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单元格元数据。作者手稿；PMC 2013年2月8日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格元数据。2012年2月8日；15(2): 157–170.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cmet.2011.12.015
预防性维修识别码：项目经理3282107
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院348510
PMID：22326218

肿瘤的代谢特征取决于负责任的遗传损伤和组织类型

玛丽亚·尤涅娃,1,* 特蕾莎·W·M·范,2 萨迪斯·D·艾伦,1 理查德·东芝,2 达纳·V·费拉里斯,三 冢本隆,三，4 何塞·马泰斯,5 弗朗西斯科·阿隆索,5 王春梅,6 Youngho Seo先生,7 Xin Chen（新晨）,6和J.迈克尔·毕晓普1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

总结

肿瘤代谢的改变被认为是抗癌治疗的靶点。然而，不同的肿瘤起始病变与肿瘤代谢异常之间的关系体内尚未解决。我们报告说MYC公司-诱导的小鼠肝肿瘤显著增加了葡萄糖和谷氨酰胺的分解代谢，而遇见-诱导的肝肿瘤利用葡萄糖产生谷氨酰胺。谷氨酰胺分解代谢增加MYC公司-诱导性肝肿瘤与谷氨酰胺合成酶（Glul）水平降低以及从Gls2转为Gls1谷氨酰胺酶有关。与肝脏肿瘤相比，MYC公司-诱导的肺肿瘤显示Glul和Gls1的表达增加，并积累谷氨酰胺。我们还发现抑制Gls1会杀死过度表达的细胞MYC公司并分解谷氨酰胺。我们的结果表明，肿瘤的代谢特征可能取决于基因型和来源组织，并对针对肿瘤代谢的治疗方案的设计具有指导意义。

引言

在肿瘤和癌细胞系中经常观察到葡萄糖和谷氨酰胺这两种主要营养素的摄入增加和代谢改变（参见(巴盖托，1992年;Gatenby和Gillies，2004年;麦地那，2001). 葡萄糖和谷氨酰胺代谢途径对细胞增殖和生存至关重要，并可由与人类癌症有关的几个致癌基因控制。例如MYC公司原癌基因调节糖酵解、克雷布斯循环、线粒体呼吸和核苷酸合成的几种酶的表达(http://www.myccancergene.org)以及谷氨酰胺转运体和谷氨酰胺酶(Gao等人，2009年;怀斯等人，2008年)谷氨酰胺分解代谢的第一酶；肝细胞生长因子/分散因子及其酪氨酸激酶受体MET调节碳水化合物代谢(卡普兰等人，2000年;Perdomo等人，2008年); PI3K/AKT和RAS/MAPK信号通路由HGF与MET结合启动（Vogelstein和Kinzler，2004），是众所周知的细胞代谢调节器（综述于(Yueva，2008年); β-catenin，Wnt途径中的核心参与者(克劳斯和伯奇梅尔，2008年)，调节负责谷氨酰胺合成的基因(Cadoret等人，2002年); 小鼠肝脏中β-连环蛋白的激活与调节糖酵解和线粒体活性的蛋白质表达的改变有关(Chafey等人，2009年). 这些报告为理解致癌基因的表达如何促进代谢变化提供了重要线索，并表明这些变化可能因肿瘤的不同致癌病变而异。然而，这些研究大多是在细胞系中进行的，或者主要局限于评估不一定反映代谢途径活性的蛋白质表达谱。

在这项研究中，我们使用稳定同位素代谢分析来评估在单个癌基因启动的肿瘤发生过程中葡萄糖和谷氨酰胺代谢是如何改变的体内我们还评估了调节这两种营养物质代谢的主要酶的表达和活性。为了比较两种不同致癌基因的作用，我们使用了由两种人类组织特异性过表达诱导的特征良好的肝癌小鼠模型MYC公司(Shachaf等人，2004年)或遇见(Wang等人，2001年). 小鼠肝肿瘤MYC公司类似于未成熟肝母细胞瘤，具有高分裂活性(Shachaf等人，2004年;Tward等人，2005年)，而肿瘤是由遇见相似分化的人肝细胞癌（HCC）(Tward等人，2005年;Wang等人，2001年). 由以下因素诱发的肿瘤遇见携带β-catenin的自发激活突变(Tward等人，2007年). 异常表达和活性MYC公司(Kaposi-Novak等人，2009年;Thorgeirsson和Grisham，2002年)，激活突变并增加遇见(Kaposi-Novak等人，2006年;Ueki等人，1997年)激活β-catenin的突变(de La Coste等人，1998年;Tward等人，2007年)经常发生在人类肝癌中。

为了评估致癌转化对代谢的影响是否取决于组织环境，我们使用了一个由过度表达MYC公司(Allen等人，2011年). 在一些人类肺癌中观察到MYC家族成员的表达增加(Gazzeri等人，1994年;Yokota等人，1988年)、和MYC公司小鼠肺部过度表达导致腺癌(Allen等人，2011年;Tran等人，2008年).

