结果
T细胞活化诱导代谢重编程
为了了解T细胞如何重新编程代谢途径,以满足激活后增殖爆发的生物能量和生物合成需求,我们使用了一个成熟的体外该模型重现了T细胞抗原刺激过程,无需额外的细胞。新分离的小鼠原代T细胞保存在白细胞介素7(IL-7)中(以下简称“静止T细胞”)(Vella等人,1997年)或用抗CD3加抗CD28(以下简称“活性T细胞”)刺激。激活后,两个CD4+和CD8+T细胞在24小时内增加了细胞大小(图S1A)随后在24–72小时内进行快速细胞分裂(图S1B). 这提供了一个24小时的“窗口”,在其中可以查询激活时代谢的变化,而不会产生潜在的增殖混淆效应。
我们应用基于质谱的代谢组学方法来确定T细胞激活后代谢物的相对细胞内浓度。虽然在早期时间点(活化后6小时),活化的T细胞所含代谢物的数量低于静止的T细胞,但活化时间较长(24小时和30小时)的T细胞积累了大量参与脂质、氨基酸和核苷酸合成代谢途径的代谢物(和表S1). 这可能反映了细胞在进入细胞周期之前的生长情况(图S1A). 相反,脂肪酸β-氧化所需的肉碱在活化后被下调().
TCR和CD28的刺激驱动T细胞代谢重编程(A) 活化后指定时间收集的T细胞内代谢物通过质谱分析。每种代谢物的值代表三倍的平均值,静止T细胞中每种代谢物的数量设置为1。热图表示每种代谢物相对量的log2值,该值按指示的代谢途径分组(见色标)。完整的代谢组学资料见表S1.
(B–F)代谢分析,使用同位素标记示踪剂,以红色突出显示(左侧面板)。静止T细胞(静止)和活化T细胞(在D、E和F中活化后24小时或在B和C中活化后指定时间收集)用于测量三H(H)2O来自[3]-三H] -葡萄糖(糖酵解,B中的右面板)或来自[9,10-三H] -棕榈酸(FAO,右面板C);的一代14一氧化碳2来自[2]-14C] -丙酮酸(TCA,D中的右侧面板),来自[U-14C] -谷氨酰胺(谷氨酰胺水解,E中的右侧面板),或来自[1-14C] -葡萄糖(PPP,右面板,F)。误差条表示三份样品平均值的标准偏差。数据是三个独立实验的代表。
(G) 评估OT-II T细胞增殖的实验程序概述体内(图1H)。
(H) 幼稚OT-II T细胞(CD45.1+)这些细胞被CFSE标记并转移到C57BL/6小鼠中,这些小鼠用OVA免疫,并每天用指定的抑制剂或载体对照进行治疗。免疫后3天分析脾细胞,流式细胞仪检测OT-II细胞增殖。数据代表两个独立的实验。
与早期研究一致(Frauworth等人,2002年)T细胞活化显著上调糖酵解(). 相反,线粒体依赖性脂肪酸β-氧化(FAO)和丙酮酸通过三羧酸循环(TCA循环)的氧化在激活后均显著下调(). 同样,通过氧化分解代谢消耗的谷氨酰胺在激活后显著上调()正如之前的观察所表明的那样(Newsholme等人,1985年). 通过戊糖磷酸途径(PPP)消耗葡萄糖()和耗氧量(图S1C)在活化的T细胞中也显著升高。因此,通过TCA循环,活化迅速将T细胞代谢从FAO和丙酮酸氧化转变为有氧糖酵解、PPP和谷氨酰胺氧化(以下简称“活化诱导的代谢重编程”)。
激活诱导的T细胞增殖需要葡萄糖和谷氨酰胺分解代谢在体外和体内
为了探讨代谢重编程对T细胞生长和增殖的影响,我们在完全培养基或无营养培养基中刺激T细胞。而缺乏谷氨酰胺而非葡萄糖会导致激活诱导的细胞生长受损(图S1D)与脂质和蛋白质生物合成减少有关(图S1E和F),这两种情况都不影响激活标记CD25和CD69的活性或外观(图S1G和H). 然而,这两种情况都会导致激活诱导的细胞增殖受损(图S1I). 与以往工作一致(Rowell和Wells,2006年)T细胞活化与细胞周期抑制剂p27的下调、细胞周期素和细胞周期素依赖性激酶(CDKs)的上调以及S期标记物的出现有关,如RB和Cdc6的磷酸化(图S1J). p27的稳定和S期标记的缺失表明谷氨酰胺饥饿状态下G1细胞周期停滞。然而,控制细胞和葡萄糖缺乏细胞中细胞周期调节器的类似表达和磷酸化模式表明,葡萄糖剥夺可能通过不同于谷氨酰胺饥饿的机制抑制细胞增殖。
接下来,我们应用了一组针对不同代谢途径的强效化学抑制剂。肉碱棕榈酰转移酶-I(CPT-I)抑制剂Etomoxir(Eto)对FAO的抑制不影响T淋巴细胞增殖(图S1K)与活性T细胞中的低FAO通量一致。相反,己糖激酶(HK)抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)、谷氨酰胺酶(Gls)抑制剂6-二氮杂-5-氧代-1-壬亮氨酸(DON)或转氨酶抑制剂氨基氧乙酸盐(AOA),它们中的每一个都抑制激活诱导的代谢途径,阻止T细胞增殖(图S1K).
