肝纤维化消退过程中肌成纤维细胞恢复为非活性表型

肝星状细胞是CCl的主要来源₄-激活的肌成纤维细胞。

aHSC对CCl肝肌成纤维细胞的作用₄-使用流式细胞术对分离的非实质性肝细胞组分进行检测，该组分包含aHSC/肌成纤维细胞、炎症细胞和内皮细胞(8). 通过Col-GFP表达鉴定肌成纤维细胞，通过维生素A表达鉴定HSC(1,4,8)（在405nm处检测到紫激光猝灭的自荧光信号）(图1C类;SI附录，图.S1型). GFP公司⁺细胞（92±3%）共表达维生素A，表明aHSC代表CCl中纤维原性肌成纤维细胞的主要群体₄-先前定性研究预测的肝损伤(9). 因此，aHSC可以在I型胶原表达上调的基础上进行基因标记(SI附录，图S2)在CCl中₄-诱导肝纤维化是因为其他细胞来源对肌成纤维细胞的数量没有显著贡献。

肝纤维化消退过程中某些aHSC凋亡。

我们假设肝纤维化消退过程中aHSC/肌成纤维细胞的消失可能是由于细胞衰老导致的死亡(三)和凋亡(2)、失活或两者兼而有之(图1D类). 肝纤维化消退过程中HSC的凋亡已被充分证实(2). 一致的是，我们通过共定位可裂解半胱氨酸蛋白酶-3检测到凋亡的aHSC/肌成纤维细胞（2.6±0.7%）⁺和GFP⁺CCl后7天Col-GFP小鼠肝脏中的细胞₄肝细胞凋亡最高时停止(SI附录，图S3). 总的来说，肝纤维化的早期（7天）恢复伴随着一些aHSC/肌成纤维细胞的凋亡。

从CCl中恢复1个月后，基因标记的aHSC/肌成纤维细胞在肝脏中持续存在₄.

为了确定某些肝肌成纤维细胞是否在纤维化的消退中存活，Col-α2（I）^{Cre-YFP公司}小鼠[胶原蛋白-α2（I）^Cre公司×Rosa26^{flox-Stop-flox-YFP}老鼠；SI附录，图S2]接受CCl治疗₄（2个月），允许恢复（1个月），然后分析基因标记的YFP的持久性⁺单元格(图2一). 通过GFAP和Desmin的表达鉴定HSC，通过α-SMA的表达检测aHSC/肌成纤维细胞。HSC（98±2%）被激活（例如YFP上调）以响应CCl₄治疗后，在94±4%的肌成纤维细胞（α-SMA）中检测到YFP的表达⁺). 虽然恢复1个月后，肝脏中的肌成纤维细胞已完全消失，但YFP⁺细胞惊人地持续存在。特别是，在38±8%的Desmin中检测到YFP的表达⁺和GFAP的41±5%⁺细胞，与之前激活的HSC一致(图2一).

