生物化学杂志。2011年12月23日；286(51): 44116–44125.
肌钙蛋白相关转录因子-A复合物激活肺成纤维细胞I型胶原表达*
,1 ,2 ,三，4和三，5
拉里·卢辛格
马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系02118
卡桑德拉·帕特诺
马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系02118
芭芭拉·史密斯
马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系02118
马修·德莱恩
马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系02118
马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系02118
5收件人：72 E.Concord St.，K203，Boston，MA 02118.，E-mail:ude.ub@敌意. 1由国家卫生研究院资助T32 HL007969。
2现住址：马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯医学院，邮编：21205。
三两位作者对这项工作的贡献相等。
2011年7月15日收到；2011年10月7日修订
- 补充资料
补充数据
GUID:EBEE74A2-8572-4429-9C82-38C9078EC844
GUID:CFC8482B-E802-4C22-8091-D828A3920923
背景：肌成纤维细胞在瘢痕形成和纤维化过程中导致胶原蛋白过度表达。
结果：心肌素相关转录因子-A（MRTF-A）通过非经典DNA元件上含有Sp1和SRF的转录复合物增强胶原的过度生产。
结论：MRTF-A通过多种分子机制促进肌成纤维细胞分化和胶原生成。
意义：MRTF-A可能是制定阻止纤维化策略的分子靶点。
关键词：胶原蛋白、协同调节转录、纤维化、肌成纤维细胞、Sp1、MRTF-A、血清反应因子（SRF）
摘要
肺纤维化的特征是富含胶原蛋白的细胞外基质过度沉积。胶原蛋白在肺间质内的积聚会导致呼吸功能受损。此外，纤维化肺内的平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞有助于疾病进展。由于胶原和平滑肌细胞α-肌动蛋白在纤维化过程中协同表达，因此证实了肌球蛋白家族的特异性转录调节因子也可能调节肌成纤维细胞中胶原基因的表达。肌球蛋白相关转录因子（MRTFs）通过与CArG盒调节元件（CC（A/T）上的血清反应因子（SRF）相互作用6GG）是肌成纤维细胞分化的重要调节因子。MRTF-A反式激活的I型胶原基因报告子在肺肌成纤维细胞中高达100倍。与对照组相比，使用显性阴性MRTF-A亚型、靶向MRTF-A的shRNA或肺成纤维细胞中MRTF-A-的基因缺失导致功能性MRTF-A的丧失显著干扰了I型胶原的合成。分析COL1A2公司近端启动子显示了一个非经典的CArG盒（CCAAACTTGG），两侧有几个对MRTF-a激活重要的Sp1位点。染色质免疫沉淀实验证实了MRTF-A、SRF和Sp1结合在同一区域的共同定位COL1A2公司发起人。非经典CArG盒或Sp1位点的突变显著干扰了MRTF-A激活COL1A2公司总之，我们的研究结果表明，MRTF-A是肺成纤维细胞胶原合成的一个重要调节器，并表现出对SRF和Sp1功能的依赖性，以增强胶原表达。
关键词：胶原蛋白、协同调节转录、纤维化、肌成纤维细胞、Sp1、MRTF-A、血清反应因子（SRF）
介绍
间质性肺疾病，即特发性肺纤维化，以肺组织进行性和不可逆瘢痕形成为特征(1,2). 纤维化肺组织的病理特征包括过多的细胞外基质（ECM）6沉积，尤其是纤维胶原和肌成纤维细胞扩张，产生成纤维细胞病灶(三,4). 这些病灶中有肌成纤维细胞，它们表达平滑肌细胞α-肌动蛋白（SMA）、波形蛋白和结蛋白，但不表达平滑肌肌球蛋白重链(三–5). 通过胶原蛋白和收缩蛋白的表达，肌成纤维细胞对纤维化疾病的进展起着重要作用(三).
三螺旋I型胶原分子是纤维化中最丰富的上调蛋白(6). I型胶原蛋白由两条由不同基因编码的α1（I）链和一条由α2（I）编码的链组成(COL1A1公司和COL1A2公司). 转录调控COL1A2公司基因为特定DNA位点上启动子结合蛋白之间的组合相互作用提供了信息模型(7). 先前的工作已经确定了纤维化疾病中胶原蛋白转录的几个关键的正调控和负调控因子。Sp1蛋白家族通过富含G/C的位点激活胶原蛋白转录(8,9)而Ets结构域蛋白家族既激活又抑制成纤维细胞中胶原基因的表达(10,11). 这些转录调节剂对促和抗纤维化生长因子和细胞因子作出反应，包括转化生长因子β（TGFβ）、内皮素-1和干扰素-γ（IFNγ）(5,12,13). 例如，转化生长因子β（TGFβ）通过结合到COL1A2公司近端启动子区(14). TGFβ作用于COL1A1公司远端启动子(15)和IFNγ依赖性抑制机制通过CIITA和RFX复合体在转录起始位点附近的近端启动子调节I型胶原的表达(16–18).
虽然胶原蛋白的产生是肌纤维母细胞表型的特征之一，但这些细胞也表达肌动蛋白的收缩亚型SMA。在成纤维细胞和血管平滑肌细胞中，SMA在转录水平上由血清反应因子（SRF）调节，而心肌蛋白家族的共同激活物是SMA的重要调节因子(19,20). 肌球蛋白是一种在心脏和平滑肌谱系中特异表达的有效核转录共激活物，是平滑肌特异性基因表达所必需的(16,21). 心肌相关转录因子MRTF-A（也称MKL1/MAL/BSAC）和MRTF-B（也称为MKL2）是广泛表达的蛋白质，对导致核聚积的肌动蛋白动力学变化作出反应(22). 一旦进入细胞核，MRTF-A就会驱动细胞骨架基因的转录，包括座椅模块组件(23). 肌球蛋白家族成员以同源或异源二聚体的形式与SRF相互作用，并通过保守的CArG盒DNA元件刺激转录(24–26). 应力、机械力和迁移信号集中于Rho-GTPase的激活，导致肌动蛋白细胞骨架聚合成应力纤维，从而允许MRTFs的核移位，从而将肌动蛋白动力学与基因转录联系起来(27–32).
