哺乳动物谷氨酸脱氢酶的结构及其变构调控

摘要

谷氨酸脱氢酶（GDH）存在于所有生物体中，并使用NAD催化L-谷氨酸可逆氧化脱氨基生成2-酮戊二酸⁺和/或NADP⁺作为辅酶[1]. 在几乎所有的生物体中，GDH是一种同源六聚体酶，由亚基组成，亚基在动物中包含约500个残基，在其他王国中包含约450个残基。虽然酶反应的化学细节在各个时代都得到了严格保存，但酶的代谢作用却没有。最引人注目的事实是，来自动物源的GDH由大量代谢物进行变构调节，而在其他王国中主要在转录水平上进行调节。

在动物体内，ADP和GTP这两种主要的对抗变构调节剂似乎通过流产复合物发挥作用[2–4]. 流产复合物是指在反应的辅酶有机会解离之前，产物被底物取代；氧化脱氨反应中的GDH•谷氨酸•NAD（P）H和GDH•2-酮戊二酸•NAP（P）⁺在还原胺化反应中。一旦这些复合物形成，辅酶就会紧密结合，并通过抑制产物释放来减缓酶的周转。ADP被认为是一种激活剂，至少部分通过破坏流产复合物的稳定性发挥作用[2,三]. 相反，GTP是一种强效抑制剂，被认为通过稳定流产复合物发挥作用[5]. 磷酸能拮抗GTP结合[6]和ADP[7]，但建议与非催化位点中结合的NADH协同作用[6]. 最后，ADP和GTP以对抗方式结合[7]要么是由于空间竞争，要么是由于竞争对败育络合物形成的影响。如下所述，这些调节因子可能通过调节酶的动力学来发挥作用[8,9].

哺乳动物GDH也受其他几种代谢物的调节。亮氨酸和其他一些一羧酸已被证明能激活哺乳动物GDH[10]通过以类似于ADP的方式增加辅酶释放的速率限制步骤[11]. 由于亮氨酸是GDH的弱底物，一个结合位点显然是活性位点，但是否存在第二个变构位点尚不清楚。棕榈酰辅酶A[12]和己烯雌酚[13]是哺乳动物GDH的抑制剂，但对其结合位置一无所知。

动物GDH的结构

细菌的晶体结构[14–16]和哺乳动物形态[8,17]GDH的总结构和催化重要残基的位置在整个进化过程中保持不变。GDH的结构(图1)本质上是两个三聚体的亚基直接叠放在一起，每个亚基至少由三个域组成[8,9,17,18]. 底部结构域与来自其他三聚体的亚基广泛接触。位于该结构域顶部的是具有保守核苷酸结合基序的“NAD结合结构域”。动物GDH有一个长长的突起，即“触角”，位于NAD结合域之上，这在细菌、植物、真菌和绝大多数原生生物中都没有发现。每个亚单位的天线紧邻三聚体中相邻的逆时针邻居。由于这些相互缠绕的触角仅以GDH的形式存在，GDH由许多配体进行变构调节，因此有理由推测它在调节中发挥着重要作用。

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图1

动物GDH的结构。左边是GDH的结构，每个子单元由一个带状图表示，每个子单位由不同的颜色表示。右侧是GDH区域的放大视图，随着催化裂缝的打开和关闭，GDH区域呈现出巨大的构象变化。较深的色调与封闭构象中GDH的结构有关，较浅的色调代表开放构象。箭头突出显示了文本中描述的关键移动点。

牛GDH（bGDH）的第一个晶体结构包括谷氨酸、NADH和GTP[19]. 之前已经获得了GDH的apo形式的初始晶体，但具有超大的单胞，衍射分辨率适中。NADH和谷氨酸在活性部位形成紧密结合的败育复合物。NADH结合到第二个位点并与抑制剂GTP协同作用[6]进一步增加谷氨酸和NADH对活性位点的亲和力[5,6,20]. 因此，综上所述，这些配体的高浓度足以克服GDH在辅酶结合方面表现出的负协同性[21–24]从而使均质和饱和GDH结晶。

GDH动力学

从含有和不含活性位点配体的bGDH的结构来看，可以观察到活性位点裂口的闭合，以及在每个催化循环期间整个六聚体发生的一些大的构象变化[8,9,17,18]. 这些构象变化的详细信息总结于图1在该图中，闭合构象（底物结合）由较深的色调表示。当底物从活性部位裂缝的深凹处释放时（箭头4），整个酶会经历大量的构象变化。释放后，辅酶结合域向上旋转约18°（箭头3）。每个亚基中的天线结构域位于每个三聚体中的NAD结合结构域的逆时针亚基后面。当催化裂缝打开时，天线中每个长上升螺旋的底部似乎以顺时针方向旋转，因为相邻亚单位的枢轴螺旋被推回（箭头5）。此运动通过天线向上平移，使其顺时针旋转洗衣机（箭头1）。当催化口打开时，天线下降回路中的短膨胀螺旋线会卷回更长、更有序的螺旋线，类似于释放延伸弹簧（箭头2）。最后，整个六聚体的核心似乎随着嘴的张开而膨胀（箭头6）。位于彼此顶部的三对亚单位作为一个刚性单位相互远离，从而打开了六聚体核心的空腔。正如在随后的章节中进一步详述的那样，很明显，动物GDH是通过配体相互作用在许多这些柔性点上进行变构控制的。