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图2。

基因标记的aHSC在恢复1个月后仍然存在。(一)胶原蛋白-α2的肝脏（I）^{Cre-YFP公司}小鼠（无损伤：n个= 4; CCl公司₄-处理：n个= 8; 恢复时间：1个月n个=10）用于YFP、GFAP、Desmin或α-SMA。YFP在恢复1个月后鉴定出基因标记的HSC⁺Desmin表达⁺或GFAP⁺细胞。YFP的数量⁺HSC是相对于总HSC计算的（100%，合并1，P（P）与CCl相比<0.05₄和恢复组）。显示Nuclei（DAPI，合并2）。(B类)HSC（维生素A⁺)来自胶原蛋白-α2（I）^{Cre-YFP公司}小鼠（无损伤：n个= 4; CCl公司₄-处理：n个= 6; 恢复时间：1个月n个=6）用流式细胞仪进行分析。同时使用维生素A鉴定基因标记的aHSC和iHSC⁺和YFP⁺表达式。显示了点图；P（P）<0.01（与YFP相比⁺aHSC和YFP⁺iHSC）。(C类)基因标记的GFP⁺肝星状细胞在三苯氧胺诱导的Col-α2的肝脏中持续存在（1）^{ER-预处理-GFP}从CCl中恢复1个月后₄为了避免HSC在发育过程中出现遗传标记，他莫昔芬诱导的Col-α2（1）^{ER-预处理-GFP}小鼠通过交叉Col-α2（1）产生^ER核心小鼠×Rosa26^{flox-Stop-mTRed-flox-mGFP}小鼠（此处标记为Rosa26^{f/f-mTRed（f/f-mTR）}小鼠）和CCl治疗₄（2个月），在CCl的最后一周每天服用三苯氧胺诱导aHSC的基因脉冲标记₄治疗。治疗后，小鼠恢复1个月以逆转肝纤维化。通过膜标记GFP的免疫染色显示基因标记的HSC⁺（同时失去mTRed表达：合并1），取DAPI染色的细胞核（合并2），20倍物镜。基因标记GFP的数量⁺HSC以Desmin的百分比计算⁺HSC（100%，合并3）。针对CCl，实现了35±6%aHSC的遗传标记₄.绿色荧光蛋白⁺iHSC（14±4%）在恢复1个月后持续存在于肝脏中(P（P）< 0.05; CCl公司₄和恢复组进行比较），确认CCl₄-纤维化消退后，活化的HSC（及其后代）仍留在肝脏中。

免疫组织化学(图2一)和流式细胞术(图2B类)来自Col-α2（I）的梯度纯化HSC^YFP公司小鼠确定了三种HSC表型：(我)qHSC（维生素A⁺YFP公司⁻α-SMA⁻), (ii（ii）)aHSC（维生素A⁺YFP公司⁺α-SMA⁺)，以及(三)灭活的造血干细胞[（iHSCs），维生素A⁺YFP公司⁺α-SMA⁻]. 纤维化恢复后，56±4%的HSC同时表达YFP⁺和维生素A⁺表明这些iHSC有I型表达史，但恢复为失活表型(图2B类).

胶原蛋白-α2（I）和-α1（I）形成三股螺旋，产生I型胶原蛋白，并在aHSC/肌成纤维细胞中共存(10). 为了独立确认上述发现，我们使用Col-α1（1）^{Cre-YFP公司}小鼠，通过交叉胶原-α1产生（I）^Cre公司小鼠(SI附录，图S4一)与Rosa26^{flox-Stop-flox-YFP}老鼠。如预期，CCl₄Col-α1的治疗（1）^{Cre-YFP公司}小鼠产生aHSC（Desmin⁺YFP公司⁺α-SMA⁺细胞；SI附录，图S4B类和C类). 尽管α-SMA⁺恢复1个月后，肝脏中不再检测到肌成纤维细胞，Desmin为37±9%⁺HSC仍表达YFP。事实上，基因标记的YFP⁺恢复4个月后HSC持续存在(SI附录，图S4D类). 同样，流式细胞术显示YFP的38±7%⁺维生素A⁺恢复1个月后，HSC表达YFP，而YFP为83±6%⁺维生素A⁺肝纤维化中的aHSC(SI附录，图S4E类). 在恢复的肝脏中，这些iHSC位于Diss的豆状窦周围，呈星状(SI附录，图S4F类).

HSC在发育过程中短暂表达I型胶原蛋白。

YFP的检测⁺列-α2（1）中的qHSC^{Cre-YFP公司}和色谱柱-α1（1）^{Cre-YFP公司}成人肝脏损伤前(图2B类;SI附录，图S4E类和S5)可能反映了发育过程中短暂的胶原蛋白基因表达激活Cre。为了证明这一假设，我们在胚胎发生期间实时检测了Col-GFP小鼠肝脏中胶原蛋白-α1（I）的表达(SI附录，图S5). 事实上，在胚胎第16.5天（E16.5）和出生后第14天（P14），HSC中检测到胶原-α1（I）-GFP的瞬时表达，通过维生素A、Desmin和GFAP的表达进行鉴定(SI附录，图S6一). 在P14，46±8%的HSC实时上调胶原-α1（I）-GFP，但缺乏α-SMA表达(SI附录，图S6B类). 这些GFP⁺HSC没有表现出肌成纤维细胞的特征(SI附录，图S6C类和D类)，但与aHSC相比更类似于qHSC(SI附录，图S6E类和F类).

