实验性局灶性癫痫的功能和结构完整性表征：网络效率降低与白质改变一致

摘要

介绍

据报道，癫痫患者出现广泛的双侧结构和功能异常，即使癫痫综合征是局部相关的、特发性的或隐匿性的，并且大脑在常规磁共振成像（MRI）上看起来正常[1],[2]在两种白色中都观察到远离致痫区的这种组织损伤[2],[3]和灰质[4],[5],[6].

这些组织完整性的细微渐进性变化在常规MRI中大多无法检测到，并延伸至原发性癫痫区域的边缘以外[7]，被认为是反复发作传播的结果[8]这被认为在癫痫中起着关键作用，因为这些变化可能会显著改变全球结构和功能网络拓扑[9].

图论分析提供的精确数学形式极大地促进了大脑网络的表征[10]在图分析中，网络表示为一组顶点和边。可以根据配置顶点和边的类型来描述不同的网络类。更具体地说，三个网络类，即规则类、小世界类和随机类，可以根据它们的聚类（分离属性）和最短路径（集成属性）进行区分。在规则网络中，聚类和最短路径的值都很高。在另一个极端，如果节点是随机互连的，则这两个度量值都很低。较低的最短路径值和较高的聚类值反映了小世界网络拓扑结构，这被认为是用于全球信息传输和本地处理的最佳网络配置[11].

据电生理学报告，癫痫患者的聚类和最短路径发生了显著变化[12]几项研究表明，在癫痫发作期间，全球网络从一个小世界拓扑结构转变为一个更规则的拓扑结构。基于这些发现，人们假设发作间期癫痫功能网络具有更随机的拓扑结构，即与规则的拓扑结构相反[13]最近，局灶性（通常是暂时性）癫痫患者的发作间期脑网络具有功能和结构特征，并与对照网络进行了比较[14],[15],[16],[17],[18],[19]然而，结果并不明确。集群和最短路径的增加[14],[17],[19]在发作间期癫痫状态下，这些网络属性减少[15]此外，据报告，集群减少，路径长度增加[16]研究人群的方法差异或不可比性可能归因于所发现的不同网络拓扑。自然历史的不可分性是大多数观测研究的一个众所周知的威胁[20]研究颞叶癫痫患者网络差异的具体混杂因素包括可能的热性癫痫病史、发病年龄、纳入时癫痫持续时间、双重病理的存在[21]以及使用抗癫痫药物治疗。尤其是后者可能会导致网络拓扑结构的改变，因为抗癫痫药物可能会影响大脑发育，从而导致长期的神经后果[22]在临床环境中，很难将这些外来影响与自发复发性癫痫对网络拓扑结构的影响充分区分开来。

在一个特征明确的新皮质癫痫动物模型中进行的一项临床前研究允许在空间和时间上评估局灶性癫痫对发作间期网络拓扑结构的影响，而无需上述混杂因素，这两个组除了发生自发性复发性癫痫外是相同的。在这项研究中，我们旨在描述局部致痫区域发生的自发反复发作对功能网络结构的影响。为此，我们通过系列方法测量了新皮质局灶性癫痫大鼠模型发作间期脑网络变化的时空演变体内静息状态功能性MRI（rs-fMRI）采集超过10周的时间。用rs-fMRI测量自发的低频血氧水平依赖性（BOLD）波动，可以评估大脑半球、区域或体素水平上的信号同步变化。功能网络是基于大脑通信中的神经元信号同步。我们对rs-fMRI采集的纵向设置提供了有关局灶性癫痫患者大脑网络拓扑结构稳定性的信息。我们有以下假设：（a）功能性区间网络向更随机的拓扑转移；（b） 这些变化随着时间的推移是一致的；（c） 网络变化与半球内和半球间功能连通性的变化有关。