GTP抑制位点

GTP是反应的一种强有力的变构抑制剂，在天线的底部结合，楔入NAD结合域和枢轴螺旋之间[17,18] (图2A，C). 值得注意的是，该结合位点仅在催化间隙闭合时可用于GTP结合。因此，很可能在GTP与“封闭”构象结合后，使“嘴”更难打开和释放产品。这与GTP通过减缓产物释放并同时增加底物和辅酶的结合亲和力来抑制反应的发现完全一致[5,6,20]. GTP和bGDH之间的绝大多数相互作用涉及到三磷酸部分，其中大多数盐桥是由γ-磷酸盐构成的(图2C). 这解释了为什么在抑制方面，GTP GDP>GMP[2]. 该位点本质上是一个能量传感器，如果线粒体能量水平较高，则GTP（和ATP）水平将升高，GDH将受到抑制。

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图2

激活剂、ADP和抑制剂、GTP、调控位点的位置。A） GTP的结构与GDH的闭合构象结合。GTP由棕色球体表示，辅酶为灰色，谷氨酸为黄色。B） ADP（橙色）在枢轴螺旋下面的催化缝隙后面结合。C） GTP的放大与GDH有关。D） ADP放大与GDH相关。

ADP/第二NADH位点悖论

哺乳动物GDH上最令人困惑的调控位点之一可能是变构激活物ADP结合位点(图2). 动力学和结合分析都证明了每个亚单位存在第二个NADH结合位点[25–27]. 据观察，NADH单独与每六聚体7-8个分子的化学计量比结合。在存在谷氨酸的情况下，NADH结合更紧密，化学计量比增加到每六聚体12[27]. 同样，GTP也增加亲和力和结合化学计量比[6]. 第二个辅酶位点强烈支持NADH而不是NADPH，Kd分别为57μM和700μM。在氧化辅酶的情况下，NAD⁺，还观察到两个结合位点。尽管各种复合物的最新结构已经证明ADP和NAD（H）结合在同一个位点[9,18]，这是ADP与NAD结合竞争首次提出的⁺[28]和NADH[7]. 此外，这些结合研究提供了直接证据，证明GTP和谷氨酸可增强NADH与第二位点的结合，ADP可阻断NAD与谷氨酸的结合⁺和NADH到第二个站点。一般来说，NADPH参与细胞内的合成代谢反应，而NADH对分解代谢过程很重要，因此，当分解代谢还原电位（NADH）较高时，这种调节可能提供一种反馈机制来抑制谷氨酸氧化。

在几乎所有方面，ADP的作用方式与NADH结合该位点的方式相反。在氧化脱氨反应中，ADP在高pH值下激活，但在低pH值下与NAD一起抑制⁺或NADP⁺作为辅酶。在还原胺化反应中，ADP在低pH和低底物浓度下是一种有效的活化剂。在pH 6.0时，高浓度的α-KG和NADH（而非NADPH）会抑制反应。ADP可以减轻这种底物抑制[4]. 因此，当GTP和谷氨酸与NADH协同结合以抑制GDH时，ADP通过降低酶在活性部位对辅酶的亲和力来激活反应。在发生底物抑制的条件下，这会激活酶。然而，在酶未饱和的条件下（例如低底物浓度），这种结合亲和力的丧失会导致抑制。换句话说，在产品释放是速率限制步骤的情况下，ADP极大地促进了催化周转。需要注意的是，在还原胺化反应中，底物（2-酮戊二酸）的抑制作用仅在使用NADH作为辅酶时观察到，这可能是由于NADH（而非NADPH）与第二辅酶位点结合所致。此外，有人认为在这些条件下ADP的激活是由于ADP将NADH从第二变构位点置换[2].

ADP在NAD结合结构域后面结合，并直接在枢轴螺旋下方结合[9]. 如所示图2D，R459位于枢轴螺旋上，与结合ADP的磷酸盐相互作用。有人提出，这种相互作用可能有助于NAD结合域的旋转和产物的释放[9]. 为了测试这一点，将R459（人类GDH中的R463）突变为丙氨酸，这导致ADP活性的丧失。这基本上表明，ADP通过“拉动”NAD结合域的背面来激活反应，以帮助打开活性位点间隙并促进产品释放。更准确地说，ADP可能会降低打开催化裂缝所需的能量。

为了更好地理解ADP如何激活GDH，并将变构调控置于更广泛的背景下，回顾解释同营养变构调控的两个主要模型是有帮助的；协调和顺序模型。协调或对称模型首先由莫诺德、怀曼和Changeux提出[29]. 在这个模型（MWC）中，低聚物中的所有亚基都具有相同的结构，但它们可以以两种不同的状态存在；松弛（R）和紧张（T），松弛状态与配体的结合比紧张状态更紧密。在表现出正协同性的酶中，整个低聚物的结构平衡向R状态转移，底物与酶的亲和力随着底物与活性位点的结合而增加。虽然该模型很容易应用于表现出正合作性的系统，但它无法描述负合作性。协同模型要求底物优先与低亲和力物种（T态）结合，以便随着饱和度的增加降低亲和力。