进一步测试T细胞增殖对葡萄糖和谷氨酰胺分解代谢的依赖性体内,我们使用卵清蛋白(OVA)特异性TCR-转基因OT-II T细胞在过继转移模型中应用2DG和DON()(Shi等人)。与我们的在体外结果:2DG和DON均能部分抑制OVA免疫后抗原特异性活性T细胞的增殖体内(). 因此,激活诱导的T细胞增殖需要葡萄糖和谷氨酰胺分解代谢途径在体外和体内.
T细胞代谢重编程与代谢基因转录组的整体变化有关
T淋巴细胞的抗原激活驱动不同的转录程序,包括细胞周期和细胞因子基因的上调(Lu等人,2004年;Teague等人,1999年). 实时定量PCR(qPCR)分析显示,编码代谢酶和糖酵解转运体的mRNAs的时间依赖性上调()以及PPP的两个分支(图S2A). 值得注意的是,每个代谢酶基因家族中只有一个成员选择性上调(). 免疫印迹分析进一步证实了所选代谢基因在蛋白质水平上的上调(图S2B).
T细胞激活驱动一组不同的代谢基因的转录(A–B)糖酵解途径(A中的左面板)和谷氨酰胺分解途径(B中的左屏幕),代谢基因以蓝色突出显示。从激活后指定时间收集的T细胞中分离RNA,并用于糖酵解途径(A中右图)和谷氨酰胺分解途径(B中右图)中代谢基因的qPCR分析。静止T细胞的mRNA水平设置为1。热图表示相对mRNA表达水平的log2值(见色标)。数值和标准偏差见表S2数据代表两个独立的实验。
(C) 前十个预测的相应转录因子和基序按关联得分的降序排列,这表明特定转录因子与输入基因启动子结合的可能性与表达水平相关。输入基因列表和表达谱见表S3.
通过免疫印迹和qPCR检测活化后指定时间收集的T细胞中HIF1α(分别为D和E)和Myc(分别为F和G)的(D–G)蛋白和mRNA表达。静止T细胞的mRNA水平设置为1。误差线表示与三份样品平均值的标准偏差。数据是两个独立实验的代表。
谷氨酰胺分解代谢不仅与不同的生物合成途径紧密耦合,还生成补体底物α-酮戊二酸(α-KG),可通过TCA循环代谢生成柠檬酸或丙酮酸(“谷氨酰胺分解”)(Newsholme等人,1985年). 谷氨酰胺(Gln)转化为谷氨酸(Glu)受谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1(Gfpt1)、氨甲酰-磷酸合成酶(CAD)、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(Ppat)和谷氨酰胺酶2(Gls2)控制,而谷氨酸(Glu)转化为α-KG受谷氨酸脱氢酶1(Glud1)控制,谷氨酸草酰乙酸转氨酶(Got)和鸟氨酸氨基转移酶(Oat)。与α-KG是TCA循环的补体底物的观点一致,TCA循环中的代谢酶包括异柠檬酸脱氢酶-3(IDH3)、苹果酸脱氢酶(MDH)、琥珀酸脱氢酶复合物亚基C(SDHc)和苹果酸酶2(ME2)也上调(,S2A和S2B).