另一个尚未解决的问题是功能连接性、网络拓扑和微结构白质损伤之间的关系，这在局灶性癫痫中常见[2],[3]因此，我们纳入了扩散张量成像（DTI），它能够无创地评估白质结构重组。对白质结构的质疑体内基于有效捕获为扩散张量的扩散过程的测量。最常用的扩散张量参数是分数各向异性，这是体素内扩散的首选方向性的度量。与传统结构MRI相比，DTI在检测白质微结构改变方面更为敏感[3],[23],[24]我们假设癫痫诱导的网络拓扑和功能连接改变伴随着双侧白质组织水分扩散特性的远程变化。

揭示网络拓扑结构变化的程度和时间进程，以及在受控环境下与结构白质完整性的关系，可能为局灶性癫痫的发病机制及其对脑功能的影响提供新的见解。

结果

癫痫模型

我们使用了一个众所周知的局灶性癫痫破伤风毒素大鼠模型[25],[26]右侧初级运动皮层为注射侧[27],[28]破伤风毒素注射导致所有动物频繁、轻微但持续的面部运动发作。自发的、耐受性良好的癫痫发作呈簇状出现，持续数周。注射破伤风毒素后一周左右开始发作，在七周时发作频率达到峰值（平均每30分钟发作8次），随后在最近一个时间点出现下降(图1，左）。癫痫发作通常持续10秒到3分钟。此外，癫痫发作特别发生在麻醉开始和恢复期间，脑电图（EEG）记录证实了这一点，在0%异氟烷麻醉下，脑电图显示高振幅有节奏的尖峰，与运动伪影无关(图1，右侧）。当异氟醚浓度为1%时，癫痫大鼠没有出现临床发作，EEG也没有记录到发作性放电，尽管偶尔会观察到发作间期放电。诱导后第二周出现重复全身强直阵挛性癫痫发作或癫痫持续状态的五只动物被排除在进一步分析之外。第二周后，四只大鼠出现攻击行为，并被单独饲养。破伤风毒素治疗组大鼠的正常体重随时间增加略有减少，仅在第21天体重值才降低（对照组：415±20 g；癫痫组：381±31 g（平均值±SD）；第页 = 0.03).

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图1

研究随访期间的自发性癫痫发作。

左图：30分钟观察期内的发作簇数。右图：在1.0%异氟烷（C）的条件下，从对照大鼠10分钟记录中选取具有代表性的5秒脑电图；诱导七周后，在1.0%异氟烷（I）的间歇作用下，以及在0%异氟烷的运动性癫痫发作期间，对癫痫大鼠进行治疗。发作间期脑电图的特点是与对照脑电图具有相似的基线节律，且发作间期棘波不常见。发作性脑电图包括高振幅节律性棘波序列（仅显示一个）。

在解剖图像上检查注射部位的结构损伤。吨₂-加权扫描对频繁癫痫发作引起的水肿性脑改变很敏感[29]。我们在第7天发现低信号，但在随后的时间点没有。

静态功能MRI

功能网络的图形分析

大脑网络中第7、21、49和70天的归一化聚类系数（γ）和归一化特征最短路径长度（λ）如所示图2两个实验组。

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图2

图形分析结果。

对照组（C）和癫痫动物（e）在第7、21、49和70天的全球脑功能网络特征的时间模式，即归一化聚类系数（γ）和归一化特征最短路径长度（λ）。对照组在一段时间内未发现明显变化。癫痫网络的特征是在7周内γ和λ增加。在最后一个时间点，发作间期网络和对照之间没有差异。线性混合模型分析得出的统计显著性表明，各因素具有p<0.05的差异。

基于重复线性混合模型拟合，我们发现组间γ差异显著(第页 = 0.04）和时间(第页 = 0.01). 癫痫组γ随时间增加(第页 = 0.009），但不在对照组。我们发现团队和时间之间存在显著的λ交互作用(第页 = 0.02). 在癫痫组而非对照组中，λ随时间增加(第页 = 0.003). 在癫痫组中，γ和λ的差异随时间恢复正常，在癫痫诱导10周后达到对照值。

功能连接的感兴趣区域分析

中概述的左右感觉运动皮层（感兴趣区域（ROI）的平均功能连通图图3A)大脑的其余部分清楚地显示，注射大脑半球的相邻皮层和皮层下尾状壳核内的半球内功能连接增强(图3C)以及对侧半球的较小程度(图3E)，在癫痫组长达7周。癫痫诱导21天后，感觉运动ROI和对侧半球的大脑半球间功能连通性降低，随后恢复(图3).

