结果
Super-PTEN小鼠的产生
虽然PTEN逐渐丢失的后果已被广泛研究,但在整个生物体内升高PTEN的潜在益处尚不清楚。为了阐明PTEN升高对病理生理学的影响,我们试图培育携带该关键抑癌基因额外拷贝的转基因小鼠(称为Super-PTEN小鼠)。为了保持内生的调节特性铂族基因,我们利用包含整个铂族细菌人工染色体携带的位点。这些大基因组片段保护感兴趣的基因免受染色质位置效应的影响,在各个方面都保留了内源性基因的表达模式。基因组插入物包含铂族()从小鼠BAC基因组文库中分离得到。我们能够获得不同的转基因株系,其中包含整个基因的可变拷贝铂族轨迹。接下来,我们从这些细胞系中生成小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),以测定PTEN的表达水平,我们发现PTEN的水平比内源性水平高1.1到3.5倍(),证实了BAC转基因系统对PTEN的成功过表达。
超级PTEN小鼠的产生一,BAC RP23-215F15克隆携带的基因组插入图(RPCI文库,C57BL/6J),用于生成PTEN基因剂量增加的小鼠(“Super-PTEN”小鼠)。基因组插入物长218.50 Kb,包含整个铂族位点(红色方框表示PTEN编码序列)。灰色线表示BAC载体(pBACe3.6)序列。使用AscI对BAC克隆进行线性化。显示了用于检测转基因的引物(T7侧:F1,R1;SP6侧:F2,R2)。b条,不同BAC-PTEN转基因株系PTEN水平的量化。从每个品系获得MEF,并用PTEN和β-肌动蛋白抗体检测总蛋白裂解物。图中显示了每一转基因株系中PTEN水平相对于野生型同窝产仔的倍数增加。c、,来自tg无表达(第1行)、中等表达(第2行)或高表达(第3行)的MEF的代表性免疫印迹。日期:,性交后13.5天采集的wt和tg胚胎的代表性图像。注意,与体重相比,tg胚胎的体型减小。e、,Western blot显示PTEN在胚胎发生期间和成年小鼠组织中的表达(第3行的wt和tg)*就心脏而言,考马斯曲线显示为负荷控制。f、,Western blot显示来自wt和tg MEFs的细胞质(C)和核(N)提取物中的PTEN水平(第3行)。克,PTEN在wt和tg小鼠组织中的免疫组织化学表达(第3行)。
PTEN通过控制细胞数量而非细胞大小来调节哺乳动物的体型
令人惊讶的是,小鼠体内PTEN水平的升高与生命相适应,但导致体重和体型下降,这一表型在胚胎发育阶段已经很明显(). 在所分析的所有成人组织以及胚胎发生期间均观察到PTEN水平升高()其亚细胞分布和表达模式没有改变(). 从PTEN水平高的转基因小鼠中检测到的所有器官重量低于正常值,而它们的重量与全身重量的比率与野生型个体中观察到的没有区别(补充图1a). Super-PTEN小鼠的血清瘦素、GH和IGF-1水平正常,因此表明PTEN对体型的影响不太可能通过对激素生成的影响间接介导(补充图1b).
有趣的是,对体重和体型的影响()随着PTEN水平的增加,情况变得更加严重,这表明PTEN在哺乳动物体内以剂量依赖的方式控制体型().
Super-PTEN状态与生命相容,但由于细胞数量减少,导致器官尺寸减小a、,生长曲线表明PTEN过度表达导致体重减轻。注意,随着PTEN剂量的增加,这种影响更为严重。b、,Western blot显示来自不同PTEN转基因株系的不同组织(脾、肝)中的PTEN水平(株系1:1.2倍;株系2:2倍;株株3:高于内源性PTEN水平3.5倍)。c、,PTEN过度表达对体型的影响(第3行)。日期:,从Super-PTEN和野生型小鼠分离的器官中的细胞数量和细胞大小(第3行,每个基因型3个)。FSC=前向散射。CD4/8细胞:CD4+/镉8+,KSL单元格:Lin−/c试剂盒+/Sca-1型+,AT2细胞:Sca1−/CD45型−/PECAM公司−/自动飞行你好,B电池:B220中+/免疫球蛋白M中+中的错误栏一和d日表示s.d.另见图S1.