为了解释负协同性是如何发生的，Koshland、Nemethy和Filmer开发了适用于负协同酶和正协同酶的序列模型[30,31]. 这两种模型的主要区别在于，序列模型并不要求低聚物中的所有亚基采用相同的构象。相反，与亚基结合的底物可以诱导特定构象，这种变化可以通过使低聚物中的其他亚基在热力学上更难或更容易发生相同的转变来影响低聚物。在正协同作用的情况下，当酶饱和时，这些转变变得容易，而在负协同作用的条件下，这些转变更加困难。在GDH的情况下，其对辅酶结合表现出负协同性，底物与第一亚基的结合可能导致催化裂缝闭合，并且由于亚基界面的相互作用，这种构象转变使其更加困难（负协同性）因此，序列模型很有吸引力，因为它既可以应用于正合作系统，也可以应用于负合作系统，而且还允许低聚物中的亚基之间具有更独立和流动的结构。从GDH的结构来看，我们没有看到酶的明显的“R”和“T”状态，即使对于异养变构调节，MWC模型似乎也过于简单。事实上，这些亚单位在GDH的apo形式中都有略微不同的构象。相反，似乎更可能的是，在亚单位界面发生的所有构象变化，都是催化转换所必需的，很可能是通过激活配体（如ADP）而被抑制剂（如GTP）抑制来促进的。

GDH与NADH、NADPH和NAD的络合结构均已确定[18]. 因为NADH（而不是NADPH）被认为是反应的抑制剂，所以它与ADP活化位点结合有点令人惊讶[9]. 腺苷-核糖部分的位置与ADP完全匹配。核糖-烟酰胺部分的电子密度要弱得多，最初是以两种可选构象构建的。然而，NADH这一部分的较强密度表明它指向相邻亚单位之间的界面。根据上述结合研究的预测，NADPH被发现与活性位点结合，而不是与变构位点结合。

北美⁺被发现以与NADH基本相同的方式结合[18]. 根据稳态动力学分析，最初认为NAD⁺与第二个位点结合导致酶的激活[25]即使NADH引起明显抑制。然而，随后的研究表明，这种明显的活化是由于与辅酶的负合作结合所致[32]. 因此，不清楚NAD之间可能存在什么差异（如果有的话）⁺NADH在此位置绑定到GDH。值得注意的是，用ADP类似物修饰ADP位点并不能消除NADH的抑制作用[33]. 也许这是因为尽管AMPSBDB与R459结合，但烟酰胺部分仍与亚基之间的口袋结合。如下文所述，最近对新型GDH抑制剂的研究表明，与亚单位界面和ADP位点本身结合的化合物可能是酶的有效抑制剂。也许核糖-烟酰胺部分也以类似的方式起作用。

ADP激活的生理作用很容易理解；当线粒体的能量水平低而ADP水平高时，谷氨酸的分解代谢有利于能量的产生。然而体内NADH抑制的作用尚不清楚。由于NADH在浓度高于0.2mM时被观察到抑制（例如，参见[34])但仅在1mM NADH时达到约50%的抑制，NADH抑制似乎更可能与GTP调节协同作用；在高还原电位条件下，NADH与GTP共同作用，使GDH保持紧张状态。

在原子水平上，与开放构象和闭合构象结合的配体之间有一个非常明确的界限。NADH仅与活性位点结合。当添加谷氨酸时，催化间隙闭合，NADH能够结合到第二个变构位点。此外，当催化间隙打开时，GTP结合位点崩塌，因此GTP也有利于闭合构象。因此，NADH和GTP之间的协同作用可能是由于这两种配体结合并稳定了闭合构象。这再次支持了这样一种观点，即NADH抑制本身可能没有显著的生理作用，但其主要功能是增强GTP抑制。

变构调节在胰岛素稳态中的作用

几十年来，动物GDH的变构调控与其他王国GDH的差异已为人所知，但变构调控在哺乳动物GDH中的可能作用才刚刚开始显现。人们越来越感兴趣的是，GDH抑制作用的丧失会导致不适当的胰岛素分泌。迄今为止，已有三种GDH介导的高胰岛素血症：因消除GTP抑制的突变导致的高胰岛素症/高氨血症（HHS）、NAD依赖性脱乙酰酶（SIRT4）突变和短链3-羟酰基辅酶A脱氢酶（SCHAD）敲除突变。

卫生与公众服务部

HHS是最早明确将GDH调节与胰岛素和氨稳态联系起来的疾病之一[35]. 总之，胰岛β细胞的线粒体在胰岛素分泌的燃料刺激中起着整合作用。目前的概念是底物的线粒体氧化增加了细胞的磷酸电位，这表现为ATP升高⁴⁻/MgADP公司²⁻比率。ATP浓度升高使质膜K闭合_{列车自动防护系统}通道，导致膜电位去极化。跨膜的电压变化打开电压门控Ca²⁺通道。游离细胞质钙的升高²⁺从而导致胰岛素颗粒胞吐。