我们发现肿瘤中的葡萄糖和谷氨酰胺代谢随起始病变的性质而变化(MYC公司或遇见)以及起源组织。此外，Gls1是谷氨酰胺酶的一种亚型，在MYC公司-诱导肿瘤，导致高水平MYC公司并使用谷氨酰胺为克雷布斯循环提供燃料。我们得出的结论是，代谢谱对于确定肿瘤代谢变化的性质以及选择针对这些变化的适当治疗方法至关重要。

结果

MYC公司和遇见对肝脏葡萄糖代谢有不同的影响

癌症的特征之一是有氧糖酵解（Warburg效应），与葡萄糖消耗增加和葡萄糖分解代谢产物乳酸水平增加相关(沃堡，1956年). 因此，我们首先研究了以下两种药物诱导的小鼠肿瘤中的葡萄糖代谢是否发生了变化MYC公司或遇见在Tet-可抑制启动子控制下FVBN小鼠肝脏中特异表达的转基因(Shachaf等人，2004年;Wang等人，2001年). 从饮食中去除强力霉素可诱导转基因表达和肿瘤形成。转基因动物采用强力霉素饮食，野生型FVBN小鼠作为对照。

我们发现两种药物诱发的肿瘤中葡萄糖水平低于正常值MYC公司或遇见(图1A). 与此相一致的是，葡萄糖-6-磷酸酶（葡萄糖生物合成的关键酶之一）在这两种肿瘤中的表达均降低(图S1A和S1B)这表明这两种肿瘤的葡萄糖合成都可能不足。在MYC公司-与正常肝脏相比，诱发肿瘤的葡萄糖水平降低通常与乳酸水平升高有关(图1B). 此外，乳酸水平MYC公司-诱导的肿瘤明显高于肿瘤附近表面上正常的肝组织(图S1C和S1D). 尽管七分之三遇见-总的来说，我们观察到乳酸水平高于邻近组织（数据未显示），遇见-与正常肝脏相比，诱发肿瘤的乳酸水平没有统计学意义上的增加(图1B)或邻近肝组织(图S1C和S1D).

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乳酸水平显著增加MYC公司-诱导但不在遇见-诱发小鼠肝癌

（A和B）通过酶法测定肿瘤和正常肝组织提取物中的葡萄糖和乳酸水平。正常组织取自野生型FVBN小鼠和使用强力霉素的转基因小鼠。（C和D）代表性简介1对注射[U-13C] -葡萄糖（所分析的动物数量以1E级). 1.21和1.42 ppm的两个卫星峰值代表完全标记13C-乳酸。将剖面归一化为组织的初始干重。（E）量化13样品中的C-乳酸浓度1摄氏度和一维。#,第页=0.050遇见-诱发肿瘤与。MYC公司-诱发肿瘤。（F） 利达通过实时PCR估计样本中的RNA水平A类和B类小鼠β-肌动蛋白作为内部对照。其中一个FVBN正常肝脏作为参考。（G）通过免疫印迹法评估正常肝脏和肿瘤的全组织裂解物的Ldha表达。膜的Ponceau染色用于确认蛋白质负载。（H）使用强力霉素的转基因小鼠肿瘤和正常肝脏细胞溶质部分的LDH活性测定。所有数值均为平均值±标准差。另见图S1.

为了测试葡萄糖分解代谢是否有助于增加MYC公司-诱导肿瘤，我们给予统一标记13C-葡萄糖，[U-13C] -葡萄糖，致肿瘤动物。[U的管理-13C] -葡萄糖导致13肝肿瘤中C-乳酸水平的变化MYC公司(图1D、1E和​和4C）。4厘米). 相反，遇见-诱导肿瘤仅显示轻微或无增加13C-乳酸水平，总体上无统计学意义(图1C、1E和​和4C）。4厘米). 这些结果表明MYC公司-诱导肿瘤可能是葡萄糖产生乳酸增加的结果，至少部分是这样。

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葡萄糖和谷氨酰胺的分解代谢促进了Krebs循环中间体的合成MYC公司-诱发性肝癌

（A和B）用GC-MS测定组织提取物中克雷布斯循环中间产物的水平。数值为平均值±标准差。（C和D）代表性光谱1H（H）-13C HSQC NMR对注射[U-13C] -葡萄糖（C）或[U-13C] -谷氨酰胺（D）（每组至少3只动物）。将剖面归一化为初始干重。Glc，葡萄糖；G6P，葡萄糖-6-磷酸；谷氨酸；GSH，还原型谷胱甘肽；GSSG，氧化谷胱甘肽；谷氨酰胺；天冬氨酸；琥珀酸；Ala，丙氨酸；乳酸。另请参见图S4.

乳酸由丙酮酸产生，丙酮酸是葡萄糖通过糖酵解分解代谢的最终产物，由乳酸脱氢酶（LDH）产生。在人类癌症中观察到LDH活性增加及其A亚单位（Ldha）表达增加，这有助于丙酮酸快速转化为乳酸(Goldman等人，1964年). 出乎意料的是，尽管利达RNA仅在MYC公司-诱发性肿瘤(图1F)Ldha蛋白水平(图1G)和总LDH活性(图1H)在两种类型的肿瘤中都有相同程度的增加。这表明LDH活性增加并不是导致两种致癌基因诱导的肿瘤之间乳酸水平差异的唯一因素。

为了理解为什么LDH活性增加伴随着葡萄糖衍生乳酸水平升高MYC公司-诱发肿瘤比遇见-我们比较了这两种肿瘤的葡萄糖转运和分解代谢。为了分析我们使用的葡萄糖转运18氟脱氧葡萄糖（FDG）和正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）。虽然这两种肿瘤的葡萄糖转运都高于正常值，但FDG摄取强度在MYC公司-诱发肿瘤比遇见-诱发性肿瘤(图2A和2B). 在MYC公司-诱发肿瘤表明，这些肿瘤分解葡萄糖的速度比遇见-诱发肿瘤。

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两种药物诱导的肿瘤中葡萄糖水平的控制不同MYC公司或遇见