器官尺寸的减小可能是细胞尺寸和/或细胞数量减小的结果。出乎意料的是,对组织中分离的细胞(来自第3行的转基因小鼠)进行的流式细胞术分析显示细胞大小正常(通过前向散射测量),而细胞总数减少(). 因此,PTEN升高通过控制细胞数量而非细胞大小导致哺乳动物的体型缩小。
PTEN升高导致细胞增殖减少,c-Myc水平降低,并产生抗癌性
PTEN调节各种生物过程以确保正确的细胞内环境稳定,这些功能的改变有助于癌症的发生和发展(Salmena等人,2008年). 与这个概念和我们之前的结果一致,Super-PTEN小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的生长速度明显低于野生型成纤维细胞(:生长曲线和连续3T3培养)。初级MEF在低密度播种时形成菌落的能力是衡量其增殖潜力的可靠方法。事实上,Super-PTEN MEF的电镀效率低于野生型胚胎的电镀效率().
PTEN过度表达导致培养物中生长速度降低,对致癌细胞转化产生抵抗,c-Myc水平降低,并赋予癌症抵抗力体内a、,wt和tg MEF的生长曲线(每个基因型3个)。b、,初级wt和tg MEF的3T3系列培养(n=3)。图中显示了每个通道的累积种群倍增(PDL)。c、,wt和tg MEF的集落形成效率(n=4)。日期:,wt和tg MEF的转化敏感性(n=4)。图片显示了转染致癌Ras和E1A后形成的肿瘤灶数量。e、,对3MC诱导的纤维肉瘤的敏感性。将3MC肌肉注射到指定基因型的小鼠的一条后腿,并对纤维肉瘤发生的潜伏期进行评分(第3行,每个基因型5个)。根据Gehan-Breslow-Wilcoxon试验确定,Super-PTEN小鼠发生肿瘤的潜伏期明显长于野生型小鼠(*p<0.05)。Western blot显示PTEN在野生型和Super-PTEN小鼠肿瘤中的表达水平。f、,由E1A+Ras(顶部)或cMyc+E1A+Ras(底部)转化的初级MEF中的软琼脂分析。该图显示了每个孔的菌落数(六孔板,三份样品)。显示了来自化验的代表性图片。克,来自wt和tg MEF和组织的蛋白质裂解物的免疫印迹。用针对c-Myc、PTEN和β-肌动蛋白的抗体探测总细胞提取物。中的误差线一,b条,c(c),d日和(f)表示s.d.另见图S2.
接下来我们研究了PTEN过度表达对癌基因介导的细胞转化的影响。采用经典的对Super-PTEN和野生型MEF中E1A和Ras癌基因的病灶形成分析,我们发现Super-PTEM细胞中形态转化细胞的病灶数量减少(). 验证此结果体内,我们评估了Super-PTEN小鼠在化学致癌时发生肿瘤的敏感性(通过注射3MC:3-甲基-蒽诱导纤维肉瘤)。如所示,野生型小鼠在注射3MC后的第14周开始发生肿瘤,而Super-PTEN小鼠从第21周开始发生潜伏期显著延长的肿瘤。已经观察到3MC治疗会诱导大鼠肿瘤抑制基因的甲基化和相应的表达缺失(刘等人,2010). 然而,PTEN在3MC诱导的野生型和Super-PTEN小鼠肿瘤中保持表达(; Western Blot),表明Super-PTEN小鼠的肿瘤耐药表型是由于PTEN依赖性肿瘤抑制作用增强,而不是减少了铂族3MC灭活。这些数据表明,这两种基因都可能对致癌转化产生耐药性在体外和体内通过增加PTEN水平。
在Super-PTEN小鼠中观察到的器官重量、大小和细胞数减少,令人想起在c-myc公司低形态小鼠(特朗普等人,2001年). c-Myc在体细胞直接重编程为诱导多能干细胞(iPS)中起关键作用(巴尼托和吉尔,2010年). iPS重编程是通过联合表达多潜能因子和致癌基因(包括c-Myc)实现的,并且可以提供可转化性和致癌潜力的读数(巴尼托和吉尔,2010年)虽然最近有报道称肿瘤抑制因子是重编程的障碍(Banito等人,2009年;Hong等人,2009年;Kawamura等人,2009年;Li等人,2009年;Marion等人,2009年;Utikal等人,2009年). PTEN在细胞中的过度表达导致重组因子Oct4、Sox2和Klf4表达后iPS集落数量减少(补充图2a)然而,重要的是,c-Myc转导克服了在iPS形成中PTEN表达的负面影响。为了确定c-Myc在Super-PTEN细胞对致癌转化的抵抗中的作用,我们进行了软黄试验,以评估单独感染E1A-Ras或存在c-Myc(cMyc+E1A-Ras)的细胞中的锚定非依赖性生长。如所示(上图),与野生型细胞相比,Super-PTEN细胞在软黄中形成的菌落更少。重要的是,通过添加c-Myc,Super-PTEN细胞对转化的抵抗完全被挽救(; 底部)。基于这些观察结果,我们假设PTEN对抗c-Myc功能或抑制其表达。事实上,c-Myc在Super-PTEN MEF和体内,在各种组织中().