由于胶原和SMA在纤维化过程中协调表达，因此对心肌蛋白家族的特定转录调节因子也可能调节肌成纤维细胞中胶原基因表达的假设进行了验证。虽然我们的研究正在进行中，但最近发现MRTF-A在心肌细胞中调节胶原合成(33). 我们目前的研究结果提供了一个重要的机制进展，证明MRTF-a通过几个调节位点调节成纤维细胞中的胶原蛋白表达。基于这些发现，我们确定被招募到胶原基因的MRTF-A转录因子复合物包括一种新的MRTF-A与Sp1的相互作用，该相互作用增强了胶原的表达。这种胶原蛋白调节复合物与MRTF-A复合物在座椅模块组件发起人。这些研究确定了一种新的机制，MRTF-a可以在肺成纤维细胞中协调胶原基因在SRF非依赖性和依赖性机制中的表达。
实验程序
细胞培养
大鼠肺成纤维细胞（RFL6）和IMR90胎儿人成纤维细胞在添加了10%胎牛血清（亚特兰大生物制品和Hyclone）和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中生长，并在5%的CO中孵育237°C时。对于米特拉霉素A实验，细胞在2×104细胞/厘米2过夜，用50n处理24小时米米特拉霉素A（Sigma）溶于二甲基亚砜。
小鼠原代肺成纤维细胞的分离和培养
用一氧化碳对3-6周大的小鼠实施安乐死2窒息并灌注10 ml PBS。将解剖的肺切成～1 mm的碎片，悬浮在10 ml消化缓冲液中（1×PBS加钙和镁，500单位/ml dispase（BD Biosciences），10μg/ml胶原酶A（Sigma），10微克/毫升DNase I（Qiagen）），37°C下培养1小时，并如前所述进行培养(34). 细胞在含有10%FBS的DMEM中培养，并在第2代和第6代之间使用。波士顿大学医学院动物护理和使用委员会批准了动物实验。
质粒与克隆
−351COL1A2公司, −224COL1A2，和−311COL1A1公司荧光素酶报告载体如前所述(16,17). 通过PCR使用Pfu公司聚合酶后进行DpnI消化。产生的特定突变体包括：CArG1a、CCAAACTTGG→AAGGC公司CTTGG；CArG1b、TTCCAAACTTGG→CCGGG公司CTTGG；CArG2、CCAATTAAG→CGG公司自动变速箱科科斯群岛AAG；Sp1a，CCCTCCCCC→CCCTC美国汽车协会C类；Sp1b、CCTCCC→公认会计准则TCCC公司。MRTF-A、MRTF-B和肌球蛋白的表达载体如前所述(35). 如前所述，使用质粒pcDNA3-SRF和pcDNA3-DN-SRF(36). 使用定点突变将DNA结合域中的SRF氨基酸RVKI突变为LVAG，如前所述，可以消除SRF与CArG盒元件的结合(37).
基因报告分析
使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）或FuGENE 6（Roche Applied Science）转染IMR90和RFL6成纤维细胞，并如前所述测量报告活性(17).果蝇属如前所述，培养D.Mel-2细胞并转染Cellfectin（Invitrogen）(36).
SDS-PAGE和蛋白质印迹
等量的总蛋白（7–10μg）在SDS-PAGE样品缓冲液中稀释并煮沸。蛋白质样品在4–12%Novex SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上运行，并根据标准程序制备蛋白质印迹。使用的抗体包括I型胶原蛋白（Southern Biotech，1:300）、胶原蛋白α1（I）、（Rockland，1:1000）、GAPDH（Santa Cruz Biotechnology，1:200）、SMA（Sigma，1:5000）、MRTF-A（Santa Cruz Bietchnologies，1:250）、Sp1（Millipore，1:500）、γ-微管蛋白（Sigma，1:500。使用柯达440一维即时成像仪对斑点进行成像和定量。
胶原蛋白分泌，Western Blot分析
为了检测分泌到培养基中的胶原蛋白，用PBS清洗培养物两次，并在添加250μ米抗坏血酸钠指定时间。取出培养基并用2 m处理米EDTA和蛋白质用氯仿/甲醇蛋白质沉淀沉淀并溶解在2×样品缓冲液中(38). 细胞层被裂解以进行总蛋白定量。为了使细胞密度正常化，将培养基样品与全细胞裂解液浓度成比例地加载，并在7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行。
总分泌胶原蛋白的Sircol检测
为了量化培养基中的总胶原蛋白，细胞培养物在250μ米抗坏血酸。然后用PBS清洗细胞，并在含有0.4%FBS和250μ米抗坏血酸24小时。去除培养基，收集细胞层总蛋白。将等量的培养基（200μl）与5倍体积的Sircol检测缓冲液（英国Biocolour）培养30分钟，然后在15000×克使沉淀的胶原蛋白颗粒化10分钟。丢弃上清液，将颗粒溶解在300μl的0.2中米KOH作用10分钟。通过读取吸光度来量化Sircol染料(A类520)，并使用从大鼠尾部胶原蛋白标准曲线得出的吸光度值的线性回归计算绝对值，表示为细胞层每μg总蛋白中总胶原蛋白的微克数。