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图3

双侧感觉运动皮层的空间功能连接图。

左右感觉运动皮层与大脑其他部分的功能连接图。右侧（同侧）（白色）和左侧（对侧）感觉运动皮层ROI（橙色）覆盖在T的冠状切片上₂-加权大鼠脑模板(A类). 右、同侧功能连通图(B类：对照组；C类：癫痫组）和左侧、对侧感觉运动皮层(D类：对照组；E类：癫痫组）。时间点（天）显示在左侧。功能连通性(z（z）'）值范围为0.15至1.0。对照组在所有时间点的两个感觉运动皮层之间显示出强大且一致的功能连接。在癫痫患者的大脑中，功能连通性在第7天升高，延伸至邻近的次级躯体感觉和内侧扣带回皮质、皮质下尾状壳核和对侧同源区。癫痫诱导后第21天，两个ROI的大脑半球间功能连接明显减少，并在以后的时间点恢复。

对照组动物左右大脑皮层感觉运动区的半球间和半球内功能联系随时间保持稳定(图4). 相反，癫痫组的整体大脑半球间功能连通性减弱（群体效应：第页 = 0.04;图4). 这是由于第21天的减少(第页 = 0.01），其中八分之七的癫痫大鼠呈强阴性z（z）'值（反相关）。癫痫大鼠的大脑半球内功能连通性增强（群体效应：第页 = 0.001（同侧），第页 = 0.003（对侧）），在第70天恢复到控制水平。

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图4

半球之间和半球内部的功能连通性。

半球间功能连通性（作为标准化相关性：z（z）'）在对照组（C）和癫痫组（E）中，同侧（中间图）和对侧半球（右侧图）的同侧和对侧感觉运动皮层区域（左图）和半球内功能连通性（同一半球内与感觉运动ROI相连的体素体积）之间。对照组的大脑半球间功能连通性随时间稳定，但癫痫组在第21天时降低。癫痫组的大脑半球内功能连通性在七周内增加，但在最近一个时间点下降到控制水平。线性混合模型分析得出的统计显著性表明因子具有p<0.05。

扩散张量成像

局灶性癫痫导致白质各向异性分数（FA）值显著降低，这在诱导后一周内即可观察到。图5显示了所有时间点的基于区域的空间统计（TBSS）分析结果。发现同侧内囊和外囊的FA显著减少。在随后的时间点，在两个半球的所有主要白质束中都发现FA降低，最严重的是在随后恢复的七周时间点。我们在T上未发现异常信号增强₂-加权图像（未显示数据）。

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图5

基于区域的空间统计结果。

基于轨迹的空间统计输出，说明癫痫患者大脑白质分数各向异性（FA）值与对照组相比存在显著差异（蓝色：减少；红色：增加。颜色代码表示第页<0.01 –第页<0.001; 错误发现率修正），覆盖在相邻冠状大鼠脑切片的平均FA图上。白色物质骨架显示为绿色。时间点（天）显示在左侧。

除了全脑体素白质统计数据外，还对内侧胼胝体进行了ROI分析（如图6，最右边）。表观扩散系数（ADC）的平均FA轨迹_追踪)，两组各时间点的轴向和径向扩散率值如所示图6癫痫组在所有时间点的胼胝体FA值均低于对照组(第页 = 0.006). 随着时间的推移，两组的FA都有所增加(第页<0.0001). 模数转换器_追踪，组间轴向和径向扩散率值无差异，但两组的径向扩散率均存在显著的时间效应(第页 = 0.002). 模数转换器_追踪轴向扩散系数不随时间变化。