胚胎胶原蛋白的命运⁺在成人Col-α2（1）中检测HSC^{Cre-YFP公司}小鼠（8周龄）。与我们的调查结果一致，YFP⁺有胶原蛋白表达史和YFP的qHSC⁻qHSC具有与静止表型相同的基因表达谱特征(SI附录，图S6E类).

他莫昔芬诱导成年小鼠aHSC/肌成纤维细胞的基因标记证实其在CCl恢复1个月后仍在肝脏中存在₄.

他莫昔芬诱导的Col-α2（1）^{ER-预处理-GFP}小鼠通过交叉Col-α2（1）产生^ER核心小鼠×Rosa26^{flox-mTRed-Stop-flox-mGFP}小鼠(SI附录，图S2). 在成年CCl中实现了HSC的遗传标记₄-经处理的Col-α2（1）^Er-Cre-GFPCCl最后一周每天服用三苯氧胺的小鼠₄处理(SI附录，图S7一). 基因标记的aHSC可以通过mTRed表达的缺失和Cre-loxP重组后GFP表达的增加来观察。Desmin公司⁺CCl后HSC（35±6%）表达GFP₄14±4%的HSC仍为GFP⁺恢复1个月后(图2C类)，确认CCl₄-肝纤维化消退后，活化的HSC（及其后代）仍存在于肝脏中。始终是GFP⁺iHSC表达Desmin，但不表达α-SMA(SI附录，图S7B类). 因此，三只独立的转基因小鼠证明，aHSC/肌成纤维细胞在纤维化消退过程中恢复为非活性表型。

从纤维化中恢复的肝脏HSC较少。

为了量化纤维化期间HSC的数量及其回归，我们生成了GFAP^{Cre-GFP公司}小鼠（GFAP^Cre公司小鼠×Rosa26^{flox-Stop-mTRed-flox-mGFP}老鼠；SI附录，图S8一). 在未受损伤的小鼠中，qHSC分布于整个肝腺泡，占总肝细胞的10.6±0.8%。CCl公司₄诱导HSC活化、增殖（占肝细胞总数的14.3±1.5%），并在中央周围区域积聚aHSC。恢复一个月后，HSC数量减少（占肝细胞总数的5.6±1.8%），HSC的分布再次与qHSC相似。在Col-α2纤维化恢复后GFAP免疫染色的基础上（I）^{Cre YFP公司}和Col-α1（I）^{Cre-YFP公司}小鼠(图2B类;SI附录，图S4E类)，iHSC占恢复肝脏中总肝细胞的2%(SI附录，图S8B类).

酒精性肝纤维化恢复7周后，基因标记的aHSC/肌成纤维细胞在肝脏中持续存在。

接下来，我们确定aHSC/肌成纤维细胞的存活是否发生在酒精诱导的肝纤维化的消退过程中。Col-α2（I）诱导肝纤维化（和脂肪变性）^{Cre-YFP公司}小鼠（胶原蛋白-α2（I）^Cre公司×Rosa26^{flox-Stop-flox-YFP}小鼠）灌胃酒精2个月(SI附录，图S9一和B类). 停止乙醇喂养7周后，这些小鼠的肝纤维化（和脂肪变性）发生逆转。流式细胞术显示基因标记（YFP）⁺)在64±5%的肌成纤维细胞中实现，在36±4%的维生素A中持续存在⁺YFP公司⁺纤维化恢复后的HSC(SI附录，图S9C类). 免疫组织化学证实了我们的发现(SI附录，图S9D类和E类). YFP在38±7%的Desmin中持续表达⁺尽管肌成纤维细胞消失（α-SMA在1.4±1%YFP中表达⁺HSC/肌成纤维细胞；SI附录，图S9D类). 因此，两种肝纤维化回归模型证明了iHSC的存活率。