可诱导腺病毒表达系统
通过在TRE-Shuttle2载体（Clontech）中克隆适当的C末端FLAG标记的cDNA，生成了多西环素控制的MRTF-A和显性阴性（DN）MRTF-A腺病毒构建物。将线性化载体连接到Adeno-X DNA后，将连接产物转化为细菌，并将正确的克隆转染到AD293细胞（Stratagene）中。根据制造商的说明，使用Vivapure AdenoPack 100（Vivascience）或Fast-Trap腺病毒纯化试剂盒（Millipore）对重组腺病毒进行扩增和纯化。使用光学粒子单位/ml计算浓缩腺病毒滴度。
定量实时PCR
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞中分离RNA。使用500 ng总mRNA和Superscript III逆转录酶试剂盒（Invitrogen）生成cDNA。如前所述，使用TaqMan和SYBR探针在ABI 7300仪器上对mRNA进行定量(16,34). 为了检测未剪接的mRNA转录物，设计了hnRNA-TaqMan探针来扩增COL1A1公司和COL1A2公司基因（参见补充表1). 这已被证明可以量化新转录的RNA，其结果与核连续试验相似(39). 用1500个Kunitz单位的DNase I处理样品，以消化基因组DNA污染。在没有逆转录酶的情况下进行对照，以测量任何残留DNA污染。
shRNA慢病毒
如前所述进行慢病毒制备和感染(16). 使用靶向MRTF-A的慢病毒使命shRNA构建体（Sigma）。从病毒库存中纯化慢病毒基因组RNA，并使用慢病毒质粒标准曲线的线性回归对LV2扩增子进行定量PCR检测(40). 2000（2×10三)颗粒/细胞用于所有慢病毒感染。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
根据制造商的说明和前面所述，使用ChIP-IT Express试剂盒（Active Motif）进行ChIP实验(41). ChIP分析中使用的抗体包括SRF、Sp1和MRTF-A（Santa Cruz Biotechnology）。使用定量PCR（引物补充表2)并使用IMR90基因组DNA系列稀释液的线性回归进行量化，并从样本值中减去可量化的IgG检测。
统计分析
平均值显著性的统计检验采用了方差分析，采用了Scheffe的事后程序和SPSS 11.0统计软件(第页≤0.05被认为具有统计学意义）。
结果
肌钙蛋白相关转录因子激活I型胶原启动子
肌成纤维细胞协同表达ECM基因，包括胶原蛋白和收缩基因座椅模块组件(42). 由于SRF及其共同激活物在调节收缩基因方面的重要性，这些因素也可以调节胶原蛋白表达的假设得到了验证。这个COL1A2公司启动子有许多正转录因子结合位点，包括Ets位点、Sp1位点和潜在的非经典CArG序列(A类). 为了研究MRTFs对胶原蛋白基因表达的影响，将大鼠肺成纤维细胞（RFL6）培养至～50%的汇合点，并在荧光素酶报告质粒存在下转染等量的MRTF-A、MRTF-B或心肌蛋白表达构建物，该报告质粒含有荧光素素酶的−351/+55COL1A2公司近端启动子。相对于空载体对照，MRTF-A表达刺激胶原启动子活性～100倍(B类). 虽然与MRTF-A相比，MRTF-B的活性要低得多，但它能刺激−351基因报告子～10倍，而心肌病不刺激胶原蛋白启动子活性(B类). 仅转染10 ng MRTF-A质粒，胶原基因报告活性显著增加(C、 COL1A2公司、和D、 COL1A1公司)并显示出对MRTF-a增加量的剂量依赖性反应COL1A2公司超过COL1A1公司.
肌球蛋白相关转录因子能有效激活I型胶原启动子。 A、，I型胶原近端启动子包含几个进化上保守的调控元件，包括Sp1(灰色矩形)，等(白色圆圈)和SMAD（SBE）(黑色椭圆形). 此外，在−326（CCAAACTTGG）和−193（CCAATTTAAG）处鉴定了两个潜在的SRF结合CArG样序列(黑色方块).B、，大鼠肺成纤维细胞（RFL6）与−351共转染COL1A2公司具有心肌蛋白家族表达的启动子（100 ng/well）构建MRTF-A、MRTF-B和具有CMV-β的心肌蛋白（100 ng/well），以使转染效率正常化。归一化的萤光素酶活性以空载体对照的倍数表示。C、，RFL6细胞被转染为A类随着MRTF-A的量的增加。D、，转染−311的RFL6细胞COL1A1公司启动子和增加MRTF-A浓度。E、，RFL6成纤维细胞瞬时转染（100 ng）MRTF-A和COL1A2公司荧光素酶报告子构建。相对于野生型构建物（−351/+55 bp），评估了各种截断的活性。结果代表了三个独立实验，每个实验一式三份。
为了确定介导MRTF-A反式激活的胶原蛋白启动子区域，生成了−351结构的5′截断结构，消除了多个Sp1位点（−260）或Sp1和SMAD元件（SBE）（−253）。在−260和−253缺失结构中，MRTF-A的激活降低到空载体控制的30倍左右(电子)在震级上与COL1A1公司发起人。这些结果表明，在−351到−260增强子样区域和近端启动子区域都存在有效的MRTF-A反应元件。