（A）PET/CT成像18在正常和荷瘤动物上进行F-FDG摄取。成像后，通过每个扫描图像下的照片确认肿瘤的存在。箭头表示肿瘤。展示了具有代表性的动物图片。（B） 18F-FDG摄取量如实验程序所述进行量化。正常组包含一只FVBN小鼠，每只小鼠携带MYC公司或遇见转基因并继续使用强力霉素，第页=0.038遇见与正常**，第页=0.023适用于MYC公司与正常和#相比，第页=0.036遇见与。MYC公司.（C和E）葡萄糖激酶的RNA水平（C）和香港2号 （E）以小鼠β-actin作为内部对照，在正常组织和肿瘤组织中进行测定。结果标准化如下图1F.数值以平均值±s.d的形式给出。（D）通过免疫印迹法评估正常组织和肿瘤组织细胞溶质部分中葡萄糖激酶的表达。Ponceau染色用于确认蛋白质负荷。（F）使用β-肌动蛋白作为负载对照，通过免疫印迹法测量正常和肿瘤样品的全组织裂解物中的Hk2蛋白水平。另请参见图S2和表S1.

接下来，我们比较了两种肿瘤中葡萄糖分解代谢第一步的调节，即葡萄糖磷酸化。在正常肝细胞中，葡萄糖磷酸化由葡萄糖激酶催化，葡萄糖激酶对葡萄糖具有高Km（低亲和力），并且以其活性形式定位在胞质溶胶中(Bustamante等人，2005年). 我们发现葡萄糖激酶表达在MYC公司-诱发性肿瘤(图2C和2D). 与此一致，我们在正常肝脏的细胞溶质部分检测到高Km（17 mM）的葡萄糖-6-磷酸化活性，但在MYC公司-诱发性肿瘤(表S1). 与…对比MYC公司-诱导肿瘤，葡萄糖激酶表达减少遇见-诱发性肿瘤(图2C和2D)与正常肝脏相比，这些肿瘤细胞溶质部分的葡萄糖-6-磷酸化活性降低了Km和Vmax(表S1). 这些结果表明，尽管遇见-与正常肝脏相比，诱导肿瘤可能含有较少的葡萄糖激酶，它可能是一种更有效的葡萄糖酶形式。

己糖激酶II（Hk2）是一种己糖激酶亚型，对葡萄糖具有低Km（高亲和力），并且可以在人类肿瘤和癌细胞系中过度表达(Bustamante等人，1981年). Hk2定位于细胞质和线粒体膜。Hk2的线粒体定位可能提高其效率(Bustamante等人，1981年). 我们发现Hk2在由MYC公司但在那些由遇见(图2E和2F). 与此一致，线粒体部分出现低Km（0.01–0.08 mM）的葡萄糖-6-磷酸化活性，细胞溶质部分增加10倍MYC公司-诱发肿瘤，同时保持不变遇见-诱发性肿瘤(表S1).

除Hk2外MYC公司，但不是遇见增加了磷酸果糖激酶肝脏和血小板特异性亚单位的表达(图S2)是关键糖酵解酶之一。全酶中这些亚基的高丰度有助于加速葡萄糖分解代谢(Vora等人，1985年).

总之，我们的结果表明，与正常肝脏相比，这两种肿瘤的葡萄糖转运和分解代谢可能增加。然而，MYC公司-诱导性肝肿瘤的葡萄糖摄取和分解代谢明显高于遇见-诱导肝脏肿瘤，这可能解释了为什么MYC公司-诱导肿瘤显著增加了乳酸水平，而遇见-诱导肿瘤则不然。

MYC公司和遇见对肝脏谷氨酰胺代谢的不同影响

谷氨酰胺是另一种主要营养素，其代谢在肿瘤发生过程中可能发生改变(Marquez等人，1989年). 核磁共振（NMR）分析表明，谷氨酰胺水平在MYC公司-诱发性肿瘤(图3A)，而谷氨酰胺水平在遇见-诱导肿瘤与正常肝脏的比较(图3B和3C).

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两者诱发的肝癌中谷氨酰胺代谢不同MYC公司或遇见

（A和B）通过核磁共振测定多西环素转基因小鼠肿瘤和正常肝脏中的谷氨酰胺水平。代表1显示了正常肝脏和肿瘤的核磁共振氢谱（每组至少四只动物）。谷氨酰胺峰位于2.42–2.47 ppm区域，谷氨酸峰位于2.32–2.37 ppm区域。将剖面归一化为初始干重。（C）正常肝脏和遇见-诱导肿瘤基于1H-NMR数据B.（D）使用β-肌动蛋白作为负荷控制，通过全组织裂解物的免疫印迹评估指示蛋白的表达。（E） Gls1号机组使用小鼠β-肌动蛋白作为内部对照，测量正常组织和肿瘤组织中的RNA水平。（F）线粒体部分磷酸依赖性谷氨酰胺酶活性的测定MYC公司-用强力霉素维持转基因小鼠的诱导肿瘤和正常肝脏。所有数值均为平均值±标准差。（G）检测13C-标记谷氨酰胺1H（H）-13对注射[U-13C] -葡萄糖（每组5只动物）。图中显示了具有代表性的HSQC光谱。13C-4-谷氨酰胺峰值为2.45 ppm。与谷氨酰胺消耗相一致13C-4-谷氨酰胺峰在MYC公司-诱发肿瘤。将剖面归一化为组织的初始干重。另请参见图S3.