超级Pten小鼠的能量消耗增加
接下来,我们研究了Super-PTEN状态对身体脂肪积累和能量代谢的影响。鉴于PTEN对生长因子和葡萄糖摄取的关键信号通路的抑制作用(Leevers等人,1999年),我们预计Super-PTEN小鼠的代谢活性会降低。令人惊讶的是,根据EchoMRI的测定,与野生型小鼠相比,Super-PTEN小鼠的体脂积累减少()表明PTEN的升高对养分的适应和利用有影响。此外,间接热量分析显示,Super-PTEN小鼠比野生型小鼠表现出更高的能量消耗(和补充图3a)虽然运动活动没有受到显著影响(补充图3b). Super-PTEN小鼠的食物摄入量相似,甚至稍高(补充图3c)表明野生型和Super-PTEN小鼠之间观察到的能量消耗差异不是由于食物摄入的变化,而是由于代谢状态的提高。
Super-PTEN小鼠的能量消耗增加a、,通过EchoMRI(第3行)测定年轻小鼠(左侧:wtn=7;tgn=7)和老年小鼠(右侧:wtn=12;tgn=10)的脂肪和瘦肉质量百分比。b条,Super-PTEN(红线)和野生型小鼠(黑线)的间接热量测定。耗氧量(VO2)、二氧化碳释放量(VCO2)、呼吸交换比(RER;VCO2/VO(旁白)2)在代谢室中测定Super-PTEN和野生型小鼠每公斤体重的能量消耗(第3行,每个基因型n=4)。c、,wt(n=10)和tg(n=9)小鼠(第3行)的血清乳酸水平。中的误差线一表示s.d。;中的误差线b条表示s.e.m.另见图S3.
FAO(脂肪酸氧化)是能量代谢和脂肪储存的关键过程(Ruderman和Flier,2001)。脂肪酸既可以用于脂质合成和蛋白质修饰,也可以通过线粒体β-氧化降解,后者产生底物,通过氧化磷酸化维持ATP的生成。为了确定改变的FAO对Super-PTEN小鼠和细胞代谢状态的潜在贡献,我们首先测量了脂肪酸代谢中关键酶(SCD1、CPT1-α、PPAR-α、PPAR-δ、PDK4、MCAD、Acox1)的表达水平。然而,除了CPT1-α外,我们没有发现这些基因的表达有显著差异(补充图3d)在Super-PTEN细胞中略有增加。有趣的是,据报道PI3K信号抑制CPT1α的表达(Debrardinis等人,2006年). 我们没有发现野生型和Super-PTEN细胞(无论是原代MEF)之间的FAO比率有显著差异(补充图3e)或肝细胞(补充图3f). 我们接下来研究了葡萄糖作为脂质合成前体的使用,发现Super-PTEN细胞在(6)-14C) -与野生型细胞相比,葡萄糖-脂质合成(补充图3g). 脂肪生成速率的降低与Super-PTEN小鼠体内脂肪积累的减少相一致。接下来,我们决定评估血清乳酸水平,作为Super-PTEN小鼠糖酵解活性的指标。如所示,我们观察到与野生型同窝小鼠相比,Super-PTEN小鼠的乳酸水平降低。葡萄糖分解代谢产生的丙酮酸可以被还原为乳酸(厌氧糖酵解)或被线粒体进一步代谢(氧化磷酸化)。该数据表明,在Super-PTEN小鼠中观察到的能量消耗增加可能反映了线粒体氧化磷酸化增加以及伴随的厌氧糖酵解减少。
PTEN升高使细胞能量代谢转向线粒体呼吸
为了确定线粒体呼吸对细胞生物能量学的贡献,我们测量了Super-PTEN和野生型MEF的耗氧量。能量消耗的差异得到支持在体外通过在初级Super-PTEN MEF中观察到的线粒体耗氧量增加(),这反过来又伴随着线粒体ATP产量的增加()和活性氧的生成(补充图4a). 此前已有研究表明,低氧诱导因子1(HIF-1)刺激糖酵解能量的产生,并对线粒体的生物生成和O2消费(登科,2008). 由于PI3K-Akt途径的激活导致HIF1α水平和活性增加(Zundel等人,2000年),我们比较了Super-PTEN中HIF-1α的水平与野生型MEF。然而,我们发现HIF-1α蛋白水平没有实质性差异(补充图4b)或HIF-1α靶基因(补充图4c)在Super-PTEN和野生型MEF之间。
PTEN过度表达导致线粒体耗氧量、线粒体ATP生成和线粒体数量增加a、,在基础条件下以及添加寡霉素、FCCP和鱼藤酮后,测量初级体重和tg MEF(每个基因型3个)的OCR(耗氧率)(Seahorse XF24分析仪)。b、,如方法部分所述,激动剂刺激后wt和tg MEF的线粒体ATP生成。如有指示,用100µM ATP处理细胞。数据表示为初始值的百分比。重量:162±8%;tg:251±18%。三个独立实验的n=15,p<0.05(平均值±标准误差)。c、,线粒体钙2+激动剂刺激后的体内平衡测量如方法部分所述。如有指示,用100µM ATP处理细胞。重量:[钙2+]米峰值155±8µM。tg:[钙2+]米峰值131±5µM。n=12,来自三个独立实验(平均值±s.e.m)。日期:,线粒体膜电位分析(ΔΨ米)单位为wt和tg MEF。如方法部分所述,加载TMRM的单元格。当用FCCP处理指示细胞时,ΔΨ完全崩解米记录道代表单细胞反应(wt n=28;tg n=33)。e、,方法部分所述的线粒体总体积和单个体积以及线粒体数量的分析(wt n=43;三个独立实验的tg n=40,p<0.05)。线粒体靶向GFP可视化显示wt和tg MEF中的线粒体形态。如方法部分所述计算线粒体断裂指数(wt n=43;tg n=40,来自三个独立实验)。网络体积图、平均线粒体体积图和线粒体数图的纵坐标分别为体素/细胞、体素/物体和N°物体/细胞。中的误差线一表示s.d。;中的误差线d日,e(电子)表示s.e.m另见图S4.