敲除MRTF-A降低胶原合成
为了确定胶原蛋白mRNA表达和蛋白质生产是否需要MRTF-A，用慢病毒shRNA感染IMR90肌成纤维细胞48小时，以降低MRTF-A的表达。与对照组相比，感染shMRTF-A的细胞MRTF-AmRNA水平下降了80%以上，证实了shMRTF-A的高效敲除(A类). 因为I型胶原蛋白的半衰期很长(43)，我们测量了新合成的hn的水平COL1A2公司通过定量PCR。重要的是，COL1A2公司与非靶向对照处理细胞相比，MRTF-A减少（>50%）后，hnRNA显著减少(A类). 此时，稳态COL1A2公司mRNA减少～20%。此外，与对照组相比，shMRTF-A感染的细胞中SMA转录物减少了约80%。这些结果表明，MRTF-A的丢失可以降低胶原蛋白和SMA mRNA水平。
MRTF-A调节人肺成纤维细胞中I型胶原的合成。 A、，慢病毒编码控制shRNA短暂感染IMR90肺成纤维细胞48小时(shNTC公司,白色条)或靶向MRTF-A的shRNA(shMRTF-A型,黑色条). 通过qRT-PCR测量MRTF-A、hnCOL1A2、COL1A2和SMA的信息水平，并将其归一化为shNTC感染细胞中的信息水平。B、，对感染慢病毒的IMR90细胞制备的总细胞裂解物进行Western blot分析。对裂解物进行I型胶原（Southern Biotech）、α1（I）型胶原（Rockland）、MRTF-A和SMA分析，并将其标准化为GAPDH。C、，用强力霉素感染IMR90细胞(Dox公司)显性阴性MRTF-A的控制性腺病毒载体(Ad-DN-MRTF-A型)如“实验程序”所述48 h。用（+）或不使用强力霉素（−）处理细胞以控制DN-MRTF-A的表达，并对I型胶原（Southern Biotech）、SMA、FLAG进行Western blot分析，并将其归一化为GAPDH。D、，如“实验程序”所述，用多西环素控制的MRTF-A腺病毒载体（Ad-MRTF-A）感染IMR90细胞48小时。用（+）或不用多西环素（−）处理细胞以控制MRTF-A的表达，并对胶原α1（I）（Rockland）、SMA、FLAG、MRTF-A、，并归一化为微管蛋白。结果代表了三个独立的实验。
与mRNA研究结果一致，与shNTC样品相比，经shMRTF-A处理的细胞提取物显示出高效的MRTF-A蛋白敲除(B类). 正如预期的那样，MRTF-A的敲除导致SMA蛋白水平的降低。使用抗体（Southern Biotech）检测I型胶原链(B、 顶部面板). 为了确定α1（I）链是否增加，使用了一种抗体（Rockland），该抗体专门识别前α1（1）链、成熟α1（I）链和I型胶原的异源三聚体(B类,第二个面板) (44). 这种抗体不识别α2（I）链，也不与其他胶原蛋白发生交叉反应。重要的是，与对照组相比，MRTF-A的敲除显著降低了52%的胶原蛋白水平(第页<0.05）基于三个独立实验的Western blot定量。
MRTF-A对肺成纤维细胞胶原表达的影响
为了研究功能性MRTF-A对胶原蛋白合成的影响，研究了全长MRTF-AcDNA和一个缺乏转录激活域的C末端截短cDNA，该转录激活域是一种显性负亚型（DN-MRTF-A）(45)，被克隆到Tet-Off四环素诱导的腺病毒表达系统中。两种MRTF-A结构均设计为包含C端子FLAG标签。将Ad-DN-MRTF-A或Ad-MRTF-A构建物与rtTA腺病毒（Clontech）一起感染IMR90细胞，并使用或不使用250 n米强力霉素调节MRTF-A表达。FLAG表位的细胞免疫染色显示，约75%的MRTF-A感染细胞和>90%的DN-MRTF-A无强力霉素感染细胞的细胞核定位（数据未显示）。这些实验证实了这种感染程序的有效性。48小时后分析细胞的蛋白质表达。DN-MRTF-A表达(C类)结果是35%(第页< 0.05,n个=3）胶原蛋白水平下降，类似于shRNA实验。根据抗FLAG和总MRTF-A Western blotting检测，与使用强力霉素治疗的细胞相比，在缺乏强力霉素的细胞中MRTF-A-过度表达(D类). 异位MRTF-a表达导致胶原蛋白增加(D类)并导致SMA表达增强(D类). 三个独立实验的量化结果表明，MRTF-A的表达使胶原蛋白表达平均增加了40%(第页< 0.05). 综上所述，这些结果表明MRTF-A调节成纤维细胞中胶原的表达。
Sp1位点参与MRTF-A胶原的激活
因为我们的研究表明，MRTF-a介导的胶原蛋白表达中，近端和远端元件都有作用()接下来，我们使用一系列−351胶原蛋白启动子点突变结构来检测Sp1和SMAD结合位点的功能(A类，指定为Sp1c（c），转速1d日，速度1e（电子）和SBE）。Sp1突变c（c）单独的位点、单独的SBE位点或联合使用对钝化MRTF-A活性无效(A类). 有趣的是，所有三个Sp1位点的突变(A类，mSp1c，-d和-e）导致MRTF-A的激活降低约60%，而−253区域所有这些位点的缺失也导致MRTF-A刺激的胶原启动子活性的大部分丧失(A类).