GDH和胰岛素调节之间的联系最初是使用亮氨酸的非代谢类似物建立的[36,37]，BCH（β-2-氨基自行车（2.2.1）-庚烷-2-羧酸）。这些研究表明，GDH的激活与谷氨酸分解和胰岛素释放的增加密切相关。此外，还注意到调节GDH的因素也影响胰岛素分泌[38]. 随后，人们推测谷氨酰胺也可以发挥第二信使作用，GDH在其调节中发挥作用[39–41]. 这个体内GDH在葡萄糖稳态中的重要性通过发现一种遗传性低血糖障碍，即HHS综合征，是由GDH的GTP调节缺失引起的[35,42,43]. HHS儿童在高蛋白饮食后对亮氨酸的β细胞反应性和低血糖敏感性增加[44]. 这可能是由于氨基酸的不受控制的分解代谢产生高ATP水平，刺激胰岛素分泌以及高血清铵水平。血清氨水平的升高反映了GDH调节改变的结果，导致谷氨酸氧化产生的氨增加，还可能由于谷氨酸的活化物N-乙酰谷氨酸盐的形成减少而影响氨甲酰磷酸合成酶（CPS）的尿素合成。本质上，这种基因损伤破坏了葡萄糖氧化和氨基酸分解代谢之间的调节联系。在正常人的葡萄糖刺激胰岛素分泌过程中，有人提出，高能磷酸盐的产生抑制GDH并促进谷氨酸转化为谷氨酰胺，这可能单独或联合放大胰岛素的释放[39,40].

虽然HHS患者的葡萄糖和铵水平足以对中枢神经系统造成潜在损害，但最近的研究表明，HHS与儿童期癫痫、学习障碍和癫痫发作之间存在高度相关性[45]. 其中一些病理学与血糖和铵水平无关。考虑到谷氨酸及其衍生物γ-氨基丁酸作为神经递质的重要性，这并不完全令人惊讶。目前对HHS的治疗是通过药物控制胰岛素分泌（例如，二氮杂卓，钾通道激活剂），但这并不能解决血清铵和中枢神经系统疾病。

SIRT4突变

Sirt2或sirtuins（无声交配型信息调节2同源物）存在于所有生物体中，大多数是NAD依赖性蛋白脱乙酰酶。已证明sirtuins与衰老、转录调节、应激反应和凋亡有关。最近的研究表明，线粒体酶SIRT4利用NAD合成ADP-核糖基GDH并抑制其活性[46,47]. 当产生SIRT4基因敲除小鼠时，SIRT4活性的丧失导致GDH的激活，就像由于GTP抑制的丧失导致的HHS一样，氨基酸刺激的胰岛素分泌上调[47]. 此外，他们发现，关于ADP-核糖基化，SIRT4−/−小鼠的GDH活性与热量限制饮食方案的小鼠相似。这表明，正常情况下，β细胞线粒体中的SIRT4通过ADP-核糖基化抑制GDH活性，这种调节在低热量摄入期间被消除。

SCHAD突变

最近发现一种隐性遗传性高胰岛素血症与线粒体脂肪酸β氧化酶（短链3-羟酰基辅酶A脱氢酶，SCHAD）缺陷有关，该酶由HADH公司4q基因[48–50]. 患有这种缺陷的儿童反复出现蛋白质诱导的低血糖[51]可以用K控制_{列车自动防护系统}通道激动剂二氮杂卓。这些患者的血清中也有脂肪酸代谢物的积累，如3-羟基丁酰-肉碱和尿液中的3-羟基戊二酸[48,50]. 与HHS相似，这些患者也有严重的饮食蛋白质敏感性[48]. 然而，SCHAD活性的丧失与HHS中观察到的胰岛素分泌增加不一致，因为预计它会减少ATP生成。此外，线粒体脂肪酸氧化的其他遗传疾病不会导致高胰岛素血症[52].

最近的研究表明，SCHAD通过蛋白质-蛋白质相互作用调节GDH活性，从而解释了这一看似矛盾的现象[53]. 从免疫沉淀和下拉分析来看，GDH和SCHAD之间的相互作用很明显，正如之前所建议的那样[54]. 这种相互作用通过降低GDH对底物的亲和力来抑制GDH活性。研究发现，这种影响仅限于胰腺，可能是因为在该组织中发现了相对较高水平的SCHAD。这也可以解释为什么SCHAD缺陷患者的血清铵水平没有像HHS中观察到的那样伴随升高。这些结果特别有趣，因为它强烈地表明GDH调节的一部分来自于线粒体中作为一个大型多酶复合物的结合。这也表明脂肪酸和氨基酸氧化之间存在联系，并符合下一节讨论的变质体进化的意愿。

GDH变质岩的演化

与其他王国的GDH相比，动物GDH内部含有48个残余插入物，这一点已经知道了一段时间。从动物GDH的结构来看，我们现在知道这个插入物形成了天线区域(图1). 目前尚不清楚的是，天线是什么时候、为什么进化的，以及它是否与动物GDH中复杂的变质岩模式有关。除了动物以外，唯一有这种48个残基插入物的生物是纤毛虫然后使用四膜虫GDH（tGDH）通过动力学和诱变分析进一步分析这种可能的进化“缺失环节”[55]. 与哺乳动物GDH一样，tGDH被ADP激活，并被棕榈酰辅酶A抑制。然而，与细菌GDH一样，tGDH是辅酶特异性的（NAD（H）），不受GTP或亮氨酸的调节。因此，在变构调节方面，tGDH确实是细菌和动物GDH之间的进化“缺失环节”。

结构研究表明，天线不参与ADP或GTP结合[9,17,18]. 然而，当人类GDH上的天线被细菌GDH中发现的短环基因取代时，这种酶失去了GTP、ADP和棕榈酰CoA调节[55]. 当纤毛虫天线被拼接到人类GDH上，这种杂交酶具有哺乳动物变种的全部功能。这表明，天线对于GTP和ADP的变构调节至关重要，而不直接参与它们的结合。从进化的角度来看，这也证明了天线纤毛虫GDH能够传输GTP抑制信号，但GTP调节在纤毛虫.