线粒体ATP生成增加不能归因于更有效的线粒体Ca2+吸收,吸收(格里菲斯和拉特,2009年)因为这个参数在Super-PTEN MEF中稍低(). 此外,Super-PTEN和野生型MEF显示出相似的线粒体膜电位(). 然而,引人注目的是,Super-PTEN MEF表现出更大的线粒体生物发生。事实上,由于线粒体数量增加,Super-PTEN MEF中的线粒体总网络体积较高,而平均线粒体体积和形态未受影响().
微阵列分析表明,在Super-PTEN MEF中伴随着显著的PGC1α基因富集特征(补充图4d)与已知Akt抑制PGC1α功能的事实一致(Li等人,2007年). PGC1α是能量代谢的关键调节器,可促进线粒体氧化磷酸化和线粒体生物生成(Puigserver和Spiegelman,2003;Wu等人,1999)。
为了从功能上评估线粒体活性的差异,我们接下来通过用葡萄糖替代生长介质中的半乳糖,迫使细胞仅依赖氧化磷酸化来产生能量(Marroquin等人,2007年). 与线粒体功能增强一致,Super-PTEN细胞的半乳糖生长减少较少与葡萄糖与野生型细胞的比较(补充图4e). 因此,通过产生Super-PTEN小鼠,我们确定了PTEN在能量稳态和线粒体生物发生和功能中的作用。
尽管能量利用率很高,但Super-PTEN状态伴随着PI3K-Akt信号被抑制和葡萄糖摄取减少
然后,我们旨在确定引起这种意外代谢表型的Super-PTEN小鼠的生化特征。PTEN是PI3K通路的主要负调控因子,PI3K是一种高致癌性和代谢性节点(Engelman等人,2006年). PIP的去磷酸化三通过PTEN损伤Akt激活,从而对抗PI3K-Akt信号通路。一贯地,过度表达PTEN的细胞显示底物PIP水平降低三(补充图5a)PI3K活性降低(通过下游成分Akt的磷酸化测定)(补充图5b)和葡萄糖摄取受损(补充图5c). 对细胞外培养基中葡萄糖和乳酸代谢物的分析表明,与野生型细胞相比,Super-PTEN细胞消耗更少的葡萄糖,向培养基中挤出更少的乳酸(). 这些数据表明,Super-PTEN状态伴随着PI3K-Akt信号被抑制和葡萄糖摄取减少。虽然预测这将导致低能量利用率,但令人惊讶的是,Super-PTEN细胞和小鼠的情况并非如此(见上文)。
PTEN升高通过调节PI3K依赖和独立通路诱导肿瘤抑制代谢状态a、,测量培养基中wt和tg细胞(n=2)的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺水平,并将其归一化为细胞数。b、,mTORC1和PI3K/Akt途径对糖酵解和谷氨酰胺水解酶的药理学抑制作用。用二甲基亚砜(续)、20 nM雷帕霉素(Rapa.)处理24 h或100 nM沃特曼(Wort.)处理8 h的wt和tg MEF的细胞裂解液,用PKM2、PFKFB3、GLS、p-S6、S6、p-Akt、Akt,PTEN和β-actin抗体进行免疫印迹。c、,的影响Tsc2型缺失介导PKM2蛋白水平上的mTORC1激活。GL3-shRNA的细胞裂解物(对照荧光素酶基因的shRNA)和Tsc2型-用PKM2、Tsc2、PTEN和²-actin抗体对shRNA感染的wt和tg-MEFs进行免疫印迹。日期:,折叠变化率(tg与wt)在PTEN、FKFB3和GLS mRNA水平中的表达,通过wt和tg MEFs总RNA的qRT-PCR测定(左边). 蛋白酶体介导的GLS和PFKFB3降解。用10µM蛋白酶体抑制剂MG132处理来自wt和tg MEF的细胞裂解液4小时,用GLS、PFKFB3、PTEN和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹(正确的).e、,PFKFB3过度表达对E1A+Ras转化的原代MEF中细胞生长(电镀后48小时)的影响。显示了相对于wt MEFs+E1A+Ras的增长百分比。f、,PTEN增强APC/C-Cdh1介导的GLS泛素化。PTEN公司-将缺失的PC-3细胞与GLS、His-ubiquitin(Ub)、CDH1和PTEN联合转染,并在收获前用MG132(10µM)处理4小时。使用镍从细胞裂解液中纯化His-Ub共轭GLS2+-变性条件下的NTA自旋柱。克,