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图6

胼胝体扩散张量成像测量。

分数各向异性（FA）、轴向和径向扩散率以及ADC_追踪对照组和癫痫组胼胝体内侧各时间点的值。对照组动物的FA逐渐增加。在癫痫大鼠中，这种与年龄相关的增加延迟，绝对值较低。其他三个参数均未显示组或组×时间交互作用的显著差异。胼胝体ROI覆盖在FA模板上（ROI为白色；显示在三个正交方向的切片上）（最右侧）。线性混合模型分析得出的统计显著性表明因子具有p<0.05。

讨论

在本研究中，我们在难治性局灶性新皮质癫痫大鼠模型中应用了系列rs-fMRI和DTI，以纵向表征与慢性癫痫相关的功能连接、全球网络结构和白质完整性。

通过在癫痫诱导后的多个时间点获取全脑连接数据，我们对发作间期网络拓扑的时间剖面有了新的见解。我们的主要发现是：（a）基于图形的网络属性γ和λ在间歇状态下增加，表明大脑网络配置更加规则；（b） 癫痫患者大脑半球间功能连接减少，而大脑半球内功能连接增加；同时，结构白质完整性被破坏，不仅限于致痫灶附近的束，还包括主要连合结构胼胝体。

多种模型研究强调了网络组织对癫痫发作传播的重要性[30],[31],[32],[33]并经脑电图证实[17],[34]，脑磁图（MEG）[14]，rs-fMRI[15],[18]和DTI[16]在这项研究中，我们假设在癫痫发作缓解期，局灶性癫痫脑对癫痫发作的发生和扩散具有更高的敏感性，这与更随机的网络组织有关[30],[35]这一假设主要基于先前报道的癫痫发作期间向更有序的网络结构转变，与颞叶发作间期状态和失神癫痫综合征相比[12],[36]然而，迄今为止尚未将皮质局灶性癫痫的发作间期网络拓扑与健康对照网络状态进行直接比较。我们在新皮质局灶性癫痫模型中的研究表明，与健康大脑相比，发作间期癫痫大脑具有更有序的结构，具有更高的γ和λ。与之前的全球网络癫痫研究相比，我们对网络拓扑进行了连续评估。这为未知的发作间期神经元网络动力学提供了独特的见解。最重要的是，受影响的网络拓扑在十周内恢复。这种恢复与癫痫发作频率的降低相一致。网络拓扑的这种实质性改变可能是对先前横断面研究中发现的相互矛盾结果的解释之一。我们推测，大脑半球内功能连接的增加与局部神经元的萌芽有关，而与发作间期脑状态中的远距离功能相互作用有关。然而，未来的研究需要通过纵向（免疫）组织病理学实验来解决这个问题，最好是在局灶性癫痫诱导后的多个时间点，对髓鞘形成和轴突完整性进行染色。

全球网络属性的纵向变化与半球内功能连通性的模式密切相关。我们假设γ和半球内功能连接性增加之间的关系，因为γ是功能节点趋向于聚集在一起的程度的度量。γ增加与失神癫痫患者先前无癫痫发作网络的发现相一致[14]和颞叶新皮质癫痫[17]其中，较高的发作间期γ在EEG和MEGδ谱带中最为显著。这种增加与神经干扰与功能网络组织的变化相关的观点一致[37],[38]并且可能发生在广泛的癫痫综合征中。另一方面，另一项颞叶癫痫（TLE）研究报告了λ较低的发作间期功能网络[15]与我们的研究结果不同的是，病灶位置（颞叶与初级运动皮层）、癫痫持续时间（13年以上与周）、抗癫痫药物的使用以及人类和大鼠的网络组织差异。

λ是对快速组合来自分布式大脑区域的专业信息的能力的度量[10]在我们的研究中，观察到发作间期λ的增加伴随着大脑半球间功能连接的减少，这表明了这些参数之间的关系。两种测量结果的最大偏差出现在第21天，随后在最近的时间点进行了标准化。尽管功能性网络路径表示统计关联序列，很难与结构网络进行类比，但建模表明功能性静止状态网络在很大程度上与底层结构网络重叠[39]胼胝体完整性受损可能是λ和半球间连通性降低的原因。λ增加和大脑半球间功能连接减少之间的潜在关系也与最近的一项研究相一致，该研究报告称，胼胝体切开术后大脑半球间低频血氧水平依赖性（BOLD）信号相关性显著丧失，而大脑半球内的网络则得以保留[40]然而，两个半球之间连接的白质的完整性是否真的与半球间功能连接的减少有关，还需要进一步研究，例如使用计算模型[41].