这表明GDH合金层的演化至少有两个步骤。第一个进化步骤可能是由于细胞器功能的改变，如纤毛虫从其他王国分支出来。在其他真核生物中，所有脂肪酸氧化都发生在过氧化物酶体中[56,57]. 在纤毛虫，过氧化物酶体和线粒体之间共享脂肪酸氧化[58,59]. 最终，所有中长链脂肪氧化都进入了动物的线粒体[60,61]. 这种调节模式表明，当脂肪酸水平足够时，氨基酸的分解代谢被下调。只有当线粒体脂肪酸含量低且能量状态低（即ADP水平高）时，氨基酸才会被分解。因此，变应原进化来协调线粒体代谢日益复杂的情况，而触角特征则需要精确的调控。

进化的第二步是添加亮氨酸和GTP同种异体，因为动物需要对GDH活性进行更复杂和快速的反应调节。在动物体内，GDH在中枢神经系统（CNS）、胰腺、肝脏和肾脏中含量较高。在每个器官中，谷氨酸的水平需要由非常不同的生理信号控制。GDH的这些不同作用很可能是动物GDH与所有其他生物体相比具有如此复杂变构调控的原因。

在胰腺中，当摄入氨基酸（蛋白质）时，GDH需要被激活，以促进胰岛素分泌和对周围组织的适当合成代谢作用。在葡萄糖喂养状态下，三磷酸水平很高，需要抑制GDH，以将氨基酸重定向到谷氨酰胺合成中，从而增加胰岛素释放。在肝脏中，当脂肪酸等其他燃料可用时，GDH需要被抑制，但当多余的氨基酸需要被氧化时，GDH会增加。为此，哺乳动物在纤毛虫GDH包括亮氨酸激活和GTP抑制。选择亮氨酸作为调节剂可能不是偶然的，因为亮氨酸是一种非人类制造的必需氨基酸，也是蛋白质中最丰富的氨基酸之一，因此可以很好地衡量蛋白质的消耗量。同样，GDH对GTP对ATP的显著敏感性也不太可能是偶然的。线粒体中的大多数ATP是由氧化磷酸化产生的，氧化磷酸化由NADH氧化产生的线粒体膜电位驱动。因此，TCA循环一圈产生的ATP分子数量可能在1到29之间变化。相反，TCA循环每转一圈产生一个GTP，线粒体/细胞质交换速度较慢。因此，GTP/GDP比率比ATP/ADP比率更能衡量TCA周期活动。事实上，已经证明线粒体GTP而非ATP调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌[62]. 这也与HHS紊乱相一致，因为如果GDH没有GTP抑制，谷氨酸将以不受控制的方式分解代谢，TCA循环将产生更多GTP，释放更多胰岛素。因此，在GDH中添加GTP和亮氨酸调节使其对葡萄糖和氨基酸分解代谢非常敏感，对胰岛素稳态有明显影响。也可能需要这种复杂的变质岩网络来适应中枢神经系统和尿素生成所需的不同调节。

新型变构抑制剂的高通量筛选

而胰岛素的高分泌可以用二氮杂卓等化合物来控制[63]，这并不能解决血清铵和中枢神经系统疾病。为此，高通量筛选用于寻找新的GDH抑制剂，以控制HHS中失调的GDH[64]. 由于GDH利用常见的底物、谷氨酸和辅酶，NAD（P）⁺为了避免底物和辅酶类似物的选择，必须设计高通量筛。为此，在筛选过程中使用了极高浓度的辅酶和底物。这被证明是有效的，因为没有一种化合物表现出竞争抑制的迹象。

活性最强的化合物(图3)，其中一些具有类似的已知药物活性。第一组活性化合物（ATA和CK2抑制剂）可能通过与几个嘌呤结合位点（ADP、GTP或辅酶结合位点）之一相互作用来抑制GDH。金三羧酸（ATA）是核酸酶的抑制剂[65]和拓扑异构酶[66]并被证明能抑制蛋白质与核酸的相互作用[67]. CK2抑制剂是酪蛋白激酶-2的一种细胞渗透性和高选择性ATP/GTP竞争性抑制剂[68].

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图3

通过高通量筛选确定的一些新变构抑制剂。

第二组活性化合物（BSB和BH3I-2）通过与蛋白质界面结合作用于其靶点。BSB能够渗透活细胞，穿过血脑屏障，并与阿尔茨海默病相关的细胞内淀粉样肽结合[69]. 此外，BSB被证明可以抑制一种患有ED的传染性海绵状脑病的细胞模型₅₀约1.4μM[70]. BH3I-2抑制BH3结构域和Bcl-xL之间的相互作用[71]Ki为4–6μM。很容易推测，这些化合物可能会干扰与催化转换相关的大畴运动。

有趣的是，许多GDH抑制剂对与钙结合和摄取相关的系统也有活性。舒辛地尔是一种钙通道阻滞剂[72]也可以抑制caspase-3[73]. 钙咪唑啉是一种钙调素拮抗剂，具有多种活性，包括抑制钙通道[74]和钙依赖性激酶[75].