加拿大存托凭证1-沉默可恢复tg MEF中GLS和PFKFB3的水平。转染siRNAs的wt和tg MEF的细胞裂解物雷尼利亚荧光素酶(siCont.)或加拿大存托凭证1用GLS、PFKFB3、PTEN、Cdh1和²-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。小时,菌落数(倍数变化率:tg与wt MEFs+Ras)在软糖分析中形成Tsc2型或加拿大存托凭证1由致癌Ras转化的永生化MEF中的基因敲除。该图显示了每个孔的菌落数(六孔板,三份样品)。中的误差线一,d日,e(电子)和小时表示s.d.另见图S5.
PTEN通过mTORC1调节PKM2水平
癌细胞的一个关键特征是葡萄糖的利用方式,从高能氧化磷酸化转变为低效乳酸生成(Warburg效应)(沃堡,1956年)允许糖酵解中间体的积累及其向生物合成途径的重定向。我们的数据显示,Super-PTEN细胞吸收较少的葡萄糖,但它们将更多的糖酵解产物重定向到线粒体氧化磷酸化。这些特征可被视为抗Warburg状态,与增殖减少和抗癌状态相关。代谢开关的核心成分之一是负责将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸的酶,即丙酮酸激酶(PK)。细胞中PKM1表达向PKM2表达的转变导致丙酮酸激酶活性的降低,允许糖酵解前体的积累以产生氧化还原能力和生物量(Vander Heiden等人,2009年;Vander Heiden等人,2010年). 因此,我们研究了PKM2在Super-PTEN细胞中的状态。有趣的是,Super-PTEN细胞降低了PKM2的水平()PK活性降低(补充图5d)这表明Warburg效应调节节点活性的改变可能有助于观察到Super-PTEN细胞的代谢变化。
由于PKM1/M2亚型是通过两个互斥外显子的选择性剪接产生的(Christofk等人,2008年;Clower等人,2010年;David等人,2010年),我们接下来比较了Pkm(百万卢比)野生型和超级PTEN MEFs中的基因。然而,平方公里是MEF中主要的mRNA亚型,与基因型无关(补充图5e). 考虑到PKM2剪接受c-Myc的控制,这一结果出乎意料(David等人,2010年)我们发现Super-PTEN细胞表达较低水平的c-Myc(). 有趣的是,在iPS重编程实验中,c-Myc的加入挽救了超级PTEN细胞中PKM2的表达(补充图2b). 然而,拼接模式分析(补充图2c)提示在iPS重编程条件下,c-Myc依赖性拯救Super-PTEN细胞中PKM2水平是通过剪接模式中不同于开关的机制介导的(见下文)。
为了解释Super-PTEN细胞中PKM2表达的变化,我们研究了其他PTEN调节的细胞途径在PKM2的表达控制中的潜在参与。雷帕霉素治疗可降低MEF中PKM2水平,表明PI3K/Akt通路下游靶点mTORC1活性降低(Zoncu等人,2011年),可能解释了Super-PTEN细胞中PKM2水平的降低(). 为了验证这个假设,我们分析了PKM2在野生型和Super-PTEN MEF中的表达Tsc2型,mTORC1的负调节器(Tee and Blenis,2005年). 重要的是,mTORC1通路的过度激活Tsc2型敲除挽救了Super-PTEN MEF中的PKM2水平,并进一步增加了野生型细胞中的PKM2水平()证实Super-PTEN细胞中mTORC1活性降低是PKM2表达降低的原因。有趣的是,Tsc2型敲除也增加了Super-PTEN细胞中c-Myc的表达,尽管其水平仍然显著低于野生型细胞(补充图5f). 这些数据与所描述的mTORC1在调节c-myc公司翻译(West等人,1998年). 然而Tsc2型敲除以完全拯救Super-PTEN细胞中c-Myc的表达表明,PTEN下游已知调节c-Myc水平的其他途径协同作用(Gregory等人,2003年;Sears等人,2000年). 相反,在iPS重编程期间,c-Myc在Super-PTEN细胞中拯救PKM2表达的能力可能与多水平mTORC1信号增强有关(Jones等人,1996年;Ravitz等人,2007年).
