癌症中的脯氨酸脱氢酶（氧化酶）

1.2. PRODH/POX抑制缺氧诱导因子1（HIF-1）信号

在常氧和缺氧条件下，PRODH/POX下调HIF-1信号，包括其下游基因VEGF[20]. HIF-1作为一种转录因子，调节各种基因对缺氧的反应。它在肿瘤的发展中起着重要作用，包括血管生成、肿瘤生长和侵袭，因此是一个很有吸引力的肿瘤治疗靶点。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β组成。HIF-1α决定HIF-1的形成和转录活性。众所周知，HIF-1α的稳定性和转录活性受到细胞氧张力的严格控制，肿瘤内缺氧可导致其积聚。在缺氧条件下，2-酮戊二酸（也称为α-KG）依赖性双氧酶家族成员脯氨酰羟化酶（PHD），HIF-1α的羟化特异性脯氨酸残基，导致其与Von-Hippel-Lindau（VHL）蛋白结合，泛素化，最终蛋白体降解[22]. 在缺氧条件下，由于关键底物氧气的不可用性，HIF-1不会羟基化，从而稳定下来。研究表明，PHD的活性随着α-KG（一种重要的共底物）浓度的增加而增加[22]. 此外，一些TCA循环中间产物，如琥珀酸和富马酸，抑制PHD活性并稳定HIF-1信号[22,23].

如所示图2当脯氨酸可用时，PRODH/POX的高表达增加了脯氨酸依次降解为谷氨酸和α-KG。HPLC分析支持这一假设，表明PRODH/PO_X的过度表达确实增加了α-KG的水平[20]. 此外，与其他人的观察结果一致[22]广泛使用的α-KG类似物二甲基草酰甘氨酸可阻断PRODH/POX诱导的HIF-1信号的抑制，提示α-KG在PRODH/PO_X下调HIF中起着关键作用。此外，PRODH/POX降低了琥珀酸、富马酸和乳酸的水平[20]. 进一步的研究应该阐明这种调节是否也有助于HIF-1信号传导。

2.2. PPARγ刺激PRODH/POX

在筛选除p53以外的PRODH/POX调节因子的研究中，我们的实验室联合转染了多种转录因子和荧光素酶报告子构建物，其中包含PRODH公司启动子进入各种结直肠癌细胞系。这些研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是最有效的PRODH公司启动子，而其他一些转录因子，如c-Jun、c-Fos和NF-κB的p-65，仅表现出适度的作用[17]. PPAR响应元素（PPRE）存在于PRODH公司启动子，以及配体激活的PPARγ与PRODH公司启动子经电泳迁移率转移分析（EMSA）和染色质免疫沉淀分析（ChIP）证实[17].

PPARγ属于核激素受体超家族，作为配体依赖性转录因子发挥作用[30]. PPARγ的配体可以是天然的，如前列腺素和氧化脂质，也可以是合成的和药理的，即噻唑烷二酮类（TZDs）。PPARγ调节通路的调节在代谢和炎症反应中起着重要作用，尤其是在葡萄糖稳态中。TZDs已被用作治疗2型糖尿病的降血糖药物。值得注意的是，PPARγ及其配体在癌症中也起着重要作用。PPARγ在许多恶性组织中广泛表达。一系列研究表明，其配体可以诱导多种癌细胞分化、凋亡、自噬和抑制细胞生长[31,32]，尽管PPARγ配体也可能有助于特定癌细胞在特定环境下的细胞存活[33,34]. 2型糖尿病患者的流行病学研究表明，TZDs显著降低了肺癌的风险[35]. 然而，这些影响的机制尚未建立。PPARγ对PRODH/POX的调节为理解其在肿瘤中的作用提供了新的线索。

药理学TZD不仅激活PRODH公司启动子活性，但也上调PRODH/POX蛋白表达[17]. 此外，来自不同组的研究表明，TZDs曲格列酮和罗格列酮显著增加了包括结直肠癌细胞和非小细胞肺癌细胞在内的几种癌细胞系中ROS的生成[17,36,37]. 两组均表明，这些TZD通过ROS信号诱导细胞凋亡，siRNA敲除PRODH/POX显著抑制TZD刺激的ROS生成和细胞凋亡。这些结果表明，PRODH/POX在PPARγ的抗癌作用中起着关键作用。还需要进一步的研究来确定PRODH/POX是否也介导PPARγ及其配体的其他效应，以及这些效应是否可以扩展到其他癌症细胞和肿瘤模型体内事实上，我们最近的研究表明，在暴露于氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的肿瘤细胞中，PRODH/POX在PPARγ诱导的自噬中起着生存因子的作用[34]，其脂质成分为PPARγ配体[38]. 这一点将在后面讨论。