Sp1位点有助于MRTF-A胶原蛋白的反式激活。 A、，IMR90成纤维细胞（30000/孔）转染MRTF-A（40 ng/孔）和一系列COL1A2公司启动子突变和缺失结构（100纳克/孔）（在“实验程序”和A类) (*,第页< 0.05; **,第页< 0.01).B、，IMR90细胞瞬时转染A类带−224COL1A2公司野生型和Sp1突变体构造（在“实验程序”和A类). 正常化荧光素酶活性表示为野生型-224/+55报告者的百分比（*，第页< 0.05). 结果是三个独立实验的平均值。
为了评估近端启动子Sp1位点的重要性，我们又产生了两个突变体。尽管与全长结构相比，将启动子截短至−224区域导致MRTF-A活性降低，但MRTF-A相对于空载体控制（～30倍）能够显著刺激该启动子。两个Sp1位点的突变（Sp1一和Sp1b条,A类)MRTF-A依赖性胶原启动子活性显著受损(B类). 综上所述，这些数据表明MRTF-A转录激活依赖于功能性Sp1-结合位点。
胶原启动子MRTF-A转录因子复合物
虽然MRTF-A没有被证明与DNA直接结合，但一些研究表明它通过CArG调节元件与SRF相关(45,46). 上述结果表明，Sp1是MRTF-A激活胶原蛋白的重要介质。当我们的工作正在进行时，Small的一项研究等。(33)证明SRF可以通过一个位于−326的CArG-like序列（CArG1）与I型胶原启动子结合，该序列与Sp1位点相邻(c（c）,d日、和e（电子）) (A类，CArG1）(33)，并包含以前识别的Ets站点(11). 我们的序列分析确定了第二个CArG-like序列（CArG2）位于COL1A2公司bp−193的启动子（CCAATTTAAG）(A类). 为了测试这些序列的潜在功能，我们将CArG1突变为AAGGC公司CTTGG（CArG1a）或CCGGG公司CTTGG（CArG1b）和CArG2至CGG公司自动变速箱科科斯群岛−351背景下的AAGCOL1A2公司发起人。预计这两种突变都会消除SRF结合(47). 然而，预测CArG1突变也会消除Ets结合以及SRF。为了排除Ets1框元素对MRTF-a活性的贡献，生成并预测CArG1b只会破坏SRF结合。转染结果表明，随着CArG1位点的突变，MRTF-a依赖性激活的大部分丢失，但CArG2位点没有丢失(A类). 我们观察到CArG1突变抑制MRTF-A依赖性基因报告子的激活。
MRTF-A与Sp1和SRF共同占据胶原蛋白启动子。 A、，用MRTF-A（40 ng）和100 ng−351瞬时转染IMR90细胞COL1A2公司包含CArG-like序列突变的启动子结构（在“实验程序”中描述）。正常化荧光素酶活性相对于−351表达COL1A2公司构造。B、，IMR90细胞以2×10的密度接种4/厘米2培养16h后进行交联和染色质分离。每次免疫沉淀反应使用7μg总染色质等分试样。ChIP样品(n个=3）通过定量RT-PCR检测，并使用每个引物组的基因组DNA标准曲线的线性回归进行量化。从ChIP值中减去IgG扩增，并根据COL1A2公司结果是三个独立实验的平均值。
基于上述结果，使用ChIP来确定IMR90细胞中胶原蛋白启动子上Sp1、SRF和MRTF-A转录因子的相对占有率。探针被设计用来放大直接以CArG1元件和相邻的Sp1位点为中心的区域COL1A2公司和COL1A1、，作为绑定的积极控制座椅模块组件检测启动子。抗体特异性通过在COL1A2公司外显子1，预计没有转录因子结合位点。探针位点上的转录因子占有率被量化并表示为每个输入的免疫沉淀DNA的图像，并使用IgG对照减去非特异性免疫沉淀。MRTF-A免疫沉淀显示胶原和座椅模块组件基因启动子(B类). Sp1绑定到COL1A2公司探针区明显高于对照组。有趣的是，SRF蛋白的ChIP显示在座椅模块组件启动子与任一胶原蛋白启动子的比较(第页< 0.01). 这些结果表明，在胶原蛋白启动子处可以检测到Sp1、MRTF-A和SRF。
Sp1对MRTF-A激活胶原蛋白很重要