为了调和两种致癌基因诱导的肿瘤之间谷氨酰胺水平的差异，我们评估了两种酶的表达：谷氨酰胺合成酶（Glul），它催化氨和谷氨酸的连接生成谷氨酰胺；以及磷酸依赖性谷氨酰胺酶，它负责谷氨酰胺分解代谢为谷氨酸。肝型谷氨酰胺酶（Gls2）在成人门脉周围肝细胞、大脑和胰腺中表达，而肾型谷氨酰胺蛋白酶（Gls1）在胚胎肝细胞、大多数成人组织（出生后肝脏除外）和一些癌细胞系中表达(柯特霍斯和沃特福德，1995年;Perez-Gomez等人，2005年). 我们在MYC公司-与正常肝脏相比，Glul的表达受到抑制(图3D和S3A系列)谷氨酰胺酶的Gls2亚型的表达被Gls1亚型取代(图3D、3E和S3B型). 重要的是，谷氨酰胺酶亚型的改变与谷氨酰胺酶活性的增加有关(图3F). 最后，MYC公司-诱导的肿瘤表现出高亲和力谷氨酰胺转运蛋白Slc1a5的表达增加(图3D和S3C系列)它被认为能为癌细胞株提供足够数量的谷氨酰胺，以增加其分解代谢(Bode，2001年). 这些结果表明，谷氨酰胺合成在MYC公司-诱导肿瘤，而其转运和分解代谢增加。

与…对比MYC公司-诱发肿瘤，遇见-诱导的肿瘤增加了Glul的表达(图3D和S3A系列)这与β-catenin中存在激活突变相一致(Tward等人，2007年)，一种转录激活物Glul公司(Cadoret等人，2002年). 此外，在遇见-诱导的肿瘤Gls2表达降低(图3D和S3B型)，Gls1未表达(图3D和3E)Slc1a5的表达仅略高于正常(图3D和S3C系列). 与谷氨酰胺代谢酶的表达模式一致，给药均匀标记13C-谷氨酰胺，[U-13C] -谷氨酰胺，对荷瘤小鼠导致13C-谷氨酰胺遇见-诱发性肿瘤(图4D，右图），表明谷氨酰胺被转运到肿瘤中，但其分解代谢与正常肝脏相比显著降低。

葡萄糖是谷氨酰胺生物合成的主要底物之一。[U的管理-13C] -葡萄糖导致13C-谷氨酰胺遇见-诱发性肿瘤(图3G和图4C，左侧面板）。这些结果表明遇见-诱发肿瘤、葡萄糖摄入增加有助于谷氨酰胺生物合成增加，谷氨酰胺水平升高可能是由于合成增加和分解代谢抑制所致。我们得出结论，谷氨酰胺分解代谢在MYC公司-诱发肿瘤，而谷氨酰胺生成增加遇见-诱发肿瘤。

MYC公司-诱导的肿瘤增加了Krebs循环中间体的合成

由于葡萄糖和谷氨酰胺是克雷布斯循环的主要燃料，我们比较了两种肿瘤和正常肝脏中克雷布斯周期中间产物（富马酸、苹果酸和柠檬酸）和相关代谢物（谷氨酸和天冬氨酸）的总水平。所有这些化合物的水平在MYC公司-诱导但不在遇见-诱发性肿瘤(图3A、3B,4A和4B). 此外，[U-13C] -葡萄糖或[U-13C] -谷氨酰胺导致13C-柠檬酸盐，13C-谷氨酸和13C-天冬氨酸MYC公司-诱发性肿瘤(图4C、4D,S4A和S4B). 这与遇见-诱导肿瘤，表现出轻微或无变化(图4C、4D,S4A和S4B). 这些结果表明，葡萄糖和谷氨酰胺的转运和分解代谢增加MYC公司-诱导肿瘤有助于合成Krebs循环中间产物，与正常肝脏和遇见-诱发肿瘤。

注入[U-13C] -谷氨酰胺还增加了13C转化为乳酸MYC公司-诱发性肿瘤(图4D，右面板），表明谷氨酰胺分解代谢增加可能有助于在这些肿瘤中观察到的乳酸水平增加。然而，目前我们还不能确定标记的乳酸是否是通过谷氨酰胺水解从谷氨酰胺中产生的(DeBerardinis等人，2008年)或者是由[U-13C] -谷氨酰胺通过糖异生作用。

组织环境影响代谢重编程的结果MYC公司

为了评估致癌转化引起的代谢变化是否具有组织特异性，我们分析了由MYC公司(Allen等人，2011年). 的表达式MYC公司在FVBN小鼠的肺细胞中，通过Tet激活的启动子，通过保持小鼠摄入强力霉素，特异性地驱动(Allen等人，2011年;Tran等人，2008年). 野生型小鼠的正常肺和喂食不含强力霉素的食物的小鼠作为对照。

我们发现乳酸水平(图5A)以及Hk2和Ldha的表达(图5B)在由MYC公司这表明，与肝脏肿瘤类似，MYC公司-诱导转化与肺部肿瘤中葡萄糖分解代谢增加为乳酸有关。然而，与肝肿瘤相比，肺肿瘤是由MYC公司谷氨酰胺水平升高(图5C).