2.3. miR-23b下调PRODH/POX*

MiRNAs是长度为18-25个核苷酸的保守、内源性表达、非编码小RNA。它们是过去十年中发现的一类新的转录后调节物，通过与靶mRNA 3'非翻译区（UTR）的相互作用抑制蛋白质翻译或诱导mRNA降解[39]. 到目前为止，已经在人类中鉴定出700多个miRNAs。它们调节数千个基因的表达，因此是细胞功能的关键调节器，包括增殖、分化、凋亡和代谢信号。miRNAs的异常表达或改变与各种人类疾病，尤其是癌症有关。miRNAs对基因表达的控制可能发生在所有癌细胞中。它们的靶点通常是重要的蛋白质，如癌蛋白（即c-MYC、RAS）、肿瘤抑制蛋白（即p53）或调节细胞周期的蛋白质。根据其调节的靶点，miRNAs可以在肿瘤发生中充当致癌基因或抑癌基因。因此，抑癌蛋白PRODH/POX能否被miRNAs靶向成为一个有趣的问题。上述PRODH/POX转录物与肿瘤蛋白表达之间的不一致进一步促使我们探索miRNAs对PRODH/PO_X的调控。

使用靶向预测算法，预测了91个潜在的miRNA靶向PRODH/POX mRNA 3'UTR[24]. 以下miRNA微阵列显示，与正常细胞相比，10个miRNA在肾癌细胞中的表达增加。然而，当10个模拟miRNAs转染到正常肾上皮细胞（ECs）中时，只有miR-23b*显著抑制PRODH/POX蛋白表达，但不抑制mRNA水平。相反，在肾癌细胞中，对miR-23b*的抑制性对抗剂可以逆转PRODH/POX表达的降低。随后，通过将模拟miR-23b*和含有PRODH/POX mRNA 3'UTR的荧光素酶报告子共同转染到细胞中，实验证实miR-23b*与PRODH/PO_X mRNA 3’UTR直接结合。

正常肾脏内皮细胞中miR-23b*的异位表达损害了PRODH/POX的功能，包括PRODH/PO_X诱导的ROS生成、凋亡和PRODH/P_X抑制的HIF-1信号[24]. 另一方面，当肾癌细胞中miR-23b*被抑制时，ROS生成和细胞凋亡百分比增加，HIF-1信号减少。这些发现提供了一种通过降低miR-23b*水平或阻断其对PRODH/POX的影响来抑制肿瘤细胞生长的治疗策略。

从人肾癌组织和匹配正常组织获得的数据体内miR-23b*和PRODH/POX蛋白水平均存在显著差异，miR-23b*和PRODH/POX蛋白质之间呈负相关，证实了在体外上述调查结果[24]. 这些发现表明，miR-23b*增加可能通过下调肿瘤抑制因子PRODH/POX而促进肾肿瘤的发生和发展。

3.1. 葡萄糖剥夺下的PRODH/POX

众所周知，肿瘤细胞主要利用葡萄糖和谷氨酰胺作为其主要能量来源，但这种成瘾需要充足的血液供应。随着肿瘤细胞的快速生长，肿瘤细胞将进入一个血管化不足的阶段，即使新生血管化，血液输送也不均匀，许多肿瘤细胞不仅缺氧，而且会缺乏包括葡萄糖和谷氨酰胺在内的营养物质。此时，为了满足其生物能量需求，肿瘤细胞有必要寻求替代能源。脯氨酸在细胞微环境中的可用性、其独特的代谢和对不同胁迫的反应确保了脯氨酸作为能源的可能性。的确，脯氨酸在各种肿瘤中的浓度增加[43,44]. 在肿瘤中观察到金属蛋白酶（MMPs）降解ECM的上调，ECM是肿瘤微环境中脯氨酸的主要储存库，是肿瘤进展和转移的关键步骤[45,46].

Pandhare等人表明，即使在葡萄糖限制的情况下，RKO结直肠癌细胞的细胞内ATP水平也保持不变[13]. 葡萄糖耗竭后，MMP-2和MMP-9的表达和活性增加，同时细胞内脯氨酸水平增加。与这些发现一致，PRODH/POX活性和表达显著上调。使用暴露于低葡萄糖浓度的DLD1-POX tet-off细胞，通过去除四环素诱导PRODH/POX，导致ATP显著增加。由于脯氨酸循环和磷酸戊糖途径之间存在连锁关系，我们通过比较有无PRODH/POX诱导的DLD1-POX四射细胞中磷酸戊糖通路的活性，通过测量¹⁴一氧化碳₂从1生成-¹⁴C-葡萄糖[47]. 正如预期的那样，PRODH/POX的诱导使戊糖磷酸途径增加了5倍以上，并且在低葡萄糖浓度范围内可以看到这种增加。为了进一步证实磷酸戊糖途径活性的增加与ATP的增加有关，我们用脱氢表雄酮（DHEA）处理细胞，DHEA是一种众所周知的G6PDH抑制剂[48]，戊糖磷酸途径的速率限制酶。结果表明，DHEA能显著降低细胞ATP依赖于PRODH/POX的增加[49]. 因此，通过将P5C循环为脯氨酸，磷酸戊糖途径可以至少部分促进PRODH/POX诱导的ATP产生。此外，脯氨酸衍生的α-KG在TCA循环中的无补体作用也可能有助于PRODH/POX诱导的ATP生成。