了解癫痫患者大脑结构连接的状态非常重要，因为上述全球网络的改变可能是由白质异常引起的，例如可能是假定的长距离功能连接基础的联系纤维的断裂。我们的结构分析通过纵向比较对照组和药物初始受试者，补充了之前的DTI癫痫研究。白质FA变化的时间模式与λ的时间变化相似，表明两者之间存在密切关系：第21天和第49天出现广泛异常，10周后恢复。TBSS结果表明胼胝体受到了显著影响，这一点得到了特定ROI分析的证实。

DTI患者双侧大脑半球的弥漫性结构异常与之前的部分癫痫DTI研究一致（概述见：[2],[3]). 对结构损伤和功能网络组织相关变化的可能解释包括突触变化、神经元死亡或胶质细胞损伤。在继发性癫痫发生过程中观察到突触改变[42]，表明解剖学上较远的区域由于原发性致痫区的神经元改变而发生生理变化[43].

此外，实验研究表明，反复发作会导致海马体神经元损伤和细胞死亡[44],[45]尽管缺乏组织学研究来检查反复发作与海马外远程损伤之间的关系，但我们从海马研究中得知，轴突脱髓鞘、轴突棘形成、水肿导致间质液量增加、轴突被胶质细胞取代、，星形胶质细胞增殖可能都与癫痫发作引起的损伤有关[46].

尽管啮齿动物癫痫模型可能不同于人类癫痫，但它们使我们能够以详细和可控的方式研究与癫痫的发展和进展相关的特定病理生理机制。例如，与锂-匹罗卡品相比，破伤风毒素模型相对温和[47]和红藻氨酸[48]TLE模型，需要延长癫痫持续状态，诱导弥漫性损伤。因此，我们在破伤风毒素模型中发现的功能和结构变化更可能仅由频繁发作传播引起，而不是由破伤风毒物引起的脑损伤的直接影响。我们发现癫痫发作频率与图形特性、函数连接性和分数各向异性的变化之间存在时间关系，这一观点得到了加强。

我们动物研究的一个局限性是必须使用麻醉。已知异氟烷麻醉以剂量依赖性方式抑制整体功能连接[49]虽然我们已经证明，在轻度到轻度异氟醚麻醉下，低频BOLD波动基本上保持不变[50]在静止状态fMRI采集期间自发BOLD波动的相关性，因此图形边缘和基于ROI的功能连接的强度可能低于清醒状态。

我们使用的TBSS方法有一些缺点[51],[52].TBSS允许，与基于体素的形态测量类似[53]在组水平上比较全脑地图，但由于不需要空间平滑，因此更适合FA分析。尽管如此，部分体积效应可能仍然存在[54]TBSS也可能导致在具有多个交叉纤维种群的地区进行错误估计[54]TBSS的另一个潜在缺点是细化预处理步骤。细化过程使统计分析只关注FA最高的体素。因此，白质束低FA区的白质变化被忽略。这些缺点也可能适用于我们的数据，尽管我们认为它们影响不大。我们分析的白质束不包含有明显交叉纤维的区域。此外，我们分析的大鼠的主要白质束本质上是薄结构（即外囊、胼胝体、内囊）。因此，减薄的效果将适中。

不幸的是，我们无法在采集MRI的同时测量EEG，这在技术上具有挑战性，并且可能会影响fMRI的质量，因为电极会在T上造成潜在的伪影₂ ^*-加权图像。这使我们无法排除自发发作对休息状态fMRI BOLD波动的任何影响。然而，我们确实认为这种影响不大可能发生。我们在静息状态fMRI采集过程中使用异氟烷麻醉大鼠，异氟烷是自发性癫痫的有效抑制剂[55]在所有动物每次MRI检查后，我们都在相同的异氟醚水平下采集了EEG，并且没有观察到自发的临床或心电图发作。发作间期癫痫发作罕见。只有当异氟醚麻醉停止时，癫痫才开始发作。因此，我们确信，根据本研究中使用的麻醉方案，通过休息状态fMRI测量的功能连通性反映了发作间期功能连通性，与频繁的自发性发作无关。