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的代谢MYC公司-诱发性肺肿瘤不同于MYC公司-诱发性肝癌

（A）乳酸水平测量方法1肺肿瘤的核磁共振氢谱MYC公司（肿瘤）和来自同一动物的相邻肺叶（相邻肺）或来自患有MYC公司转基因不含强力霉素（正常）。数值为平均值±标准差。（B和D）使用β-肌动蛋白作为负荷控制，通过免疫印迹法在整个组织裂解物中估计指示蛋白的水平。（C）用GC-MS测定组织提取物中的谷氨酰胺水平。数值为平均值±标准差。（E–I）正常肺组织Glul表达的免疫化学检测（E）,MYC公司-诱发性肿瘤（F–H）和邻近肺部（一）Glul在正常肺的支气管上皮、肿瘤细胞和肿瘤邻近肺的浸润免疫细胞中表达明显（箭头所示）。

虽然Gls1的表达在MYC公司-在四分之三的肺部肿瘤中，Glul的表达也高于正常水平(图5D). 免疫组织化学分析显示，在正常肺中，Glul的表达仅限于支气管上皮(图5E)而在肺部肿瘤中，Glul在肿瘤细胞中高表达(图5F–H). Gls2在正常肺中的表达低于肝脏，在肺部肿瘤中没有变化(图6A和数据未显示）。与之前对人类肺癌患者进行的[U-13C] -葡萄糖(Fan等人，2009年)，谷氨酰胺产量增加MYC公司-诱导小鼠肺肿瘤可能是葡萄糖转化为谷氨酰胺增加的结果。虽然谷氨酰胺分解代谢也可能因Gls1表达增加而在肺部肿瘤中增加，但Glul表达增加可能会覆盖Gls1的表达增加，并解释了谷氨酰胺净水平增加的原因。

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GLS1抑制剂通过Krebs循环影响谷氨酰胺分解代谢

（A）将IMR90-ERMYC和HA1E-MYCE细胞与OHT（MYC）培养24小时打开)或0.1%乙醇（MYC下车). GLUL、GLS2和GLS1在这些细胞、正常肝和肺以及MYC公司-通过使用β-肌动蛋白作为负载对照的免疫印迹诱导肝和肺肿瘤。*，表示人类细胞系中抗Gls2抗体识别的交叉反应带。（B和C）用2 mM[U孵育具有诱导MYC活性的IMR90-ERMYC细胞-13C] -谷氨酰胺和指示浓度的BPTES持续12小时。0.1%二甲基亚砜用作车辆控制。绝对浓度（B）和13碳同位素富集（C）用GC-MS测定了所示化合物中的C类代谢物+0代表单同位素或未标记同位素，代谢物+1至5代表1至5的同位素13C原子。结果参考了细胞颗粒的初始干重。给出了两个重复样本的平均值。实验重复了两次。（D）用2 mM培养具有诱导MYC的IMR90-ERMYC细胞15N个2-谷氨酰胺和BPTES、20767或DON的指示浓度。成立15N转化为腺嘌呤核苷酸（AXP）通过以下方法进行评估1核磁共振氢谱。这些曲线参考了细胞颗粒的干重和内标浓度。给出了两个独立实验的代表性曲线。另请参见图S5和S6.

在邻近小鼠肿瘤的表面正常肺组织中也观察到Glul蛋白和谷氨酰胺水平升高(图5C和5D). 免疫组织化学分析显示，Glul在浸润正常组织的免疫细胞中表达(图5I)这可能至少部分解释了谷氨酸和谷氨酰胺水平增加的原因。

这些数据共同表明，尽管一些调节代谢途径的机制MYC公司-诱导的肝肿瘤在MYC公司-诱发肺部肿瘤时，组织特异性的结果确实存在差异。

MYC公司使细胞对谷氨酰胺酶抑制敏感

我们之前已经证明，过表达谷氨酰胺的细胞的存活需要通过Krebs循环进行谷氨酰胺代谢MYC公司(Yueva等人，2007年). 由于从Gls2到Gls1的转变伴随着谷氨酰胺分解代谢在Krebs循环中的增加MYC公司-诱导小鼠肝肿瘤(图3D和​和4D），4D（四维）)，我们推断Gls1可能是消除分解代谢谷氨酰胺和过度表达谷氨酰胺的细胞的可能靶点MYC公司为了测试这种可能性，我们使用了正常人肺成纤维细胞（IMR90）和永生化人肾上皮细胞（HA1E），它们表达可被4-羟基三苯氧胺（OHT）激活的MYC的条件版本（IMR90-ERMYC和HA1E-MYCER）(Yueva等人，2007年)以及组成性过度表达野生型MYC（HA1E-MYC）的HA1E细胞。我们发现所有这些品系的代谢特征与MYC公司-诱导的肝肿瘤，无论是否存在活性异位MYC，即：（i）与肿瘤中GLS1水平相当(图6A和​和7D）；第7天); （ii）GLS1高于GLS2表达的流行率(图6A); （iii）低水平的GLS2和GLUL(图6A). 此外，所有细胞系都以葡萄糖作为乳酸的主要来源(图S5A、S5C和谷氨酰胺作为克雷布斯循环的主要燃料(图S5B、S5D和数据未显示）。我们将这种表型归因于细胞系中内源性MYC的相对丰度(图7D以及未显示的数据），这可能表示对持续传播的适应在体外然而，情况仍然是，MYC活性的进一步增加会增加HA1E和IMR90细胞对谷氨酰胺缺乏的敏感性(Yueva等人，2007年). 这些结果表明，改变细胞的代谢表型并使其依赖谷氨酰胺生存可能需要不同水平的MYC。我们继续测试IMR90和HA1E细胞在MYC活性增强的情况下对GLS1抑制的反应。