雷帕霉素（mTOR）通路是哺乳动物对细胞外营养物质可用性作出反应的重要信号通路[50]. mTOR属于磷脂酰肌醇3-激酶相关酶家族，是细胞生长、增殖和能量代谢的重要调节器。它可以使合成代谢和分解代谢过程与营养物质的可用性相协调，因此它的抑制可以模拟营养或能量应激的条件[13,51]. 因此，为了支持上述发现，我们使用mTOR抑制剂雷帕霉素模拟了RKO结肠直肠细胞中的营养素饥饿信号，雷帕霉素直接与mTOR结合以阻止TOR复合物1的形成。因此，PRODH/POX被激活以产生脯氨酸依赖性ATP。脱氢脯氨酸是PRODH/POX酶活性的抑制剂，可以阻断PRODH/PO_X的生物能反应[13]. 在雷帕霉素处理的RKO细胞中，随着PRODH/POX活性和ATP生成的增加，磷酸戊糖途径的活性增加了2倍。葡萄糖剥夺引起的mTOR下调似乎是PRODH/POX上调的一种机制。

AMP-activated protein kinase（AMPK）是肿瘤细胞适应营养或缺氧的关键能量传感器。重要的是，AMPK也是mTOR活性的上游抑制剂。因此，作为上述研究的对照，我们研究了AMPK在葡萄糖剥夺诱导PRODH/POX中的作用[13]. 葡萄糖提取后，RKO细胞中磷酸化AMPK的激活显著增加。合成AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（AICAR）诱导PRODH/POX活性的剂量和时间依赖性增加。因此，AMPK激活可能是在低葡萄糖应激条件下介导PRODH/POX诱导以维持细胞能量水平的途径。mTOR是激活AMPK的下游信号之一，可能有助于此调节。

3.2. 缺氧肿瘤微环境下的PRODH/POX

虽然氧气比葡萄糖等营养物质更容易通过组织扩散，但缺氧是肿瘤发展过程中微环境的一个公认的重要特征，肿瘤中的氧气分布模式与葡萄糖相似。因此，我们将对PRODH/POX的研究扩展到缺氧或缺氧合并低血糖的情况[52]. 通过转染PRODH公司将启动子荧光素酶构建到多种肿瘤细胞系中，我们发现缺氧显著增加了PRODH公司发起人。实时PCR证实了PRODH/POX在大多数癌细胞系中的上调，包括结肠、肾脏、乳腺、前列腺、黑色素瘤、肺和卵巢的癌细胞系。在HT29结直肠癌细胞中，PRODH/POX蛋白随着缺氧而呈时间和剂量依赖性增加。缺氧和葡萄糖联合剥夺导致PRODH/POX蛋白水平增加。

使用MDA-MB-231 HRE-EGFP乳腺肿瘤异种移植物，我们进一步显示了缺氧微环境中PRODH/POX的上调体内[52]. MDA-MB-231 HRE-EGFP是一种人乳腺癌细胞系，在含有缺氧反应元件（HRE）的启动子的控制下表达EGFP报告基因，该启动子可以与HIF-1结合并被HIF-1诱导[46]. PRODH/POX和EGFP的免疫组织化学和共定位分析表明，PRODH/PO_X与EGFP表达呈正相关，EGFP对缺氧有反应，提示缺氧可上调PRODH/P_X。令人惊讶的是，进一步的研究表明低氧诱导的PRODH/POX表达既不依赖于HIF-1α，也不依赖于调节靶基因低氧调节的关键转录因子HIF-2α。与葡萄糖饥饿下AMPK介导的PRODH/POX诱导相一致，AMPK激活的特异性抑制剂化合物C阻断了低氧诱导的PRODH/POX表达增加。

额外的功能分析表明，增加PRODH/POX有助于癌细胞在缺氧和缺糖条件下的存活[52]. 此外，使用脱氢脯氨酸或PRODH/POX siRNA，我们发现在缺氧条件下，PRODH/PO_X的存活贡献是由于其诱导ROS，而不是ATP。这里的活性氧被用于诱导生存前自噬，而不是上述的凋亡和细胞生长抑制。AMPK抑制剂化合物C可抑制自噬，提示AMPK-PRODH/POX-ROS自噬是缺氧条件下的生存途径。然而，AMPK的下游因子mTOR与PRODH/POX诱导的自噬反应无关，尽管AMPK通过抑制mTOR活性而诱导自噬。另一方面，无论有无缺氧，在葡萄糖缺乏的情况下，PRODH/POX通过降解脯氨酸促进ATP生成。这些结果表明，根据特定的微环境应激，PRODH/POX对脯氨酸的分解代谢提供了ATP和ROS产生之间的转换点。调节这种转换的机制是一个有趣的问题，需要进一步研究。