基于上述ChIP结果，我们接下来想确定Sp1对MRTF-A反式激活潜能的相对贡献。为了确定Sp1对于MRTF-A-依赖性胶原表达的贡献，用抗生素米特拉霉素A处理细胞，它以前被证明通过选择性阻断Sp1家族与GC-rich区域的结合来抑制胶原蛋白的表达(8,48,49). IMR90细胞用50 n米米特拉霉素A作用24小时后，分离总RNA，并通过定量PCR定量相应的cDNA。与载体（DMSO）相比，米特拉霉素治疗导致新合成、异质性和稳态的减少COL1A2公司信使核糖核酸水平(A类). 重要的是，SMA mRNA不受米特拉霉素A治疗的影响。同样，蛋白质分析显示，接触载体的细胞大量产生I型胶原和SMA蛋白(B类). 米特拉霉素A治疗强烈抑制胶原蛋白表达，但对SMA无影响(B类). 为了确定MRTF-A是否可以在没有Sp1活性的情况下激活胶原基因表达，用MRTF-A腺病毒感染细胞，然后用米特拉霉素A处理。正如预期的那样，与对照组相比，MRTF-A的过表达显著增加了胶原蛋白水平(C类). 米特拉霉素显著降低胶原蛋白的表达，而异位MRTF-A不能拯救抑制Sp1结合活性的细胞中的胶原合成。有趣的是，米特拉霉素A处理并没有改变SMA的产生。这些数据表明了MRTF-A激活胶原蛋白的重要机制差异与SMA表达。
Sp1位点对MRTF-A依赖性胶原表达的贡献。 A、，用二甲基亚砜处理IMR90细胞24小时（对照组，白色条)或50 n米米特拉霉素A(米特,黑色条)，抑制转录因子与富含GC的DNA元素的结合。通过定量RT-PCR测定hnCOL1A2、COL1A2和SMA的表达水平(n个= 3). 结果是相对于对照组表达的。B、，在处理为A类I型胶原（Southern Biotech）、MRTF-A和SMA。将印迹归一化为GAPDH。C、，用强力霉素控制的腺病毒MRTF-a载体感染IMR90细胞，并在强力霉素存在（+）或不存在（-）的情况下进行治疗(Dox公司)控制MRTF-A表达或米特拉霉素A调节转录因子结合。Western blot分析I型胶原、SMA、FLAG，并归一化为GAPDH。数据是三个独立实验的代表。
我们的研究表明，MRTF-A通过Sp1-和SRF-依赖机制调节胶原蛋白表达。接下来，我们研究了MRTF-A与Sp1或SRF之间的潜在协同作用。由于哺乳动物细胞中内源性Sp1水平较高，因此在黑腹果蝇细胞（D-Mel.2）(36,50,51). 在这个系统中，可以探索在没有Sp1蛋白的情况下MRTF-A的转录激活。在同等数量的MRTF-A和Sp1或SRF表达结构存在的情况下，分析I型胶原启动子的报告结构的活性。单独使用Sp1而非SRF能够诱导胶原蛋白报告活性，与MRTF-A激活显著相关（设定为100%，A类). MRTF-A和SRF的共转染导致报告活性增加（约4倍(A类). 综上所述，这些结果表明，Sp1对增强MRTF-A对胶原蛋白基因表达的最大刺激作用非常重要。
MRTF-A依赖性胶原启动子活性由SRF和Sp1调节。 A、，不表达Sp1同源物的DMel.2细胞瞬时转染胶原蛋白COL1A2公司和COL1A1公司荧光素酶报告者在同等数量的MRTF-A、Sp1和SRF存在下。萤光素酶值被标准化为MRTF-A激活的百分比。B、，将−351转染IMR90细胞COL1A2公司和MRTF-A以及两种不同的SRF显性负表达载体（SRFΔTAD和SRTFΔDBD）。荧光素酶活性表示为MRTF-A激活的百分比。结果是三个独立实验的平均值。
显性负性SRF对胶原启动子活性的影响
因为我们在ChIP分析中观察到胶原启动子上的SRF占据(B类)以及CArG位点突变体中MRTF-a依赖性胶原的减少(A类)，我们试图测试SRF的显性阴性形式是否会改变胶原蛋白的表达。为此，生成了两个SRF功能缺失表达结构，如下所示：1）SRFΔTAD，它截短了转录激活域(36)，和2）SRFΔDBD，替代残留物R（右）V（V）KI公司到我V（V）银在DNA结合域中，使其不能与CArG元件结合(37). 这两种结构都没有改变基础胶原启动子的活性(B类). 与仅激活胶原启动子的MRTF-A相比，SRFΔTAD的联合转染并未改变报告活性。然而，MRTF-A与SRFΔDBD结构的联合转染显示两种胶原蛋白启动子活性的基因报告激活降低。这些结果表明，胶原蛋白转录独立于SRF反式激活域，但可能需要SRF结合才能招募MRTF-A。
MRTF-A KO肺成纤维细胞胶原和SMA合成异常
两组小鼠的MRTF-A基因被破坏，并观察到乳腺肌上皮细胞的变化(16,52). 然而，目前尚不清楚MRTF-A在肺成纤维细胞中丢失的影响。为了解决这个问题，我们采用标准技术从3-5周龄的MRTF-A WT和MRTF-A-KO同窝婴儿中分离出肺细胞(34). 通过共焦免疫荧光显微镜对WT和KO肺细胞之间的肌成纤维细胞表型进行比较，发现对照细胞中细胞内胶原染色和SMA应力纤维形成较高，而KO肺组织细胞中胶原表达较少，SMA表达紊乱（数据未显示）。在低传代肺成纤维细胞中，与MRTF-A WT对照组相比，KO成纤维细胞的胶原表达和SMA表达水平降低(A类). Western对细胞裂解物进行了三次三次的分析，结果显示减少了54%(第页<0.05）。MRTF-A KO细胞内I型胶原水平的降低与所有分泌型胶原的减少相关(B类).