我们将活性小鼠T淋巴细胞的代谢基因表达数据与最近发表的活性人类T淋巴细胞微阵列研究的代谢基因表达数据进行了比较(Wang等人,2008). 斯皮尔曼等级相关系数表明,这两个数据集之间的显著相关性表明,活化的人类T淋巴细胞中的代谢基因也受到类似的调节(图S2C). 综上所述,这些结果与我们的代谢通量数据一致,并表明代谢基因转录的全局调控与激活诱导的T细胞代谢重编程有关。
激活诱导的T细胞代谢重编程需要Myc,但不需要HIF1α
使用生物信息学方法(Roider等人,2009年),可能参与激活诱导的T细胞代谢重编程的转录因子根据特定转录因子与输入基因启动子结合的可能性进行排序(和表S3). 前十名候选人()选择缺氧诱导因子1、α亚单位(HIF1α)和骨髓细胞瘤癌基因(Myc)进行进一步研究。HIF1α和Myc最近被认为可以调节转化细胞的细胞代谢(Dang和Semenza,1999年;Gordan等人,2007年)T细胞激活后,在转录和蛋白质水平上高度诱导(). 这两种转录因子的诱导先于大多数被检测的代谢基因的诱导()糖酵解和谷氨酰胺水解的上调(). 相反,内源性Myc拮抗剂Mad的未受干扰表达表明,这可能对观察到的变化没有帮助(图S2D).
早期研究表明ERK、AKT和mTOR介导的信号通路参与调节T细胞代谢(Carr等人,2011年;Frauworth等人,2002年;Pearce等人,2009年). 接下来,我们应用了一组针对不同激活诱导信号通路的强效化学抑制剂,并跟踪Myc和HIF1α的表达。抑制任何这些激酶都会显著降低T细胞激活后Myc和HIF1α的诱导(图S2F)与糖酵解活性降低有关(图S2E). 因此,ERK-、AKT-和mTOR介导的信号通路可能通过调节Myc和HIF1α的表达,至少部分地调节T细胞代谢。
我们建立了一个携带条件HIF1α等位基因的小鼠模型(Hif1a型 flox/flox公司)和三苯氧胺诱导的Cre重组酶(CreERT2)转基因(de Luca等人,2005年;Ryan等人,2000年)急性删除HIF1αflox等位基因。将新鲜分离的T细胞与IL-7一起培养两天,加入或不加入4-羟氨苄酚(4OHT),然后将细胞维持在IL-7中(休息)或用抗CD3和抗CD28激活(活性)(图S3A). 作为对照,仅在含有CreER转基因的T细胞中观察到类似的细胞增殖和糖酵解率,并用载体或4OHT处理(图S3B和C). 在蛋白处观察到HIF1α的有效缺失()和信使核糖核酸()4OHT处理后的水平。然而,T细胞激活后24小时,糖酵解、谷氨酰胺解和FAO不受急性HIF1α缺失的影响(和S3E系列). 虽然两个已知HIF1α靶基因LDHa和HK2的诱导因HIF1α的缺失而中度受损,但其他活化诱导的代谢基因的表达在WT和HIF1α缺陷的T细胞中是相似的(图S3F). 此外,活化相关的细胞增殖(),细胞生长()和激活标记CD25的细胞表面外观(图S3D)在HIF1α缺陷细胞中未受影响,仅在活化后72小时观察到糖酵解轻度受损(图S3G). 因此,在T细胞增殖之前,HIF1α不需要用于激活诱导的代谢重编程,但可能参与在进入细胞周期后最佳维持T细胞糖酵解活性。
激活诱导的代谢重编程不需要HIF1α从RosaCreERT2中分离出(A–B)T细胞/HIF1αflox/flox公司小鼠,用溶媒(WT)或500 nM 4OHT(KO)预处理。通过免疫印迹(A)和qPCR(B)测定活化后指定时间收集的T细胞中HIF1α蛋白和mRNA的水平。静息状态下WT T细胞的mRNA水平设置为1。
(C–D)通过生成三H(H)2O来自[3]-三H] -葡萄糖(C)和14一氧化碳2从[U-14C] -谷氨酰胺(D)。B–D中的误差条表示与三份样品平均值的标准偏差。数据是两个独立实验的代表。
(E) 休息(Rest)、活动WT和KO T细胞(48小时)的细胞增殖被测定为CFSE稀释。
(F) 休息(Rest)、活动WT和KO T细胞(24小时)的细胞大小被确定为正向光散射。
然后我们培育出携带条件Myc等位基因的小鼠(Myc公司 flox/flox公司)和一种他莫昔芬诱导的Cre重组酶(CreERTam)(Badea等人,2003年;de Alboran等人,2001年). 添加4OHT后,在蛋白质处观察到Myc基因的有效缺失()和mRNA()级别。虽然在大多数实验条件下,Myc被认为是T细胞增殖和生长所必需的(Dose等人,2006年;Iritani等人,2002年)一项研究表明,它对细胞增殖至关重要,但对细胞生长无关(特朗普等人,2001年). 我们发现Myc的急性缺失阻断了活化相关的细胞增殖和生长在体外(). 代谢组分析进一步表明,缺乏Myc的T细胞积累的脂质、氨基酸和核苷酸水平显著降低(). 然后我们研究了Myc在调节T细胞增殖和生长中的作用体内对葡萄球菌肠毒素B(SEB)的反应(),作为一种超抗原,参与足够多的幼稚Vβ8+T细胞进行代谢研究(见下文)。与我们的一致在体外结果体内Myc缺失阻断SEB诱导的Vβ8+T细胞增殖和生长(). 我们观察到Myc的急性耗竭,体内,在一周内没有损害动物的健康,与最近的报告一致(Soucek等人,2008年).