iHSC表现出对反复纤维化刺激的反应增强。

纯化的iHSC具有与qHSC相似的表型（Desmin⁺、GFAP⁺、Synemin⁺，α-SMA⁻;SI附录，图S9E类和S10). 然而，在培养的TGF-β1处理的iHSC中，肌纤维母细胞特异性基因[Col-α1（I），α-SMA，TIMP-1]的表达比qHSC更强烈(图3一). 与此一致，Col-GFP小鼠接受了两轮CCl₄受伤间隔6个月，以便完全恢复（2×CCl₄)与接受一轮CCl治疗的同窝婴儿相比，出现了更严重的纤维化₄（1×CCl₄;图3B类). 因此，我们的培养和体内数据表明，具有激活历史的iHSC比qHSC更有效地激活。

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图3。

HSC（1个月恢复）获得了与qHSC不同的新表型。(一)来自Col-α1（1）的HSC^{Cre-YFP公司}将未受伤或恢复1个月后的小鼠培养48小时±TGF-β1（2 ng/mL，持续6小时），并通过RT-PCR分析纤维化和神经基因的表达*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05. (B类)CCl公司₄-治疗Col-GFP小鼠（2×CCl₄;n个=4）恢复6个月，然后再次接受CCI₄受伤。比较这些小鼠与接受CCl治疗的同窝小鼠肝纤维化的发展₄仅第二次（1×CCl₄;n个=4）天狼星红。通过荧光显微镜对Desmin和α-SMA的aHSC数量进行估算(P（P）<0.05，使用20倍物镜）。羟脯氨酸法测定胶原沉积总量*P（P）< 0.01. (C类)HSC是从胶原-α1（I）-GFP/β-actin-RFP小鼠中分离出来的，未受损伤或从CCl中恢复（7天或1个月）后₄损伤，肝内转移（2.2×10⁵单元格）转换为1-d旧Rag2^−/−γc^−/−幼崽。遵循CCl₄受伤，RFP数量⁺GFP公司⁺根据HSC总数（由Desmin检测）计算7天和1个月后植入的qHSC和HSC。

过继性转移的HSC（1个月恢复期），而非qHSC，会导致小鼠肝纤维化。

为了验证这个假设，从Col-GFP中分离出HSC⁺/β-肌动蛋白-RFP⁺未受伤的小鼠，在从CCl中恢复7天和1个月后₄-诱导纤维化并过继性转移至新生儿Rag2的肝脏^−/−γc^−/−小鼠(11) (图3C类). 一个月后，这些Rag2^−/−γc^−/−小鼠受到CCl₄分析损伤和纤维化肝脏是否存在GFP⁺招标书⁺HSC。恢复7天或1个月后，移植HSC的小鼠植入率最高（70–78%）（qHSC为50%；SI附录，图S11一). 与qHSC不同的是，qHSC大多分散在被膜下或肝实质内，仅占总HSC的0.5±0.2%，而来自恢复期肝脏的HSC被纳入受体小鼠的肌成纤维细胞群，分别占总HSCs的19±2.3%和13±2.0%(图3C类). 此外，尽管植入不良，但在CCl中观察到了类似的结果₄-用来自Col-α1（I）的qHSC或HSC（2周恢复）过继转移的经处理的野生型小鼠^{Cre-YFP公司}小鼠(SI附录，图S11B类). 综上所述，iHSC在反复刺激下能够更快地分化为肌成纤维细胞。