MRTF-A KO肺成纤维细胞胶原表达降低。 A、，低代MRTF-A WT和MRTF-KO小鼠肺成纤维细胞(n个=3），电镀24 h，并进行I型胶原（Southern Biotech）、MRTF-A和SMA的Western blot分析。将印迹归一化为GAPDH。B、，小鼠肺成纤维细胞在250μ米抗坏血酸48小时。通过Sircol分析测定分泌的胶原蛋白水平，并将其归一化为细胞裂解液中的总蛋白水平。C、，用MRTF-A腺病毒载体感染MRTF-A-KO肺成纤维细胞，并用不同剂量的多西环素治疗，以控制MRTF-A-的表达以及250μ米抗坏血酸48h。通过Western blot分析I型胶原、MRTF-A、SMA的总细胞层蛋白和分泌蛋白。将印迹标准化为GAPDH。结果代表了两个独立的实验。
MRTF-A的异位表达对KO细胞肌成纤维细胞分化缺陷的修复作用
为了确定MRTF-A KO细胞中有缺陷的肌成纤维细胞表型是否可以恢复，MRTF-A-KO细胞被腺病毒MRTF-A-感染，如C类在KO培养物中，异位MRTF-A的表达通过多西环素浓度的调节来调节(C类). 异位MRTF-A表达增强了肺成纤维细胞中SMA的表达，并可作为MRTF-A活性的阳性对照。重要的是，在两个独立的实验中，在缺乏多西环素的情况下，MRTF-A的过表达挽救了这些细胞中细胞内和分泌的胶原蛋白的表达。肺细胞MRTF-A缺失导致胶原和SMA表达降低。总之，这些数据表明，肺成纤维细胞中MRTF-A的敲除降低了胶原合成并破坏了肌成纤维细胞的分化。
讨论
本研究证明了心肌细胞蛋白家族激活剂MRTF-A在调节肌成纤维细胞胶原表达中的重要作用。我们发现MRTF-A通过SRF和Sp1复合物调节胶原蛋白启动子活性和生成。以及MRTF-A在座椅模块组件基因表达(19,20,45,53)我们的结果表明，MRTF-A可能在纤维化过程中协调收缩和ECM基因的表达。
纤维化中富含胶原蛋白的ECM的病理沉积是由多种细胞类型的超增殖和合成特性介导的，包括纤维化病变中的肌成纤维细胞。纤维化进展的关键是几个信号级联的激活(54). 例如，长期以来，Rho-GTPase信号节点的激活与局部黏附组装和应力纤维形成的调节有关(55)与肌成纤维细胞分化相一致。Rho介导的MRTF-A激活已成为肌动蛋白细胞骨架重塑、肌源性编程和心肌肥厚的重要转录调节因子(53,56,57). 尤其是MRTF-A是机械应力反应的关键调节剂(30,53)，之前的研究表明胶原蛋白的产生是对机械应力的反应(58).
MRTF-A激活的胶原转录显著高于心肌蛋白家族的其他成员(B类). 这个COL1A2公司MRTF-A激活了基本启动子（−224 bp），激活量与COL1A1公司启动子（−311 bp）(). 然而COL1A2公司启动子包含一个类增强子区域（−221至−345bp），该区域与多个转录因子的结合位点重叠。该区域为COL1A2公司发起人。组成转录的调控通过四个簇顺式-结合积极和消极的作用元素反式-影响因素(7). 第一个区域发生在甲基化位点或IFNγ治疗期间，位于甲基化敏感CpG的+7附近，RFX/CIITA蛋白的阻遏复合物下调胶原蛋白转录(16–18). 在−80附近有一个典型的CCAAT基序，其中CBF-NFY复合物激活转录(59). 有两个TCC富集区与Sp1家族和位于−160和−125之间的cKrox蛋白相互作用，根据细胞类型激活和抑制(9,59–61). 最后，−300附近的区域包含Sp1蛋白和Ets家族蛋白以及其他转录因子的多个结合位点，包括Ap1、SMAD和C/EBP(9–11,62,63).
MRTF-A通过G-actin结合到其RPEL结构域而被隔离在细胞质中，该结构域阻止了核定位所需的残基(64). 促进肌动蛋白聚合的信号事件，如Rho-GTPase激活，耗尽G-actin库并允许MRTF-A转位到细胞核(19). 此外，Rac1在上皮细胞向间充质细胞转化过程中诱导SMA表达，而DN-MRTF-A的表达抑制了这些变化(65). 未来的研究将研究调节MRTF-A核定位和胶原基因激活的信号事件。
在这项研究中，我们证明MRTF-A在人肺成纤维细胞中的过表达增加了胶原和SMA蛋白水平，而显性阴性MRTF-A的过表达降低了胶原蛋白水平(C类). 有趣的是，MRTF-A的敲除降低了胶原蛋白RNA的蛋白质合成和异质核水平(,A类和B类). 由于胶原蛋白和ECM基因产物受到许多转录后机制的调节，包括miRNA、转录后存储和mRNA可翻译性，这一观察结果可能表明MRTF-A在转录下游的胶原蛋白调节中发挥额外作用(66,67). 为了探索这种可能性，有必要对这一发现进行进一步调查。
由于MRTF-A是一种与DNA结合蛋白相互作用的共激活剂，因此对COL1A2公司发起人(). 已知Sp1位点的缺失降低了胶原启动子的MRTF-A激活，而CCAAT区域的突变则没有（数据未显示）。TGFβ通过Sp1和SMAD通过Sp1的协同作用激活胶原蛋白表达c（c）和SMAD站点(68). MRTF-A家族成员也与SMAD蛋白相互作用(69,70)虽然SMAD结合位点的缺失或突变并没有降低胶原蛋白启动子的MRTF-A激活，但表明MRTF-A/SMAD相互作用在这些培养条件下不起作用。然而，未来对TGFβ刺激的研究可能表明MRTF-A在肌成纤维细胞中的其他作用。
我们还证明，Sp1与MRTF-A协同作用，激活胶原蛋白转录(A类). 密特拉霉素A是Sp1功能的有效抑制剂(48). 这种作用是通过米特拉霉素嵌入富含GC的DNA序列，如Sp1结合位点来实现的。密特拉霉素对胶原表达的抑制已被充分记录，并归因于Sp1的破坏(8). MRTF-A腺病毒表达无法挽救米特拉霉素诱导的胶原合成抑制(C类)强烈提示MRTF-A依赖于Sp1刺激胶原蛋白表达。