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GLS1抑制剂诱导MYC公司-依赖性细胞凋亡

（A）在HA1E-MYCER和IMR90-ERMYC细胞中诱导MYC活性，如图6A然后用指定浓度的BPTES或20767或5 mM DON处理细胞。0.1%二甲基亚砜被用作BPTES实验的载体对照。HA1E-MYCER细胞处理36小时，IMR90-ERMYC细胞处理48小时，并对凋亡细胞核的百分比进行评分。三个独立实验的平均值为±标准差。（B）用空载体或携带MYC或H-RAS的载体转导的HA1E细胞V12版本在无谷氨酰胺培养基中培养或用指定浓度的BPTES处理24小时。在三个独立的重复样本中对细胞凋亡进行评分。给出的值为平均值±标准差。显示了两个独立实验的代表性。（C）HA1E衍生的细胞系感染了慢病毒，慢病毒表达一个扰乱的shRNA（shScr）或两个靶向GLS1的独立shRNAs（shGLS1_1和shGLS1_2）。在感染后36或48小时收集细胞，用免疫印迹法检测GLS1的表达，并通过计数凋亡细胞核对凋亡进行评分。对于每个shRNA，实验至少重复两次。使用空pLKO.1载体（EV）进行转导，以解释慢病毒感染导致的细胞死亡的异常水平，慢病毒感染是在MYC异位表达的HA1E细胞中观察到的。（D）MYC和H-RAS的异位表达V12版本western blotting检测ERK、P-ERK和GLS1在全细胞裂解液中的表达。PERK表达增加表明RAS活性增加。（E）在150μM 20767的存在下培养显示Burkitt淋巴瘤细胞系。Annexin V和PI染色分析细胞死亡。显示了两个独立实验的代表。

我们使用了GLS1抑制剂，双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫化物（BPTES）(Robinson等人，2007年)，及其水溶性类似物，20767(Erdmann等人，2007年). 随着谷氨酰胺水平的增加，BPTES和20767都降低了谷氨酸和其他克雷布斯循环中间产物及其产物的水平(图6B,S6A系列以及谷氨酰胺衍生物的掺入13C进入这些化合物(图6C,S6B系列和数据未显示）。重要的是，与谷氨酰胺类似物、谷氨酰胺酶和酰胺转移酶抑制剂6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸（DON）不同，BPTES和20767均不抑制谷氨酰胺衍生物的掺入15N转化为腺嘌呤核苷酸物种(图6D). 这些结果表明，BPTES和20767均抑制谷氨酰胺酶活性，但保留参与核苷酸生物合成的酰胺转移酶活性。

BPTES和20767均以MYC依赖方式诱导IMR90-ERMYC和HA1E-MYCE细胞凋亡(图7A). 此外，HA1E-MYC细胞对BPTES处理比用载体控制（HA1E-vector）转导的HA1E细胞更敏感(图7B). 通过两个独立的shRNAs沉默HA1E-MYC和HA1E-V载体细胞中GLS1的表达，证实BPTES对体外表达MYC细胞活力的影响是由于GLS1活性的抑制(图7C). 20767治疗还杀死了人类Burkitt淋巴瘤细胞系，这些细胞系过度表达MYC，这是由特征性的MYC公司(图7E). 与MYC相比，H-RAS的异位表达V12版本不会使HA1E细胞对谷氨酰胺缺乏或GLS1活性抑制敏感(图7B和7C).

我们得出结论，MYC而非H-RASV12版本显示出与GLS1活性抑制的合成致命相互作用，MYC的过度表达可能是对这种抑制敏感性的一个有价值的生物标志物。此外，对谷氨酰胺酶的特异性抑制可能比使用谷氨酰胺类似物的治疗毒性更低，这种类似物可能干扰核苷酸生物合成，从而导致DNA损伤(Hastak等人，2008年).

讨论

肿瘤代谢的决定因素

在这里，我们证明了由以下两种因素引起的肝肿瘤MYC公司或遇见具有不同的代谢表型。此外MYC公司-诱导性肝肿瘤不同于MYC公司-诱发肺部肿瘤。期间观察到的一些代谢变化MYC公司-诱导肝和肺肿瘤发生，包括Hk2、Ldha和Gls1表达增加，可能是MYC自身过度表达的结果(Gao等人，2009年;Osthus等人，2000年;怀斯等人，2008年). 另一方面，由MYC公司这可能是由于其他致瘤事件或由组织特异性功能决定的。例如，MYC公司-通过增加Glul的表达，可将诱导的肺部肿瘤与肝脏肿瘤区分开来。然而，据我们所知，Glul表达的调节MYC公司从未有报道，Glul是众所周知的β-连环蛋白的转录靶点(Cadoret等人，2002年)在人类肺癌的一部分中被激活(Sunaga等人，2001年). 然而，我们的免疫组化分析显示MYC公司-诱导的肺肿瘤，β-连环蛋白位于细胞质膜而不是细胞核（数据未显示），表明该蛋白未被突变激活，不太可能是Glul过度表达的原因。炎症期间，糖皮质激素可刺激肺上皮细胞中Glul的表达(Abcouwer等人，1996年). 这表明Glul表达增加MYC公司-诱导的肺肿瘤细胞可能由肿瘤相关炎症引起。

虽然在肝肿瘤中Gls1和Glul的表达在RNA水平上受到调节(图3和S3A系列)，这些蛋白在肺肿瘤中的表达是在蛋白水平上调节的（数据未显示）。这一观察结果与MYC在转录后调节蛋白质表达的能力一致(Chang等人，2008年)Gls1表达的调节方式不同MYC公司不同来源的细胞系之间(Gao等人，2009年;怀斯等人，2008年). 这也表明代谢酶表达的调节机制MYC公司或其他与肿瘤发生有关的因素是特定的。