失活HSC逐渐下调胶原-α1（I）的调节。

为了进一步表征iHSC，Col-α1（1）^{Cre-YFP公司}小鼠与Col-GFP小鼠杂交，并用基因标记的HSC（YFP⁺)实时分析胶原-α1（I）的表达（GFP⁺;SI附录，图S12). 遵循CCl₄治疗（2个月，SI附录，图S12一)，所有YFP⁺HSC表达GFP。纤维化恢复1个月后，YFP⁺HSC降低了GFP的表达。流式细胞术也得到了类似的结果(SI附录，图S12B类和C类)它可以同时检测维生素A、YFP和GFP的表达(12)在隔离的HSC中。正如预期的那样，qHSC缺乏GFP表达，HSC表达GFP以应对CCl₄(87 ± 5%;SI附录，图S12B类). 从CCl恢复2周后₄在75±3%的HSC中观察到GFP表达降低，其中92±4%仍表达YFP。YFP中GFP表达的平均荧光强度（mfi）显著降低⁺此时的HSC（～4×10^三mfi，与～6×10的aHSC相比⁴mfi；SI附录，图S12B类). GFP表达（～1×10^三mfi）在恢复1个月后，42±4%的HSC中进一步下降，并与YFP数量相关⁺iHSC（55±3%）。因此，HSC的失活在从CCl中恢复的过程中逐渐而稳定地发生₄-诱导纤维化。有趣的是，恢复1个月后45%的HSC没有胶原蛋白表达史（YFP⁻)并代表新的qHSC(SI附录，图S12B类).

iHSC获得一种与qHSC不同的新表型。

为了评估全球基因表达的变化，灭活YFP⁺用全小鼠基因组微阵列评估HSC（iHSC，1个月恢复），并在恢复7天后与qHSC、aHSC和HSC进行比较(图4一). 我们确认YFP⁺iHSC在纤维化恢复过程中下调纤维生成基因（Col-1α1、Col-1α2、Col-1β1、α-SMA、TGFβRI和TIMP1），但未能获得静止表型[上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和Bambi，而非其他静止相关基因脂肪分化相关蛋白（Adfp）、Adipor1或GFAP](5) (图4B类). 基因表达谱的无监督聚类显示YFP⁺iHSC（1个月）表现出介于qHSC和YFP之间的中间型⁺HSC（7天恢复），但与qHSC相比，与aHSC更相似(图4C类和D类). 通过相关系数分析，将表达谱与qHSC进行比较，得到了类似的结果(图4C类)基因特异性表达谱的无监督聚类(SI附录，图S13一和C类).

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图4。

基因标记的HSC在恢复1个月后获得新的“失活”表型。(一)微阵列分析。维生素A⁺HSC从Col-α2（I）中分离纯化^{Cre-YFP公司}未经治疗的小鼠(n个=6），纤维化(n个=6），恢复7天后(n个=3），恢复1个月后(n个= 6). YFP公司⁺和YFP⁻然后将HSC置于小鼠全基因组微阵列中。显示了每个HSC组的代表性单元格编号。(B类)YFP公司⁺iHSC（1个月恢复期）下调成纤维基因的mRNA，上调PPARγ和Bambi，但不上调其他qHSC基因（Adfp、Adipor1、GFAP）。结果显示使用Agilant微阵列获得的相对mRNA水平（标准化值/多探针/基因的平均值）*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.001. (C类)基因表达谱聚类分析确定不同HSC表型之间的相似性。相关系数用于比较qHSC（1.00）基因表达模式与YFP⁺iHSC（0.76）和aHSC（0.63）表达模式。(D类)确定YFP的特征基因表达⁺iHSC（1个月）和YFP⁺HSC（恢复7天，7天）和折叠诱导（与YFP相比⁺aHSC）。

热休克蛋白1a/b的激活可能促进肝纤维化恢复第7天iHSC的存活。

了解YFP如何⁺iHSC逃避凋亡，我们检测了YFP中的信号通路⁺恢复7天后的HSC(SI附录，图S13B类和E类). 特别是，在这些HSC中，抗凋亡热休克蛋白1a/b（Hspa1a/b）基因的表达被强烈但短暂地诱导(图5一;SI附录，图S14一)达到与qHSC相当的水平，但在恢复1个月后，aHSC和HSC的表达显著下调(图5一;SI附录，图S14一).