最后，尽管新皮质破伤风毒素大鼠模型与神经细胞死亡无关[56]灰质和白质MRI测量值与组织学测量的显微结构完整性之间需要直接相关。特别是，功能和结构MRI参数与细胞水平的适应性之间的直接关联将有助于描述可塑性过程的特征，而可塑性进程可能在易复发性自发癫痫的脑组织中发挥作用。

材料和方法

乌得勒支大学动物实验伦理委员会批准了动物实验方案。实验是根据欧洲共同体理事会指令的指导方针进行的。共有26只9周大的雄性幼年Sprague-Dawley大鼠（美国马萨诸塞州Charles River Laboratories International，Inc.）参与了该研究，它们在第0天的体重为283±25 g（平均值±标准偏差）。在标准条件下（提供食物和水）将动物分组饲养随意，12小时光照/12小时暗循环，温度22-24°C）。

静态fMRI分析

静息状态fMRI能够评估大脑的功能连通性。如果两个区域之间的神经元信号（以低频BOLD波动衡量）在时间上是一致的，则认为这些区域在功能上是相连的。有几种方法可以计算这种时间相干性。我们使用了皮尔逊相关系数第页。我们随后将其归一化第页进入之内z（z）‘使用Fisher’sz（z）'-转换[65]通过空间平滑（最大值为1.0 mm的平滑核全宽）、带通滤波（0.01至0.1 Hz之间）和带有细微信号的线性回归，包括平均脑BOLD信号振荡、来自白质的平均信号、，来自脑脊液的平均信号，以及从运动校正中获得的旋转和平移参数[64]完成这些预处理步骤后，进行了两次rs-fMRI分析；（a） 全球网络分析，包括所有皮层和皮层下体素，以及（b）基于ROI的左右感觉运动皮层分析。

网络分析

每个功能数据集都被视为一个加权无向网络，由图描述G公司 =  (V（V）,W公司)，其中V（V）是节点数W公司是边的集合w个_ij公司是V（V）×V（V）对称权重矩阵，其中w个_ii（ii） = 0.在我们的数据中，V（V）是收集的N个皮层和皮层下灰质体素和w个_ij公司归一化相关系数z（z）'，在体素时间序列之间定义我和j个.N个动物和时间点之间略有不同（平均值±标准偏差：2003±126）。具有负相关值的边被设置为0。

我们通过加权无向聚类系数量化局部和全局图结构[66]和最短路径长度[67]，使用C++Boost图形库(网址：www.boost.org;[68]).

总聚类系数定义为：

节点的聚类系数我:

考虑三角形中所有边的权重，但不考虑不参与任何三角形的权重。L（左）定义为所有节点对上的平均测地线长度：

具有.

调和平均法避免了计算中包含断开节点L（左）并类似于全局效率度量（即1/∞→0）[69]。对于每个功能数据集，L（左）和C类使用100个代理网络进行标准化。这个数字足以产生稳定的代理网络属性（数据未显示）。使用中描述的随机重新布线程序构建代理网络[70].归一化加权L（左）和C类定义为：

区域利益分析

为了确定全球功能网络拓扑变化的基础，我们还进行了三种不同的基于ROI的分析：（a）左右ROI的平均感觉运动皮层信号与所有脑体素的相关性。获得的连接性图在z（z）'>0.15并覆盖在解剖模板上；（b） 左右感觉运动皮层ROI信号平均值的相关性，作为大脑半球间功能连通性的测量[64]; （c） 对于每个半球，计算显著相关的所有体素的总体积（即。，z（z）'>0.15），该半球内感测运动ROI的平均信号，作为半球内功能连通性的测量。

致谢

脚注

工具书类