乳酸水平和LDH活性的增加并不总是与肿瘤相关

即使在正常氧合的情况下，葡萄糖消耗量和乳酸生成量的增加也是公认的肿瘤代谢特征。我们的结果表明，尽管LDH（丙酮酸转化为乳酸的酶）的活性在两种药物诱导的肝肿瘤中增加到相同的程度MYC公司或遇见(图1H)，只有在MYC公司-诱发性肿瘤(图1B和S1C系列). 这表明LDH活性的增加并不一定与肿瘤中乳酸水平的增加相关。

在两者中MYC公司和遇见-诱导的肝肿瘤，葡萄糖转运和葡萄糖磷酸化活性高于正常肝脏(图2和表S1)表明糖酵解通量和葡萄糖衍生丙酮酸稳态水平在这两种肿瘤中都可能增加(Marin-Hernandez等人，2006年). 与…对比MYC公司-然而，大多数肝脏肿瘤患者的葡萄糖转运和分解代谢增加遇见-诱导的肿瘤可能不足以产生大量丙酮酸和NADH，使与LDH竞争这些底物的酶饱和(Spriet等人，2000年). 此外，在MYC公司-诱导肿瘤也可能导致LDH可用的丙酮酸过剩(DeBerardinis等人，2008年); 和MYC公司和遇见可能对与LDH竞争的丙酮酸利用酶的活性以及细胞的氧化还原状态有不同的影响。然而，LDH表达增加遇见-诱导肿瘤可能有助于确保一旦丙酮酸的任何过剩变得可用，它就会有效地转化为乳酸再生NAD+糖酵解周转所必需的。观察到LDH表达增加MYC公司或遇见-诱导肿瘤也可能独立于其代谢功能发挥作用(Ronai，1993年).

代谢变化在MYC公司和遇见-诱导肿瘤发生

通过Krebs循环将葡萄糖分解代谢结合为乳酸和谷氨酰胺分解代谢，通过同时向肿瘤细胞提供ATP和生物合成前体来支持肿瘤细胞的快速增殖(DeBerardinis等人，2008年;McKeehan，1982年). 的确，MYC公司-诱导的肝肿瘤通过Krebs循环增加了葡萄糖的乳酸生成，增加了葡萄糖和谷氨酰胺的分解代谢，其增殖率高于遇见-诱导性肝肿瘤(图S7A)不会显著增加葡萄糖分解代谢为乳酸，并产生而不是分解代谢谷氨酰胺。

细胞内谷氨酰胺水平升高可激活哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1）靶标，该复合物是细胞生长和增殖的主要调节因子之一(Nicklin等人，2009年). 因此，GLUL表达增加，导致细胞内谷氨酰胺水平升高遇见-诱导性肝肿瘤和MYC公司-诱导的肺肿瘤可能有助于在缺乏外源性谷氨酰胺的情况下确保mTORC1活性，并使肿瘤细胞在营养受限的条件下具有优势。与这一假设一致，谷氨酰胺缺乏并不影响具有高GLUL水平的Huh7或HEPG2细胞中S6（P-S6）的磷酸化，S6是mTORC1活性的标记(图S7B). 相反，谷氨酰胺缺乏导致SK-HEP-1细胞中P-S6的减少，而SK-HEP1细胞没有检测到GLUL的表达(图S7B).

MYC与GLS1抑制的合成致死相互作用

我们目前的工作表明，Gls1抑制剂可能会消除过度表达MYC的肿瘤细胞，并分解代谢谷氨酰胺以补充Krebs循环。在大多数MYC公司-然而，我们检测的诱导性肺肿瘤中Gls1表达增加伴随着Glul表达增加(图5)这表明这些肿瘤可能会分解代谢并产生谷氨酰胺。增加Glul的表达足以保护细胞免受谷氨酰胺缺乏(Kung等人，2011年). 然而，它是否能使过度表达MYC的细胞对GLS1抑制产生抗性，仍有待研究。各种回补途径对克雷布斯循环的贡献(Cheng等人，2011年)在识别可能从抑制谷氨酰胺酶活性中受益的恶性肿瘤时，也应予以考虑。

由于谷氨酰胺酶的GLS2亚型负责正常肝脏中的谷氨酰胺分解代谢，因此选择性抑制GLS1为靶向过度表达的肝肿瘤的谷氨酰胺降解代谢提供了机会MYC公司不影响正常肝脏的代谢。另一方面，GLS1抑制可能对其他表达GLS1的正常组织（如肾、肠、肺和脑）有毒。然而，我们的结果表明，除非存在高水平的MYC，否则IMR90和HA1E细胞中GLS1的表达不会使细胞受到GLS1抑制的致命影响，这表明MYC水平正常的正常组织可能不受GLS1抑制剂的影响。MYC过度表达的一个众所周知的后果是通过改变促生存和促死亡信号之间的平衡来诱导细胞凋亡(Meyer和Penn，2008年). GLS1抑制导致Krebs循环活性降低(图6和第6页)当基因表达高于某一阈值时，可能代表一种应激信号，可以释放MYC的促凋亡活性(Murphy等人，2008年).