PTEN通过调节PFKFB3和GLS稳定性来控制糖酵解和谷氨酸解
新陈代谢和生长的调节必须紧密耦合,以确保在整个细胞周期中高效利用能量和合成代谢底物。PFKFB3(6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶亚型3)通过催化形成果糖2,6-二磷酸,有效刺激糖酵解,果糖2,6-bisphosphate是6-磷酸果醇-1-激酶(PFK-1)的变构激活剂,是糖酵化过程中的一种速率控制酶和基本控制点。PFKFB3已被证明在人类肿瘤中大量表达(Atsumi等人,2002年)并需要Ras转化细胞的高糖酵解率和锚定物非依赖性生长(Telang等人,2006年). 如所示,在Super-PTEN细胞中PFKFB3水平下调。
癌症细胞依赖于高葡萄糖摄取率和新陈代谢来维持其生存能力,尽管其维持在一个充满氧气的环境中(Warburg效应)。然而,肿瘤细胞的另一个显著代谢特征是谷氨酰胺成瘾。有趣的是,Super-PTEN细胞显示谷氨酰胺摄取受损()谷氨酰胺酶(GLS)水平降低,谷氨酰胺酶解途径中的第一种酶(). 因此,PTEN升高通过调节PFKFB3和GLS对糖酵解和谷氨酸解产生负面影响。
GLS和PFKFB3都是E3泛素连接酶后发复合体/Cdh1(APC/C-Cdh1)降解的靶向底物(科伦坡等人,2010年;Najafov和Alessi,2010年)而PTEN最近被证明可以促进APC/C-Cdh1活性(Song等人,2011年). PTEN的这种功能依赖于其直接促进APC/C-Cdh1复合物组装的能力,而不依赖于其通过PIP3去磷酸化抑制PI3K信号通路的能力。与此一致,PFKFB3和GLS水平均不受PI3K抑制剂Wortmanin治疗的影响(). 我们发现,MG132治疗挽救了PFKFB3和GLS水平的降低,与野生型细胞相比,在过度表达PTEN的细胞中未发现mRNA水平的显著变化,表明PFKFB2和GLS的蛋白依赖性下调(). Super-PTEN细胞对转化有抵抗力,并且对致癌组合E1A+Ras的反应表现出生长速度降低。重要的是,添加PFKFB3能够完全挽救转化的Super-PTEN细胞的生长缺陷().体内泛素化分析证实GLS是APC/C-Cdh1的底物,并且在PTEN存在下增加了GLS泛素化(). PFKFB3和GLS水平通过消耗加拿大存托凭证1()表明PTEN通过APC/Cdh1复合物负调控PFKFB3和GLS。
PKM2、PFKFB3和GLS蛋白水平降低是Super-PTEN细胞肿瘤抑制代谢状态的特征。如上所述,PKM2水平由Tsc2型击倒(),而PFKFB3和GLS水平标准化为加拿大存托凭证1灭活(). 如前所述(Li等人,2008年; Zhang等人,2003),Tsc2型或加拿大存托凭证1击倒导致初级MEF的增长率显著降低(补充图5g),尽管野生型细胞比Super-PTEN细胞在Tsc2型灭活。评估是否Tsc2型或加拿大存托凭证1灭活可以拯救Super-PTEN细胞对致癌转化的抵抗,我们研究了引入致癌Ras后永生野生型和Super-PTEN MEF的非锚定生长。引人注目的是,Tsc2型失活使Super-PTEN细胞与野生型细胞一样容易发生致癌转化,而加拿大存托凭证1灭活可部分挽救软琼脂中的集落形成能力().