仔细检查COL1A2公司启动子表明在CArG盒一致序列的富含a/T的核心中确实存在一个非经典的CArG盒子，它含有胞嘧啶替换(33). 与座椅模块组件已证明启动子显著降低SRF-心肌复合物的结合能力(71). 此外，非经典(即退化）CArG盒可以抑制平滑肌细胞对损伤的反应中SMA的表达(24). 在平滑肌细胞损伤期间，典型的CArG和GC-rich区域相互作用，抑制平滑肌特异性基因，这是由于肌钙蛋白/SRF结合减少所致(24). 据推测，这种损伤可以促进SMC向高度表达胶原的合成肌成纤维细胞的再分化(72). 我们的数据表明，非经典CArG()和GC-rich地区()对通过MRTF-A和Sp1蛋白上调胶原蛋白很重要。尽管这些CArG盒的突变将MRTF-A的激活降低到对照的20–25%(A类)，截短的胶原蛋白启动子结构完全缺乏这些元素(D类)报告基因表达仍显示出显著的MRTF-A激活。总之，这些发现支持了MRTF-a通过CArG和GC富集位点刺激转录的模型，并可能有助于协调整个肌成纤维细胞程序中的表达。
采用定量ChIP分析探讨与MRTF-A复合的转录因子在胶原启动子上的占有率。用定量PCR测定与这些转录因子结合的DNA的定量检测(B类). 通过从IgG样本中减去可检测的信号水平来计算阳性结合(即非特异性结合），因此提供了一个转录因子结合的尺度，零表示没有特异性结合。免疫沉淀反应的特异性通过在基因内含子1内的探针扩增来验证COL1A2公司发起人。在每个免疫沉淀样品中，没有检测到该对照区域的扩增。本文的染色质免疫沉淀数据表明，MRTF-A、SRF和Sp1存在于培养的人肺成纤维细胞的胶原启动子中(B类). 这些结果表明，SRF与胶原蛋白启动子的结合相对于座椅模块组件发起人。非经典CArG盒的两种不同突变，保留和不保留相邻的Ets1-结合位点(10,11)显著减弱但未消除胶原基因报告子的MRTF-A激活(A类). 这意味着SRF与这个非经典CArG站点的结合有助于MRTF-A的招募。为了描述其功能，对SRF进行诱变以使其DNA结合或反式激活结构域失活。SRF DNA结合的突变显著破坏了MRTF-A的反式激活，并可能表明，无论CArG盒序列同源性如何，SRF的结合能力都有助于胶原蛋白的MRTF-A-反式激活(B类). 然而，有趣的是，SRF转录激活域的截断对胶原蛋白启动子的MRTF-A反式激活没有影响。SRF的C末端截断降低了转基因启动子（也称为SM22）的基因报告活性(36)，这是一种细胞骨架基因，已被证明通过保守的CArG盒依赖于心肌病/SRF激活(21). 总之，这些研究确定了胶原启动子和其他MRTF/SRF调节基因之间SRF的功能差异。
MRTF-a突变的小鼠缺乏乳腺肌上皮细胞(52)并且对心肌肥大有抵抗力(33,53,57). 从这项研究中可以清楚地看出，失去功能的MRTF-A肺成纤维细胞减少了胶原蛋白合成以及细胞骨架蛋白表达(). 总胶原蛋白的Sircol分析也表明，MRTF-A KO细胞分泌较少的胶原蛋白，尽管结果不太理想。这一结果可能反映了Sircol测量所有分泌型胶原蛋白而非I型胶原蛋白的事实。最重要的是，MRTF-A的表达恢复了胶原和SMA的表达水平，与野生型对照组相似，从而挽救了表型。虽然我们的研究正在进行中，但最近证实MRTF-A调节心肌细胞中的胶原蛋白合成(33). 我们的研究基于这一发现，确定了肺成纤维细胞胶原表达的重要CArG依赖性和CArG非依赖性机制。首先，我们发现MRTF-A与胶原蛋白和座椅模块组件肺成纤维细胞中的启动子。其次，我们描述了一种新的机制，通过这种机制，Sp1与MRTF-a相互作用来激活胶原蛋白启动子，其中Sp1家族与DNA结合的破坏与米特拉霉素a强烈抑制胶原蛋白，而不改变SMA的表达。最后，SRF内转录激活域的突变对SMA的转录激活有害，尽管未观察到对胶原启动子活性的影响。这些结果表明SRF和Sp1在介导这两个基因的激活方面具有不同的功能。
我们的工作模型是，MRTF-A通过Sp1家族和SRF通过近端启动子内的非经典CArG位点激活胶原蛋白转录COL1A2公司这种机制似乎与其他依赖SRF的基因不同，例如座椅模块组件依赖于心肌蛋白以及MRTF与全长SRF的相互作用以实现有效激活。Sp1家族成员KLF4已被证明抑制SMA的MRTF-A激活，这表明可能需要额外的转录因子组分来微调这两个转录激活复合物的特异性(73).
总之，我们表明MRTF-A是胶原蛋白合成的重要激活剂。这些结果表明，活性胶原蛋白转录和蛋白质合成与MRTF-A活性的增加呈正相关。敲除和敲除模型中MRTF-A的缺失显示胶原和SMA表达受到抑制，表明肌成纤维细胞功能受损。我们的发现是，MRTF-A缺失小鼠的肺成纤维细胞减少了胶原蛋白的生成，这表明MRTF-A可能在纤维化疾病中具有重要的调节功能。未来的研究将探讨MRTF-A在纤维化肺中协调ECM和肌成纤维细胞基因表达的假设。
致谢
我们非常感谢Eric Olson博士（德克萨斯大学西南医学中心）提供的MRTF-A杂合小鼠。我们感谢Anupma Agarwal和William Monis在一些初步实验中提供的技术援助。
6使用的缩写如下：
- 发动机控制模块
- 细胞外基质
- 座椅模块组件
- α-平滑肌肌动蛋白
- MRTF-A型
- 心肌相关转录因子
- 战略参考框架
- 血清反应因子
- DN（公称直径）
- 显性阴性
- hn型
- 异质的
- 小型企业实体
- SMAD元件。
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