Myc是T细胞生长和增殖所必需的(A) 从RosaCreERTam分离的T细胞-Myc公司重量/重量小鼠(WT)或RosaCreERTam-Myc公司flox/flox公司用溶媒(−4OHT)或500 nM 4OHT(+4OHT)预处理小鼠(flox/flox)。在活化后的指定时间通过免疫印迹法测定Myc蛋白水平。
(B) 通过qPCR测定在激活后的指定时间收集的T细胞中的Myc mRNA水平。静息状态下WT T细胞的mRNA水平设置为1。误差线表示与三份样品平均值的标准偏差。数据是两个独立实验的代表。
(C) 活性T细胞(48小时)的细胞增殖被测定为CFSE稀释。
(D) 休息(Rest)和活动T细胞(24小时)的细胞大小通过前向光散射测定。
(E) 指示样品中的细胞内代谢物水平;每种代谢物的值是从三倍的平均值中获得的,并且在静止的WT T细胞中每种代谢物的水平设置为1。热图表示每种代谢物相对水平的log2值,该值按指示的代谢途径分组(见色标)。完整的代谢组学资料见表S6.
(F–H)用于SEB超抗原激发模型的实验程序(F)。Myc公司 flox/flox公司小鼠(WT)或RosaCreERTam-Myc公司flox/flox公司给小鼠(KO)注射三苯氧胺(静脉注射1mg/只,持续三天),然后注射SEB(静脉注射100μg/只)。注射SEB后2天测定Vβ8+T细胞的百分比(G)和细胞大小(H)。
Myc通过控制包括p27、cyclins和CDK在内的几个基本细胞周期调节因子的表达,直接或间接调节细胞周期进程(Dang等人,2006年;艾尔斯和艾森曼,2008年). 虽然p27的下调和细胞周期蛋白D3的上调基本上没有受到干扰,但在Myc缺陷的T细胞中,细胞周期蛋白A、cdk2、cdk4和cdc25a的诱导受到不同程度的损害(图S4A). RB和Cdc6这两种S相标志物的磷酸化分别被延迟和消除(图S4A). 相反,激活标记CD69和CD25的上调(图S4B)与AKT和ERK的磷酸化一样,Myc缺陷细胞和WT细胞之间具有可比性(图S4C). Myc缺陷细胞中几种细胞因子的表达未受影响或升高(图S4D和E). 因此,在缺乏Myc的T细胞中,TCR和细胞因子介导的一般信号通路基本上是完整的,Myc的急性缺失会消除激活诱导的T细胞生长和增殖,但不会消除T细胞中的其他激活诱导事件。
糖代谢基因的Myc依赖性诱导导致葡萄糖分解代谢
Myc基因的缺失在早期和晚期都显著降低了激活诱导的糖酵解通量(和5安). 与此一致,Myc缺陷T细胞的胞内乳酸低于WT对照细胞(图S5B). 此外,含有杂合子的T细胞中Myc表达的部分减少Myc公司 絮状物/重量等位基因导致激活诱导的糖酵解中度受损(图S5C和D). 这表明,T细胞激活后糖酵解的最大增加需要Myc的最大表达。激活Myc缺陷T细胞后,几种糖酵解酶和转运体的上调受到不同程度的损害(). 此外,Myc缺乏导致HK2和丙酮酸激酶肌肉亚型2(PKM2)在蛋白质水平的减少(图S5F). 最后,如上所述,我们测试了Myc在调节T细胞代谢以应对SEB方面的相关性(). 与我们的一致在体外结果,Myc是诱导SEB反应性T细胞糖酵解活性增强和代谢基因表达所必需的体内().