基于这些发现,我们提出了一个模型()PTEN升高通过调节PI3K依赖和独立的途径诱导肿瘤抑制代谢状态,并对肿瘤细胞最显著的两个代谢特征:谷氨酰胺分解和Warburg效应产生负面影响。
PTEN通过调节PI3K依赖和独立通路诱导肿瘤抑制代谢状态PTEN升高对肿瘤细胞两个最显著的代谢特征产生负面影响的模型:谷氨酸分解和Warburg效应。
讨论
我们的研究揭示了PTEN升高对机体内环境稳定和癌症发展的深刻影响。中的研究黑腹果蝇强调了Akt途径在积极控制细胞数量和细胞大小方面的作用(Bohni等人,1999年;Gao等人,2000年;Goberdhan等人,1999年;Huang等人,1999年;Scanga等人,2000年;Verdu等人,1999年;Weinkove等人,1999年). 然而,我们的数据表明,Super-PTEN中生物体和组织尺寸的减少仅仅是由于细胞数量的减少,而不是细胞尺寸的减少。有趣的是果蝇属突变并不总是与哺乳动物的对应物平行。例如,由于细胞数量减少(发育不全)而细胞大小没有明显变化,小鼠c-Myc表达减少导致整体体型减小(特朗普等人,2001年),而果蝇dmyc由于细胞尺寸减小(萎缩),突变体变小(Johnston等人,1999年). 我们的Super-PTEN模型也显示了c-Myc表达的明显减少,但细胞数量减少而不是细胞大小减少是生物体水平的结果。然而,c-Myc下调是Super-PTEN表型的一个独特组成部分。因此,c-Myc过度表达挽救了Super-PTEN MEF的缺陷三因子iPS重编程。此外,c-Myc控制调节葡萄糖代谢和谷氨酰胺分解的基因,包括在Super-PTEN细胞中减少的PKM2和GLS(David等人,2010年;Gao等人,2009年).
肿瘤细胞的新陈代谢发生改变,使其能够维持较高的增殖率并抵抗细胞死亡信号(DeBerardinis等人,2008年;King和Gottlieb,2009年;Tennant等人,2009年). 微阵列分析显示糖酵解途径的基因在大多数临床相关癌症中过度表达(Altenberg和Greulich,2004年). 这些基因中有丙酮酸激酶,它调节糖酵解的速率限制最后一步。最近的研究表明,丙酮酸激酶-M基因(PK-M2)II型亚型的表达是癌细胞代谢表型的关键决定因素,并赋予肿瘤细胞选择性增殖优势体内(Christofk等人,2008年). 我们的数据表明,Super-PTEN细胞降低了PKM2的水平,糖酵解通量PKM2这一关键调节因子受mTORC1通路的控制。糖酵解的另一个关键调节因子是PFKFB3,它通过催化形成果糖2,6-二磷酸(PFK1的变构激活剂)来有效刺激糖酵分解(Hue and Rider,1987年)是一种糖酵解的速率限制酶。以前有报道称,PFKFB3由肿瘤细胞组成性表达,并作为致癌Ras的重要下游代谢介质(Telang等人,2006年). 重要的是,我们证明PTEN升高通过APC/Cdh1复合物触发PFKFB3降解。Super-PTEN细胞显示PFKFB3蛋白水平降低,而mRNA水平无变化。除了PTEN依赖的糖酵解抑制外,我们发现Super-PTEN细胞还降低了GLS的水平,GLS是谷氨酸分解的第一种酶。同样,通过APC/Cdh1复合物降解GLS,PTEN升高触发了这一对抗谷氨酸分解的关键肿瘤抑制代谢开关。有趣的是,据报道GLS在几种肿瘤类型中活性增加,并且在c-Myc转化细胞中上调(Gao等人,2009年;Wise等人,2008年)强调它是一个潜在的化疗靶点。
总之,Super-PTEN小鼠表现出一种意料之外的抗癌性和非常独特的代谢状态,这是PTEN从胞浆和细胞核在多个水平上调节代谢能力的结果。一方面,这些小鼠的耗氧量和能量消耗增加。另一方面,超级PTEN小鼠和细胞不太容易发生转化和癌症发展。因此,在Super-PTEN小鼠和细胞中观察到的特征类似于“抗Warburg状态”,在这种状态下,摄入的葡萄糖较少,但更有效地导向线粒体三羧酸循环。此外,PTEN升高诱导线粒体生物发生,从而增加线粒体ATP的产生。因此,PTEN通过PI3K依赖和PI3K非依赖机制协调线粒体功能和动力学对细胞代谢的调节。因此,我们很容易推测,PTEN升高导致的独特代谢状态通过反对癌症相关的代谢重编程,有助于在这些小鼠和细胞中观察到的癌症抵抗力的增加(). 我们的数据意外地确定PTEN是控制肥胖和肿瘤发生的关键节点。因此,它的升高代表了一种有吸引力的治疗方法,因为这将防止癌症的发展,并增加能量消耗,从而防止脂肪堆积和肥胖。
实验程序
BAC转基因
对于转基因,一个大的基因组插入物(218.50 Kb)包含铂族从小鼠BAC基因组文库(BAC RP23-215F15克隆;RPCI文库,C57BL/6J)中分离出基因座并克隆到BAC载体pBACe3.6中。用AscI消化后,将线性化的BAC DNA微注射到(C57BL/6 X CBA)F1小鼠杂交获得的受精卵母细胞的原核中。随后,胚胎被转移到受体假孕CD1雌性的输卵管中。利用PCR检测SP6和T7载体侧翼元件与基因组插入物之间的连接,分析产生的后代是否存在转基因。