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图5。

基因标记YFP⁺恢复后第7天，HSC上调生前Hsp1a/b基因。(一)YFP中促生存Hsp1a/b基因的上调⁺恢复7天时的HSC。结果表示为相对mRNA水平（标准值/多探针/基因的平均值；*P（P）<0.001）通过Agilant微阵列获得。(B类)Hspa1a/b诱导细胞凋亡^−/−和野生型HSC通过乙醛毒素（25 nM，4 h）和TNF-α（20 ng/mL）+放线菌素（0.2μg/mL）作用18 h(C类)Hspa1a/b型^−/−和野生型（Wt）小鼠逐渐受到CCl₄伤后恢复2周，用天狼星红（Sirius Red）对肝脏进行分析，并进行Desmin和α-SMA染色（显示阳性区域）。与CCl比较，计算恢复期间纤维化的回归和纤维原性肌成纤维细胞的消失₄治疗（100%），并显示为天狼星红-、Desmin-和α-SMA阳性区域的百分比*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05.

我们检查了Hspa1a/b是否会影响培养的HSC的存活。为此，从CCl中分离出HSC₄-处理过的Hspa1a/b^−/−和野生型小鼠(SI附录，图S14B类)塑料培养5d。Hspa1a/b型^−/−HSC呈圆形，生长迟缓（细胞数比敲除：重量：1:1.7；SI附录，图S14C类). 此外，Hspa1a/b^−/−HSC更容易受到乙醛毒素-(13)和TNF-α诱导的细胞凋亡(14) (图5B类;SI附录，图S14C类). 因此，Hspa1a/b基因的上调可能会促进iHSC在纤维化恢复过程中的存活。

老鼠。

使用报告Col-GFP小鼠实时研究I型胶原的表达(24). 使用胶原蛋白-α2（I）研究aHSC的细胞命运图^Cre公司(25)和胶原蛋白-α1（I）^Cre公司(SI附录)和他莫昔芬诱导的胶原蛋白-α2（I）^ER核心传给Rosa26^{flox-Stop-flox-YFP}小鼠（或Rosa26^{flox-mTRed停止flox-mGFP}老鼠）（杰克逊实验室）。GFAP公司^Cre公司用小鼠测定HSC总数。

肝纤维化。

CCl灌胃诱导小鼠肝纤维化₄（在100μL玉米油中以16×1:4稀释）超过2个月(8)或通过胃内乙醇喂养结合西方饮食（持续2个月）(SI附录) (26). CCl后1个月研究肝纤维化的逆转₄戒酒和戒酒后7周。CCl诱导Col-GFP小鼠复发性损伤1个月₄(8 × 1:4). Rag肝损伤^−/−γc^−/−和Hspa1a/b^−/−CCl逐渐诱导小鼠₄（4×1:16；2×1:8；2×1:14）1个月。通过羟脯氨酸和天狼星红染色测定胶原蛋白含量。

非实质细胞组分和原代HSC的分离。

如前所述，使用蛋白酶/胶原酶和梯度离心法灌注和消化肝脏(8). 通过流式细胞术分析新分离的HSC，或在DMEM（Gibco-BRL）+10%FCS和2 mM中培养HSC我-谷氨酰胺+抗生素。

流式细胞术。

在FACSCanto II RUO（BD）上对肝脏非实质细胞进行表型分析。使用氩激光和维生素A通过GFP表达（488nm）观察激活的肌成纤维细胞⁺紫激光检测405nm的表达。在MoFlo（Beckman Coulter）上对GFP（488 nm，使用Lyt-200S激光，iCYP Visionary Bioscience Inc.）和维生素a（350 nm，UV激光，JDSU-Excyte）进行细胞分选。