Myc驱动转录程序,在T细胞激活时调节葡萄糖分解代谢(A) 糖酵解通量由三H(H)2O来自[3]-三H] -葡萄糖。
(B) 代谢基因的qPCR分析。静息状态下WT T细胞的mRNA水平设置为1。热图表示相对mRNA表达水平的log2值(见色标)。数值和标准偏差见表S5数据代表两个独立实验,一式三份。
(C–D)天然CD4+Vβ8+从未接种SEB的小鼠中分离T细胞(R);WT和急性Myc缺失CD4+Vβ8+SEB免疫两天后从小鼠中分离T细胞(KO)(). 糖酵解(C)和mRNA表达(D和表S5)在指定的组中,由三H(H)2O来自[3]-三H] -葡萄糖和qPCR。
(E–F)PPP通量(E)和通过TCA循环(F)的丙酮酸氧化通过生成14一氧化碳2来自[1-14C] -葡萄糖和来自[2-14C] -分别为丙酮酸。
由于糖酵解与其他代谢途径(如PPP、TCA循环和FAO)相互关联,我们研究了通过这些途径的代谢流量。Myc的急性缺失通过PPP适度抑制活化诱导的代谢活性上调()激活Myc缺陷T细胞后,PPP中两种关键代谢酶Tkt和G6PDx的诱导作用受到影响(图S5E). 相反,丙酮酸代谢通量、FAO通量和耗氧率不受Myc缺失的影响(,S5G和S5H).
Myc-依赖性谷氨酰胺分解与mTOR通路的交叉对话
Myc基因的缺失深度抑制了活性T细胞谷氨酰胺氧化的上调(). 最近对人类细胞系的研究表明,Myc的强制表达通过转录和转录后机制调节速率限制性谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶1(Gls1)(Gao等人,2009年;Wise等人,2008年)p53调节谷氨酰胺酶2(Gls2)的转录(胡等,2010;Suzuki等人,2010年). 我们观察到Gls1的mRNA和蛋白水平在T细胞激活时均未升高(和S2B型)而谷氨酰胺分解代谢途径中谷氨酰胺酶2(Gls2)和其他代谢基因的转录和翻译是以Myc依赖的方式诱导的在体外和体内(,和S5F系列). 然而,我们发现p53在T细胞激活时对Gls2的诱导和谷氨酸分解是不必要的().
Myc驱动一个将谷氨酰胺分解与生物合成途径耦合的转录程序(A) 谷氨酰胺分解速率,由14一氧化碳2从[U-14C] -谷氨酰胺。数据是两个独立实验的代表。
(B) 代谢基因的qPCR分析。静息状态下WT T细胞的mRNA水平设置为1。热图表示相对mRNA表达水平的log2值(见色标)。数值和标准偏差见表S5数据代表两个独立的实验。
(C) 通过流式细胞术测定CD98在细胞表面的表达。
(D) 免疫印迹法检测Gls2和p53蛋白水平。星号表示一个非特异性带。
(E) 谷氨酰胺分解通量由14一氧化碳2从[U-14C] -谷氨酰胺。
(F) 用溶媒(Ctr)、1mM DFMO(Inh)或1mM DFMO+多胺混合物(Inh/PAs)处理的活性T细胞(48小时)的细胞增殖,通过CFSE稀释测定。多胺混合物的成分和浓度见表S7.