谷氨酰胺是多种代谢反应的底物，谷氨酰胺酶只催化其中一种。事实上，完全剥夺谷氨酰胺可以更有效地杀死高水平谷氨酰胺的细胞MYC公司而不是抑制谷氨酰胺酶(图7B). 这表明谷氨酰胺代谢的其他途径可能为谷氨酰胺的过度表达提供额外的合成致死相互作用的机会MYC公司(DeBerardinis和Cheng，2010年;Mates等人，2006年). 识别这种相互作用可能会提供额外的治疗机会。

实验程序

动物

癌基因驱动的肝脏(Shachaf等人，2004年;Wang等人，2001年)和肺(Allen等人，2011年;Tran等人，2008年)如前所述生成肿瘤。请参阅补充实验程序了解更多详细信息。

为了对葡萄糖或谷氨酰胺代谢进行同位素分析，向荷瘤小鼠注射20 mg[U-13C] -葡萄糖（剑桥同位素实验室）(Fan等人，2011年)或连续注射三次（间隔15分钟）[U-13C] -谷氨酰胺，每只7毫克（剑桥同位素实验室）静脉注射，最后一次注射15分钟后处死小鼠。百分比13在无瘤肝组织和患有上述两种疾病的动物的肿瘤中，葡萄糖或谷氨酰胺中的C富集是可比较的MYC公司或遇见-诱发肝肿瘤。百分比13葡萄糖中的C富集度为6±2%。百分比13谷氨酰胺中C的富集程度在13%到42%之间，具体取决于单个动物。肿瘤和邻近肝组织的样本在液氮中快速冷冻。所有实验均按照旧金山加利福尼亚大学动物研究委员会批准的方案进行。

细胞培养

原代IMR90人肺成纤维细胞和永生化HA1E人肾上皮细胞表达ER-MYC公司或MYC-ER公司分别在前面描述过(Yueva等人，2007年). HA1E细胞异位表达MYC公司或H-RAS公司V12版本通过逆转录病毒载体pMaRX-puro转导产生(Hannon等人，1999年)携带其中之一MYC公司或H-RAS公司V12版本如前所述(法莱罗和拉泽布尼克，2000年). 请参阅补充实验程序详细描述shRNAs的培养、处理条件和序列。

代谢物分析

将所有用于代谢产物分析的冷冻组织样品粉碎并冷冻干燥。冷冻细胞颗粒被冻干。如前所述，通过NMR和气相色谱-质谱（GC-MS）提取和分析代谢物(Fan，2010年;Fan等人，2009年). 请参阅补充实验程序了解更多详细信息。

18F-FDG PET/CT成像

动物处理和准备方案遵循既定程序，以获得一致的PET结果(Fueger等人，2006年)（请参阅补充实验程序更多详细信息）。为了定量评估，将感兴趣体积（VOI）放置在涉及肿瘤的肝脏（直径为5mm、高度为5mm的圆柱体）和主要涉及小脑的大脑（直径为3mm、高度为3mm的圆柱体）中。肝脏VOI的摄取量与大脑VOI的摄入量标准化。

酶分析

如前所述，从新鲜切除的正常肝脏或肿瘤中分离出线粒体部分(Frezza等人，2007年). 通过103000 g离心60分钟，进一步将细胞质从微粒体中分离出来。在细胞溶质部分测定LDH活性，在细胞溶液和线粒体部分测定葡萄糖-6-磷酸化活性，在线粒体部分测定磷酸依赖性谷氨酰胺酶活性。请参阅补充实验程序了解更多详细信息。

定量PCR分析和Western印迹

协议、TaqMan®基因表达检测和抗体如所述补充实验程序.

统计分析

采用双尾Student t检验进行统计分析。对于总浓度和13比较肿瘤和邻近肝组织中C-标记的乳酸和谷氨酸(图1E,S1C和S4)采用配对Student t检验。在所有其他分析中，使用了非配对学生的t检验。

​

集锦

  • MYC公司和遇见不同程度地影响肝脏中的葡萄糖和谷氨酰胺代谢。
  • 组织环境通过以下方式影响代谢重编程的结果MYC公司.
  • MYC公司过表达使细胞对Gls1谷氨酰胺酶的抑制敏感。

补充材料

01

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致谢

我们感谢A.Lane博士、S.Arumugam博士、J.Tan和R.Burra博士（肯塔基州路易斯维尔路易斯维尔大学）在代谢谱分析方面的帮助，以及A.Lane医生对手稿的宝贵意见；A.Goga博士和A.Balakrishnan博士（加利福尼亚大学旧金山分校）对初步结果进行了有益的讨论；L.Urisman（加利福尼亚大学旧金山分校），协助畜牧业；和主教实验室的成员进行有价值的讨论和评论。

国家研究资源中心NIH拨款P20RR018733和NSF EPSCoR拨款EPS-0447479部分支持核磁共振分析。代谢产物分析得到了NSF EPSCoR拨款EPS-0447479、NCI拨款1R01CA118434-01A2和3R01 CA118434-02S1的支持；路易斯维尔大学CTSPGP奖（T.W.M.F.）。这项工作还得到了UCSF/G.W.Hooper研究基金会捐赠基金和NCI Grant R35 CA44338（J.M.B.）的支持；UCSF Hellen Diller家庭综合癌症中心试点拨款和UCSF放射和生物医学成像部种子拨款10-09（X.C.和Y.S.）；约翰·霍普金斯脑科学研究所通过神经翻译项目（T.T.和D.V.F.）；NIH Grant R21NS074151（致T.T.）；Ciencia y Tecnología SAF2010-17573和Junta de Andalucia，Proyectos de Investigación de Excelencia，Convocatoria 2010，CVI-6656，西班牙（J.M.M.和F.J.a.）。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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