免疫组织化学和免疫印迹分析
对于免疫组织化学,将小鼠组织固定在4%多聚甲醛中过夜,然后用PBS清洗两次,并转移到70%乙醇中。组织包埋在石蜡中,切片,并用抗PTEN抗体(M3627:DAKO)染色。根据标准方案进行免疫印迹分析。使用的抗体列在扩展实验程序中。
shRNA
野生型和Super-Pten MEF感染了针对小鼠表达shRNA的慢病毒加拿大存托凭证1(克隆ID TRCN0000027712,开放生物系统),大鼠Tsc2型或针对荧光素酶的相应对照shRNA(Di Nardo等人,2009年). 制备慢病毒颗粒,3×106293T细胞在每10-cm培养皿中培养,然后用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染shRNAs。对于感染,MEF的密度为6×105转染后48小时,293T细胞每10厘米培养皿培养一个细胞,并被病毒感染。重新播种后,使用MEF进行不同的分析。
体内泛素化测定
铂族-用pCMV6-XL4-GLS(SC114750:OriGene)、HA-PTEN、Myc-CDH1和His-ubiquitin的组合转染缺陷PC-3细胞,并用Ni纯化His-Ub结合的GLS2+-变性条件下的NTA自旋柱(Qiagen)。然后通过免疫印迹分析泛素化的程度。
定量RT-PCR
用RNeasy Protect试剂盒(Qiagen)分离RNA,并包括使用不含RNase的DNase试剂盒(Qiagen)的DNase消化步骤。cDNA由转录因子(Roche)获得。TaqMan探针从Applied Biosystems Inc.获得。在7900实时PCR系统(Applied Biosystems Inc.)中进行扩增。使用β-葡萄糖醛酸酶水平作为参考值调整每个值。
代谢研究
使用自动组合间接热量测定系统(TSE系统)研究代谢性能。脂肪和瘦肉块由EchoMRI(Echo医疗系统)测定。有关详细方法,请参阅扩展实验程序。
耗氧量测量
耗氧量2×104对细胞进行平板处理,24小时后,在基础条件下以及添加寡霉素(1µM)、FCCP(2.5µM)和鱼藤酮(1μM)后,使用Seahorse XF24仪器(Seahorse-Bioscience)测量耗氧率(OCR)。所有的化学品都是从西格玛公司购买的。
葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺的测定
使用BioProfile FLEX分析仪(NOVA生物医学)测量培养基中的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺水平,并将其归一化为细胞数。将新鲜培养基添加到6孔板的细胞中,并在24小时后进行分析(一式三份样品)。
ROS生成的测量
通过流式细胞术评估DCF(2',7'-二氯二氢荧光素)荧光来测量活性氧生成。扩展实验程序中描述了该分析的详细信息。
微阵列分析
使用基因芯片HT MG-430 PM 24阵列板(Affymetrix,#901257)评估wt和tg MEF中的基因表达(每个基因型3个)。使用Affymetrix基因芯片操作系统处理数据。
线粒体分析
荧光素酶测量、绿原蛋白测量、膜电位测量以及线粒体形态和数量的微观分析的详细信息在扩展实验程序中进行了描述。
磷酰肌醇分析
磷脂酰肌醇通过阴离子交换高效液相色谱(Beckman)分离,通过流动闪烁分析仪(Perkin-Elmer)检测,并使用ProFSA软件(Perkin_Elmer)定量,如所述(Serunian等人,1991年). 有关详细信息,请参阅扩展实验程序。[32P] -PIP3峰值计数与磷脂酰肌醇总计数进行标准化。
放射性RT-PCR分析
的拼接图案Pkm(百万卢比)如前所述,对wt和tg细胞中的基因进行分析(Clower等人,2010年). 有关引物序列和详细方法,请参阅扩展实验程序。
丙酮酸激酶活性的测定
丙酮酸激酶活性通过与乳酸脱氢酶(LDH)耦合的连续测定测定。该分析的详细信息包含在扩展实验程序中。
肝细胞分离
根据之前的方法,使用两步灌注方案分离原代肝细胞(Lin等人,2004年). 有关详细信息,请参阅扩展实验程序。
统计分析
体外和体内数据是用未配对的t吨测试(GraphPad Prism,GraphPad-Software Inc.)。的值P(P)<0.05被认为具有统计学意义(*P(P)< 0.05; **P(P)<0.01; ***P(P)< 0.001). 采用SigmaPlot 5.0软件(SPSS Inc.)进行相关性分析。