(G) 在无谷氨酰胺培养基(Q−)、补充2μMα-KG的无谷氨酰胺的培养基(Q-/αKG)、添加2μMγ-KG、100μM次黄嘌呤和16μM胸腺嘧啶核苷(Q-/αKG/HT)的无谷氨酸的培养基中活化72小时后收集T细胞或在补充有2μMα-KG和多胺混合物(Q−/αKG/PAs)的无谷氨酰胺培养基中。多胺混合物的成分和浓度见表S7流式细胞仪检测细胞增殖为CFSE稀释。
谷氨酰胺饥饿或Myc缺失都足以消除激活诱导的T细胞生长(图S1D、4D和H). 谷氨酰胺流量可能通过mTOR途径调节细胞生长(Nicklin等人,2009年)mTOR激活的谷氨酰胺依赖性调节可能部分解释了Myc对T细胞生长的调节。虽然上游组分(mTOR和AMPK)的磷酸化动力学不受影响,但Myc的急性缺失损害了mTOR通路下游效应器的激活,这表现在Myc缺陷细胞中P70K磷酸化的减少以及4E-BP和S6的磷酸化和蛋白水平的降低(图S6A). 与谷氨酰胺反转运蛋白CD98(Slc3a2/Slc7a5的异二聚体)在调节mTOR途径中的不可或缺的作用一致(Nicklin等人,2009年)激活后,Myc缺陷T细胞中Slc3a2/Slc7a5的转录和CD98的细胞表面外观均受损在体外和体内(,S6C和5D). 此外,谷氨酰胺饥饿在很大程度上再现了在Myc缺陷细胞中观察到的mTOR途径下游效应物激活的损伤(图S6B). 这些结果证明了Myc在激活后谷氨酸分解上调中的重要作用,并暗示通过氨基酸摄取与mTOR通路的串扰可能参与Myc对T细胞生长的依赖性调节。
Myc驱动的谷氨酰胺分解代谢与多种生物合成途径耦合
Myc驱动Gfpt1、Cad、Ppat和Oat的表达(和)它不仅是谷氨酰胺水解所必需的,而且还控制己糖胺、嘧啶、嘌呤和多胺生物合成途径中的关键步骤(,左侧面板)。虽然由于技术限制,我们未能检测到己糖生物合成途径中的任何中间代谢物,但多胺和核苷酸合成途径中中间代谢品的水平在Myc缺陷细胞中较低(图S6D、S6E和表S6). 与之前的研究一致(Bowlin等人,1987年)二氟甲基鸟氨酸(DFMO)是鸟氨酸脱羧酶(ODC)和多胺生物合成的有效抑制剂,可抑制活化诱导的T细胞增殖在体外和体内(和)在DFMO存在的情况下,添加外源性多胺可完全恢复增殖在体外().
单独添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)或多胺(PA)不足以在缺乏谷氨酰胺的情况下允许细胞增殖(图S7A). 由于α-KG是在缺乏谷氨酰胺的情况下保持细胞活力和最小细胞增殖所必需的(Wise等人,2008年),在缺乏谷氨酰胺的情况下,仅添加α-KG就足以驱动一次细胞分裂。然而,α-KG与HT或PA的结合促进了额外的细胞分裂(,图S7B). 与Myc在调节细胞增殖中的直接作用一致(Dang等人,2006年;艾尔斯和艾森曼,2008年)在Myc缺乏的T细胞中,添加α-KG和HT和PA未能促进细胞增殖(图S7C). 综上所述,我们的研究结果表明,菌体驱动的谷氨酰胺分解可协调多种生物合成途径,以支持活化诱导的细胞增殖和生长。
连接谷氨酰胺分解、鸟氨酸和多胺生物合成的Myc依赖性代谢途径
虽然鸟氨酸主要由精氨酸通过精氨酸酶的作用产生,作为尿素循环的一部分(莫里斯,2004),激活后未诱导包括精氨酸酶在内的尿素循环酶(图S7D)在缺乏精氨酸酶I的T细胞中也没有观察到任何增殖缺陷()胸腺中的主要亚型(Yu等人,2003年). 这些结果表明精氨酸不是T细胞鸟氨酸的唯一前体。以前对牛内皮细胞和肠上皮细胞的研究表明,可能存在一种非标准代谢途径,它可以从谷氨酰胺中生成鸟氨酸(Wu等人,2000年;Wu和Morris,1998年). 这个假定的途径由两个关键步骤组成:醛脱氢酶18家族成员A1(Aldh18a1)将谷氨酸转化为(S)-1-吡咯烷-5-羧酸盐(P-5-C),然后OAT将P-5-C转化为鸟氨酸(). 或者,脯氨酸也被认为是鸟氨酸的来源,通过涉及脯氨酸脱氢酶(Prodh)和OAT的两步反应(Phang等人,2008年). 有趣的是,连接谷氨酰胺和脯氨酸与鸟氨酸合成的代谢酶Aldh18A1、Prodh和OAT在T细胞激活后以Myc依赖的方式被诱导(和S5F系列)代谢酶ODC、精氨酸合成酶(SRM)和精胺合酶(SMS)将鸟氨酸转化为多胺(). 因此,我们遵循U-13C-同位素标记的谷氨酰胺(U-13C-谷氨酰胺)通量,并观察到13C转化为鸟氨酸(U)的所有五个碳-13C-鸟氨酸),占活性T细胞鸟氨酸总量的30%,但在静止T细胞中仅占1%(图S7E). 最后,Myc基因的缺失部分取消了谷氨酰胺衍生碳在鸟氨酸和腐胺中的结合(). 综上所述,我们的结果表明,活化T细胞中存在一条依赖于Myc的非标准鸟氨酸生物合成途径,将谷氨酰胺水解与鸟氨酸和多胺生物合成偶联().