其余化合物具有广泛的药物活性，但都是多环芳烃。Metergoline是一种非选择性5-羟色胺受体拮抗剂，已知对5HT1A、5HT1D和5HT2C受体有影响[76,77]. 己烯雌酚是一种具有雌激素性质的合成非甾体物质[78]用于治疗前列腺癌。六氯酚和非常相似的双硫醇都具有一般杀菌和杀菌活性，但其确切作用机制尚不清楚。双硫醇和六氯酚是小型疏水性化合物，类似于先前确定的抑制剂己烯雌酚[13]. 与较大的化合物一样，这些化合物至少有两个芳香环。最后，儿茶素是多酚类化合物，由于其抗氧化活性，在溶液中相对不稳定。然而，由于ECGC和ECG（而非EC和EGC）抑制GDH，儿茶素抑制与抗氧化活性无关。

药物/GDH复合物的结构

从先导化合物的高度不同的化学性质来看，似乎很有可能不同种类的先导化合物与GDH上的不同变构位点结合。各种GDH药物复合物的原子结构不仅为阐明这些新的变构位点如何抑制GDH活性提供了一种手段，而且对进一步的药物设计也很有价值。

六氯酚（HCP）与GDH结合的结构

在GDH-HCP复合物中，六个HCP分子在六聚体的内腔中形成一个环(图4B、D). HCP和GDH之间的大多数相互作用是疏水性的，但也存在芳香族堆积相互作用的几乎“链节”。HCP以两个方向结合。在第一种情况下，HCP环大约与对角相邻亚基的两个Y190侧链重叠。HCP在另一个结合方向上与M150、I187、Y190和T186和K154的亚甲基侧链原子发生疏水相互作用。此外，HCP分子的芳香环在此环构象中相互叠加。应该注意的是，随着药物浓度的增加，HCP的作用具有明显的正协同效应[64]. 可能正的协同作用是由于通过增加药物的亲和力或增加其抑制作用而形成这种“链环”。

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图4

GW5074/双硫醇和HCP的结合位点。A） GDH与HCP络合的带状图。HCP在六聚体的最内层核心内结合成环状。B） GW5074和双硫醇结合到GDH核心和外部中间的同一位置，与HCP结合到最里面的核心。

生物硫酚和GW5074复合结构

比特硫醇和GW5074与HCP不绑定到同一站点(图4B、C). 当HCP与内核结合时，这两种药物在内核和六聚体外部的中间结合。这与HCP的结合几何形状形成对比，其中内腔主要通过天线结构与外部溶剂隔开。两个药物分子形成成对，由六聚体中的两个折叠轴相连。这两种药物的结合环境基本相同。谷氨酸结合结构域的残基138–155形成一个α螺旋，使对角亚基之间的大部分接触，并在催化间隙闭合时紧密相连(图1). 这两种药物相互叠加，并与疏水残基以及残基K143、R146、R147和M150的极性和带电侧链的脂肪族部分相互作用(图4C). 因此，这些药物似乎直接结合在口腔闭合时压迫的区域。

一种极端嗜热细菌对GDH的一些最新结构结果，嗜热Thermus thermophilus，提示双硫醇/GW5074结合位点可能参与亮氨酸变构活化[79]. GDH有两种形式嗜热杆菌GdhA和GdhB，可以形成GdhA/GdhB异构化物的各种组合。GdhA催化无效，在GdhB催化反应时可能起调节作用。与非动物来源的GDH不同，嗜热杆菌GDH被亮氨酸激活。这是特别不寻常的，因为即使是有天线的四膜虫的GDH也不受亮氨酸的调节[55]. 从GdhB与谷氨酸和GdhA的络合结构来看₂/GdhB公司₄Tomita等人发现，这些氨基酸与亮氨酸复合后，也会在紧邻双硫醇/GW5074位点的亚基界面结合。这种可能的变构亮氨酸活化位点的位置得到了消除亮氨酸活化的接触残基突变的支持。该位点与动物GDH中亮氨酸活化之间的联系尚需确认，但原因尚不清楚嗜热杆菌需要亮氨酸调节，而其他细菌则不需要。

与GDH结合的ECG结构

EGCG/ECG与前三种化合物有很大不同(图5). 这些多酚具有极强的亲水性，ECG与GDH的相互作用以极性相互作用为主，并与ADP位点结合[80]. 虽然其他抑制剂能够以闭合构象结合GDH，但ECG似乎已将结构平衡推向开放构象，尽管存在高浓度的Glu和NADPH。事实上，即使晶体浸泡在非常高浓度的ECG中，也从未观察到ECG在闭合构象中与GDH结合。这与ADP/GDH复合物结晶时观察到的情况相同[9].

