059；50μM）±肝细胞碎片(F类)共培养后巨噬细胞基因表达的变化相对于单巨噬细胞的平均表达(n个= 6). (G公司)培养上清液的酪蛋白酶谱与显示活性MMP-9和MMP-12的蛋白质含量相等（来自n个=3（如图所示）。数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 显示了具有代表性的图像。

然后，我们试图确定哪些信号通路可能将巨噬细胞吞噬作用与基质降解活性的增加联系起来。MAPK信号，特别是ERK和p38级联，在吞噬作用后在巨噬细胞中被激活，据报道它调节许多巨噬细胞反应(47,48). 使用免疫组织化学方法，我们可以在72小时时识别巨噬细胞中的核磷酸化-ERK染色(图7E类)表明在最大纤维化消退期间，瘢痕相关巨噬细胞中ERK信号通路激活。为了显示ERK信号在观察到的巨噬细胞表型中的功能作用，我们按照公布的剂量给BMDM注射了特异性ERK激酶[丝裂原活化蛋白激酶激酶1和2（MEK1/2）]抑制剂PD98059（50μM）或载体对照(49,50)在体外喂食肝细胞碎片之前和期间持续1h。服用PD98059可显著抑制巨噬细胞对摄入肝细胞碎片后Mmp9、Mmp12和Igf1的上调(图7F类). 此外，培养上清上的酪蛋白酶谱图显示，ERK抑制消除了吞噬作用后观察到的活性MMP-9和MMP-12分泌的增加(图7G公司)表明MEK1/2激活在巨噬细胞对吞噬反应的基质降解活性增加中起着关键作用。MEK1/2抑制对Thbs1和Chi3l3对吞噬作用的下调没有影响(图S7A类)这表明信号通路之间的串扰是产生恢复性巨噬细胞复杂的整体表型所必需的。我们使用第二种特异性抑制剂UO126（20μM）证实了MEK1/2在巨噬细胞Mmp12上调反应中的作用(图S7B类). 按公布剂量服用p38 MAPK抑制剂（SB203580；10μM）(51)对巨噬细胞吞噬反应中Mmp9、Mmp12或Igf1的表达没有影响(图S7C类).

这些数据表明，前分辨率巨噬细胞的基质降解表型可以通过细胞碎片的吞噬作用在体外模拟，这种表型转换至少部分是由巨噬细胞中吞噬相关的MEK1/2激活和ERK信号介导的。

肝纤维化模型。

使用至少6周龄的成年雄性小鼠。每周两次腹腔注射CCl诱导肝纤维化₄（0.4μL/g；西格玛）在橄榄油（西格玛油）中稀释1:3，持续4周（九次注射）。最终CCl后，在规定的时间点扑杀动物₄注入。对于耗竭研究，DT（PBS中为10 ng/g；List Biological Laboratories）或PBS对照品在规定的时间点通过尾静脉静脉注射给纤维化CD11B-DTR或WT小鼠。在规定的时间点，通过静脉注射DT（12 ng/g）或PBS对照，对纤维化CD11C-DOG小鼠进行DC耗竭。在规定的时间点通过尾静脉进行过继性移植实验，使用(我) 9 × 10⁵FACS分选CD45.1⁺赖氨酸-6C^你好RPMI 1640或载体对照组的骨髓单核细胞；(ii（ii）)250μL荧光乳胶珠[0.5μm氟硅石多色红色微球；2.5%固体（wt/vol）在PBS中稀释为1:25，用于注射；Polysciences Inc]或车辆控制；和(三)250μL脂质体(60)（由N.v.R.提供）、CM DiI标记的（Invitrogen）脂质体（根据制造商的方案标记）或PBS对照。

流式细胞术和FACS分类。

对含有肝白细胞总数的肝非实质细胞进行流式细胞术（使用BD-LSR Fortessa II）和FACS分类（使用BD-FACSAria II）(SI材料和方法). FACS分选常规产生95%以上的细胞纯度水平。

体内MMP活性检测。

为了检测体内MMP活性，根据制造商的方案，在收获前24小时通过尾静脉给动物注射2 nmol MMPsense 680（Perkin-Elmer）（或载体对照）。用流式细胞术鉴定肝巨噬细胞，然后用635nm激发激光鉴定MMPsense阳性巨噬细胞(23).

微阵列分析。

根据制造商的协议，使用Ovation Pico WTA系统（NuGen）处理来自FACS分类细胞的50毫微克RNA(n个=每组3人）。处理后的RNA与Affymetrix基因芯片小鼠基因1.0 ST阵列杂交。RNA/微阵列处理由ARK Genomics（罗斯林研究所）进行。按照说明进行数据分析(SI材料和方法). 调整后的折叠变化>2P（P）<0.05被认为是个体基因变化的显著因素。利用DAVID工具进行了基因本体和京都基因与基因组百科全书（KEGG）路径富集分析(36,37)在显著差异表达的基因上。阵列Express数据库中提供了微阵列数据(网址：www.ebi.ac.uk/arrayexpress)注册号为E-MEXP-3177。

体外吞噬试验。

如前所述制备BMDM、原代小鼠肝细胞碎片和凋亡胸腺细胞(SI材料和方法); 2 × 10⁵在12孔板中每个孔接种BMDM，然后添加5×10⁵洗涤死肝细胞（或对照培养基）和1×10⁶在37°C 5%（vol/vol）CO下培养16小时（或胸腺细胞培养12小时），以1:10稀释度（或PBS对照）洗涤死胸腺细胞或脂质体₂DMEM/F12谷氨酰胺（Gibco）培养基中含有10%FCS。如有说明，将抑制剂PD98059（50μM；Cayman Chemical）、UO126（20μM；New England Biolabs）、SB203580（10μM；开曼化学）或DMSO对照物添加到电镀BMDM中1 h，然后在整个16 h培养过程中与肝细胞碎片一起保持。然后收集上清液并将其储存在−80°C，用PBS强烈洗涤三次，去除未被消化的肝细胞或脂质体，并使用残留的粘附巨噬细胞进行额外分析。在仅含有肝细胞碎片的对照孔中，未检测到粘附细胞。

统计分析。

所有数据均表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。使用单因素方差分析和事后Tukey检验对多组进行统计评估。使用Student对两组进行统计评估t吨如果数据不是正态分布的，则进行检验或Mann-Whitney检验。值为P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

我们感谢S.M.Anderton教授提供CD45.1小鼠，感谢A.S.MacDonald博士提供CD11c-DOG小鼠。P.R、M.A.V.和V.K.S.得到了威康信托研究培训奖学金的支持。A.P.、R.L.A.、S.N.H.和J.P.I.得到了医学研究委员会项目拨款的支持。L.B.获得了医学研究委员会博士学位的支持。A.A.由爱丁堡皇家外科学院资助。T.T.G.-W.和M.J.W.由医学研究委员会研究培训奖学金资助。D.R.D.和J.R.M.得到了爱丁堡英国心脏基金会卓越研究中心的部分支持。J.A.F.得到了医学科学院和健康基金会的支持。S.J.F.得到了Jules Thorn爵士信托基金的支持。