菌体驱动的谷氨酰胺水解通过T细胞活化促进多胺生物合成(A) 激活48小时后收集精氨酸酶I WT和KO T细胞(分别为Act/WT和Act/KO)。通过CFSE稀释测定细胞增殖。
(B) 通过qPCR分析WT和精氨酸酶I KO活性T细胞的精氨酸酶I mRNA表达。
(C) (上面板)与多胺生物合成途径相关的潜在代谢步骤,代谢基因以蓝色突出显示。(下图)在激活后的指定时间收集WT和Myc KO T细胞,并进行代谢基因的qPCR分析。静止T细胞的mRNA水平设置为1。热图表示相对mRNA表达水平的log2值(见色标)。数值和标准偏差见表S5数据代表两个独立实验,一式三份。
(D) T细胞在含有U的培养基中培养-13C-谷氨酰胺,并在活化后的指定时间收集。细胞内鸟氨酸和腐胺(包括U)的水平-13C-和12C-标记形式通过质谱测定。
(E) T细胞激活后Myc依赖性代谢重编程,上调代谢途径以红色突出显示,下调代谢途径以黑色突出显示,Myc依赖型代谢基因以蓝色突出显示。
讨论
细胞外信号在控制真核细胞生长、增殖和代谢中起着重要作用。TCR和共刺激物介导的信号驱动T细胞生长和克隆扩张,并协调重新编程代谢级联以满足随后的生物能量和生物合成需求(Fox等人,2005年;克劳斯等人,2001年). 虽然转化细胞系中Myc的异位过度表达协同驱动细胞增殖和增殖相关的代谢活动,包括葡萄糖和谷氨酰胺的分解代谢(Dang和Semenza,1999年;Gordan等人,2007年),在生理刺激下内源性Myc的诱导是否发挥类似的作用尚不清楚。我们的研究表明,T细胞的激活通过TCA循环将代谢程序从脂肪酸β氧化和丙酮酸氧化快速转换为有氧糖酵解、PPP和谷氨酸解。这种代谢重编程与代谢转录组的整体变化有关,这是在激活内源性Myc和HIF1α后诱导的。基于这些转录因子的急性基因消融的影响,我们确定Myc是T细胞中的一种关键代谢重编程因子。我们的研究揭示了代谢资源、途径和中间体的复杂利用,这些代谢资源、通路和中间体使T细胞的生长和增殖对谷氨酰胺分解的严格依赖性合理化,并表明了一种新的谷氨酰胺分解和Myc依赖性从头开始多胺生物合成途径对T细胞增殖至关重要。虽然先前的研究清楚地表明,Myc主要通过细胞周期调节器的转录控制直接调节T细胞增殖(Dose等人,2006年;Iritani等人,2002年)我们的研究表明,Myc是T细胞活化诱导的细胞生长、增殖和代谢重编程的几个方面的重要协调器。
T细胞活化诱导的糖酵解和谷氨酰胺酶解使人想起肿瘤细胞的代谢变化,其中有氧糖酵化(Warburg效应)和谷氨酰胺蛋白酶解都是由异常的致癌信号驱动的(Dang和Semenza,1999年;Vander Heiden等人,2009年). 值得注意的是,Myc的异位过度表达不仅改变了几个糖酵解基因的转录,而且通过调节PKM转录的选择性剪接,优先将PKM1的表达转换为PKM2(Dang和Semenza,1999年;David等人,2010年). 虽然参与糖酵解几乎每个步骤(包括PKM2)的代谢酶和转运体的转录在T细胞激活时以Myc依赖的方式诱导,但活性T细胞是否通过选择性剪接优先表达PKM2仍有待确定。相反,肿瘤细胞系和活化T细胞中与谷氨酰胺分解相关的代谢程序略有不同。在肿瘤细胞中,Myc通过SLC3a2、SLC5A1和SLC7A1的转录控制谷氨酰胺的摄取,并通过GLS1的转录和翻译后调节调节谷氨酰胺向谷氨酸的转化(Gao等人,2009年;Wise等人,2008年). 然而,活性T细胞中的相应步骤由Myc介导的SLC32a1、SLC32a和GLS2的转录控制。尽管最近的研究表明,在人类肿瘤细胞系中诱导GLS2需要肿瘤抑制因子p53(Hu等人,2010年;铃木等人,2010年),我们发现小鼠T细胞中GLS2的上调是不依赖于p53的。尽管涉及的调节机制略有不同,但肿瘤相关和T细胞活化相关代谢程序的相似性表明,在病理和生理情况下,需要进行一般的代谢转换来支持细胞生长和增殖。