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图5

ECG/EGCG结合位点的位置。A） 结合ECG分子的六倍平均电子密度。B） ECG与GDH结合的结构，突出显示接触残基。

我们之前的研究表明，枢轴螺旋上的单一突变（R463A）在不影响ADP结合的情况下消除ADP激活（根据TNP-ADP结合）。由此我们认为ADP可能通过降低打开催化间隙所需的能量来促进酶的转换[9]. ECG/EGCG结合位点的突变研究表明它可能比这更复杂(图6). R90的胍基团与ECG和ADP中的芳香环堆叠在一起。由于R90S突变基本上消除了多酚抑制和ADP激活，因此这种相互作用可能对这两种调节器都至关重要。然而，这种突变对GTP抑制有一定影响，即使R90距离GTP位点相当远。这可能是因为R90氢与GTP结合位点正下方相邻亚单位中的环结合。D123位于枢轴螺旋和氢键下方，ADP上有核糖环，ECG上有酚基。从这个位置来看，D123A突变对GTP抑制没有影响，但对多酚抑制有影响，这并不奇怪。然而，令人惊讶的是，这种突变实际上强化了ADP的激活，而没有显著影响其Kact。这可能是由于D123和R463之间的相互作用。这两条侧链形成盐桥，D123可以屏蔽R463上的部分电荷。通过去除D123，R463与ADP上的β-磷酸盐的相互作用可能会加强，从而提高ADP打开催化缝隙的能力。这与R463A突变基本相反，R463A突变通过消除R463和ADP之间的电荷相互作用来消除ADP激活[9]. S397位于天线的底部，S397I突变在消除GTP和ADP调节的同时，极大地破坏了酶的稳定性。这可能只是由于天线区域的显著灵敏度，例如移除天线也消除了GTP和ADP激活[55].

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图6

ECG/EGCG结合突变对EGCG抑制（A）、ECG抑制（B）、GTP抑制（C）和ADP激活（D）的影响。

EGCG/EGC通过结合ADP位点抑制GDH活性，这一事实对ADP激活机制提出了许多问题。在产品释放不是速率限制步骤的条件下（例如低底物或辅酶浓度），ADP抑制反应。相反，ECG/EGCG在所有条件下都会抑制[81]. 造成这种差异的原因至少有两个。第一个模型是ECG/EGCG影响蛋白质的总吉布斯自由能。事实上，ECG/EGCG具有更紧密的结合（根据更低的ED₅₀)可能表明这些化合物降低了蛋白质的吉布斯自由能，从而可能使构象变化更加困难。在这种情况下，低能构象是“开放”态的构象。这意味着可能与负责抑制的ECG/EGCG没有特定的相互作用，而是一系列增加亲和力并降低蛋白质能量状态的相互作用。或者，可能是与D123的相互作用特别干扰了催化裂缝打开和关闭时该区域发生的更微妙的构象变化。后一个模型表明，在没有这些特定相互作用的情况下，提高ADP类似物的结合亲和力不会提高激活效率。从药物治疗到通过增加熵阻止脱衣的普通感冒病毒[82–84]似乎ECG/EGCG主要通过改变酶的整体能量状态而不是特定的相互作用来抑制GDH。

抑制剂ECG/EGCG和激活剂ADP都结合在同一位点，这为基于结构的药物设计提供了一个有趣的起点。ADP的类似物可以与D123类ECG产生相互作用。D123A突变消除了ECG抑制，但实际上改善了ADP激活。因此，D123-EGC相互作用可能部分解释了亲和力较高或抑制。这可能有一个额外的好处，因为它可以修改嘌呤环，使其不与ADP结合蛋白竞争。还可以修改ADP的β-磷酸以更好地模拟ECG。ADP的β-磷酸与R400和R463相互作用，但与D123非常接近。也许在该位置具有极性而非磷酸部分的ADP类似物可以改善结合并使其像ECG一样抑制。相反，根据突变研究，可以通过将活性多酚替换为与关键残基相互作用的极性部分来模拟EGCG。

GDH介导的胰岛素障碍的可能治疗方法

由于ED低₅₀由于其无毒性，主要关注于测定多酚对组织和组织中GDH的影响体内[80]. 由于EC或EGC对GDH没有活性，但具有与ECG和EGCG相同的抗氧化活性，因此这些儿茶素的抗氧化特性与GDH抑制无关[81]. 活性，可能是结合的，取决于第三环结构的存在，没食子酸盐，类黄酮部分。EGCG和ECG变构抑制纯化动物GDH体外带有纳米级ED₅₀EGCG抑制是非竞争性的，类似于GTP抑制，被亮氨酸、BCH和ADP消除。如上所述，天线对于GTP抑制和ADP激活是必要的[55]. 同样，EGCG不抑制GDH的“无触角”形式，因此进一步证明EGCG是变构抑制剂。最重要的是，EGCG抑制HHS-GDH突变体的效果与野生型相同[81]使其成为可能的治疗先导化合物。

下一步是确定EGCG在组织中是否有效。研究表明，GDH通过控制谷氨酰胺水解在亮氨酸刺激的胰岛素分泌（LSIS）中起主要作用[39,40]. 因此，使用融合试验对胰腺β细胞进行EGCG测试[81]. 重要的是，EGCG（而非EGC）阻断了GDH介导的β细胞对胰岛素分泌的刺激，但对葡萄糖刺激期间的胰岛素分泌、葡萄糖氧化或细胞呼吸没有任何影响，已知GDH在胰岛素分泌的调节中不起主要作用。因此，EGCG确实是GDH的特异性抑制剂体外和原位.