谷氨酰胺长期以来被认为是增殖细胞不可或缺的营养素(科瓦切维奇和麦吉文,1983年). 多克隆有丝分裂原刺激后大鼠淋巴细胞对谷氨酰胺的利用增强是核苷酸生物合成的前体物质(Newsholme等人,1985年). 胶质母细胞瘤细胞系的代谢通量分析进一步揭示,谷氨酰胺衍生的氮和碳的大部分被并入氨基酸和乳酸中,其中一部分是作为代谢副产物分泌的(DeBerardinis等人,2007年). 这些发现表明,谷氨酰胺是多种生物合成前体的重要氮和碳供体。支持这一观点,我们发现T细胞的激活触发了依赖Myc的谷氨酰胺分解诱导,这不仅导致TCA循环中α-KG的产生,而且还与核苷酸生物合成耦合。此外,Myc缺陷激活的T细胞中细胞内鸟氨酸和多胺的耗竭意味着激活后存在非经典的、Myc依赖的多胺生物合成途径。
早期研究表明,转化细胞系中Myc的过度表达可诱导ODC的表达(贝洛·费尔南德斯等人,1993年). 虽然ODC的蛋白质水平没有升高,但鸟氨酸下游所有三种代谢酶的mRNA在T细胞激活后以Myc依赖的方式诱导,导致多胺合成大量增加。Aldh18a1、Prodh和OAT的Myc依赖性诱导进一步表明,鸟氨酸上游存在一条新的Myc-依赖性代谢途径,将谷氨酰胺和可能的脯氨酸连接到鸟氨酸。与此一致,Myc依赖于13T细胞活化后,C-标记的谷氨酰胺碳转化为鸟氨酸表明,活化的T细胞可能获得一种替代的Myc依赖性途径,将谷氨酰胺分解与多胺生物合成偶联,以满足增殖所需的显著增加的多胺需求。我们的结果表明,Myc-依赖性谷氨酰胺分解代谢不仅通过产生回补底物α-KG来补充TCA循环的中间代谢产物,而且还与Myc-依存性葡萄糖分解代谢相协调,以支持氨基酸、核苷酸和脂质的生物合成。此外,谷氨酰胺分解代谢与对T细胞增殖至关重要的多胺的生物合成密切相关。
实验程序
RNA分离、反转录和qPCR
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离总RNA,并使用随机六聚体引物和M-MLV逆转录酶(Invitrogen)逆转录。使用TaqMan低密度阵列(4367786,ABI)进行细胞因子的实时qPCR。利用聚类法将静止和活动T细胞中细胞因子基因表达的比较显示为热图(艾森和布朗,1999年)和TreeView(Eisen等人,1998年). 使用应用生物系统7900实时PCR系统对其他基因进行SYBR绿色定量RT-PCR。每个实验条件下的样品一式三份,并归一化为β-2-微球蛋白,以确定相对表达水平。引物序列来自PrimerBank(Spandidos等人,2010年)Gls1和Gls2除外,它们是手动设计的。引物序列列在表S7使用Spotfire将所选代谢基因在静止和活动T细胞中的表达进行比较,以热图形式显示。
代谢分析
通过测量[3-三H] -葡萄糖。脂肪酸β-氧化通量是通过测量[9,10-三H] -棕榈酸。谷氨酰胺氧化通量由14一氧化碳2从[U释放-14C] -谷氨酰胺。丙酮酸氧化通量由14一氧化碳2从[2]发布-14C] -丙酮酸。如前所述,通过戊糖磷酸途径(PPP)测定葡萄糖氧化通量,并在补充信息。使用Seahorse XF24分析仪测量完整T细胞的呼吸。代谢组分析由Metabolon公司(北卡罗来纳州达勒姆)进行。代谢流量分析13LC-MS法测定活性T细胞中的C-谷氨酰胺。
统计分析
采用Student t检验计算P值。P值<0.05被认为是显著的。