如所示图7EGCG对GDH介导的胰岛素分泌的抑制作用也延伸至表达人类GDH突变H454Y在β细胞中功能增强的转基因（TG）小鼠组织。正如预期的那样，谷氨酰胺酶抑制剂DON和EGCG都能够阻断HHS对Gln添加的过度反应。然而，只有EGCG能够将胰岛素释放的基础水平降低到WT组织的水平。除此之外，DON的毒性更大体内比EGCG[85]，表明可以通过直接靶向GDH以无毒的方式治疗HHS。如图所示，EGCG不会降低WT组织中的胰岛素水平。这可能是由于GDH在胰腺中主要处于强直状态，而其变构抑制只有在线粒体能量状态较低时才会缓解。事实上，ADP/EGCG拮抗剂可能会产生变构“释放阀”，当对氨基酸分解代谢的需求足够强烈时，ADP甚至可以消除EGCG抑制。氨基酸代谢研究进一步支持了这一模型，该研究测量了胰腺组织中的氨基酸水平[80]. 在富含葡萄糖的条件下，EGCG对TG或WT细胞中的Glu/Gln水平没有显著影响。这可能是由于GTP和ATP水平升高，GDH活动几乎静止。然而，当Gln为主要碳源时，EGCG显著阻止TG组织中的Glu代谢，而对WT组织没有显著影响。在这种条件下，GDH活性预计会增加以响应线粒体的能量需求。由于TG组织中GDH活性要高得多，因此它对EGCG抑制更敏感。

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图7

EGCG和HCP对表达人GDH HHS型转基因小鼠胰腺组织的影响。A） 谷氨酰胺斜坡刺激转基因小鼠（红色）而非野生型小鼠（黑色）的胰岛素分泌。服用EGCG（绿色）不仅可以阻止这种高反应，还可以降低胰岛素的基础水平（T=0时的水平）。相反，谷氨酰胺酶抑制剂DON（蓝色）阻断了对谷氨酰胺的高反应，但不能改善较高的基础血清胰岛素水平。B） HCP还阻断转基因组织对谷氨酰胺的高反应。在这个图中，钙的脉搏是HCP阻断的β细胞脱颗粒的信号。

虽然EGCG是一种毒性极低的天然产品，但如果要用作治疗剂，它会有几个问题[86]. 它在肠道中吸收不良，被儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）等酶迅速修饰，其抗氧化活性使其在溶液中相对不稳定。为了验证我们在EGCG方面的发现，EGCG是一种更稳定的GDH抑制剂，六氯酚（HCP），在我们之前的HTS研究中已确定[64]，也进行了检查(图7). 正如EGCG所发现的，HCP在阻断TG组织中对Gln的高反应方面非常有效。然而，由于其更大的稳定性和疏水性，近似EC₅₀组织中的HCP与发现的几乎相同体外含纯化GDH[64]. 这证明了稳定性、毒性和生物利用度之间的平衡，最终需要在开发HHS治疗药物时找到平衡。

剩下的问题是，这些先导化合物中的任何一种在口服时是否能够控制TG小鼠的HHS症状。由于其低毒性，EGCG被选为体内应用程序。治疗HHS的最佳药物应该能够阻断氨基酸摄入后的高胰岛素反应，并提高基础血糖水平。如所示图8当在用氨基酸混合物挑战TG小鼠之前口服EGCG时，GDH介导的高胰岛素血症被阻断。此外，在胰岛融合试验中首次观察到(图7)在禁食期间长期给予EGCG可改善TG小鼠的基础血糖水平。总之，这些结果清楚地表明，有可能直接针对HHS中GDH的失调形式体内。这些化合物是否也能提高血清铵水平，并预防HHS引起的中枢神经系统病变，尚待观察。

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图8

口服EGCG对表达人类HHS型GDH的转基因小鼠的影响。A） 当转基因小鼠被给予氨基酸混合物时，它们的超敏胰岛素和血糖水平降低。这在野生型小鼠中未观察到，并且在氨基酸激发之前通过服用EGCG进行阻断。值得注意的是，EGCG对野生型小鼠没有影响，可能表明GDH处于正常的强直状态。B） 当在禁食期间服用EGCG两次时，可以观察到基础血糖水平的改善。

值得注意的是，变构GDH抑制剂可能比单纯治疗HHS有更多的应用。最近的研究证实了我们的观察结果，即EGCG抑制GDH原位可能对治疗胶质母细胞瘤有用[87]. 在这项工作中，EGCG被发现使胶质母细胞瘤细胞对葡萄糖戒断和Akt信号和糖酵解抑制剂敏感。随后，其他人证明EGCG抑制GDH活性可能有助于治疗结节性硬化综合征（TSC）疾病[88]. 几乎所有被剥夺葡萄糖并给予雷帕霉素的TSC1/2−/−细胞都在给予EGCG后死亡。正如预期的那样，如果通过添加2-酮戊二酸盐、丙酮酸盐或氨基氧乙酸盐来规避GDH介导的谷氨酸氧化，EGCG效应就会逆转。这些研究不仅验证了我们的发现，还证明了无毒GDH抑制剂可以作为治疗肿瘤的协同工具。

致谢

脚注

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