突触抑制的有效性取决于氯化物平衡中的多种动态相互作用机制

跨膜氯⁻根据突触输入和协同转运活动的空间分布，细胞间的梯度可能会有所不同

中的空间变化E类 _氯（或E类 _GABA公司)在几个实验中观察到了细胞隔室之间[20],[26]–[29]但在传统的神经元模型中，这并不是一个典型的解释。而纵向、轴-体-树突[Cl⁻]_我梯度可能是由于共转运蛋白活性的差异分布造成的，也可能是由强烈的局部GABA引起的_A类R介导的输入。为了测试后一种情况，我们模拟了高频GABA_A类R介导对单个树突状突触的输入并测量[Cl⁻]_我在输入开始后的不同时间与突触的不同距离(图3A). 在测试条件下，GABA_A类50 Hz时激活的R突触产生纵向[Cl⁻]_我梯度为50µM/µM，延伸至60µM并可能导致E类 _GABA公司200 ms内约为5 mV(图3A). 向心扩散和离心扩散之间只有细微差别(即分别朝向或远离躯体；图3B). 根据这些数据，如果GABA_A类突触接受持续的高频输入⁻]_我会在突触附近增加，影响E类 _GABA公司在原始突触处以及附近的突触处。通过放置“测试”GABA对此进行了进一步调查_A类突触（在5赫兹下激活）与原始GABA的距离不同_A类突触（在50赫兹时激活）。两个突触同时被激活。正如预测的那样，E类 _GABA公司测试时突触受到其他GABA的影响_A类同一树枝晶上的R介导输入，最远可达50µm(图3C 顶部)当KCC2活性降低时，甚至更远。然而，相互作用也依赖于相对于神经元拓扑结构的突触位置；例如，位于不同一级树突上但相对较近的突触几乎没有相互作用(图3C 底部)，与胞体作为夹紧[Cl的水槽一致⁻]_我.

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图3

细胞内Cl的再分布⁻通过电扩散。

答：。通过单个GABA的氯化物流入_A类在50 Hz下激活的R突触（位于距胞体200µm处）在[Cl⁻]_我在输入的每一侧延伸60µm。B。通过单个GABA的氯化物流入_A类R突触（这次位于距胞体50µm处）产生的纵向梯度向胞体（向心扩散）陡于远离胞体（离心扩散）。在这个模拟中，我们使用了直径恒定的树枝晶，以确保左右面板之间的差异是由于胞体的下沉效应，而不是树枝晶的锥形。我们还延长了树突，并将隔室的数量增加到60个，与总结的细胞几何形状相比图1.C、。氯离子扩散⁻测量正常和低（10%）KCC2水平下，在不同突触间距离下，通过一个突触（50 Hz激活）进入第二个“测试”突触（5 Hz激活）。两个突触同时被激活。对于位于同一初级树突（上面板）上的突触，测试突触的[Cl显著增加⁻]_我尤其是当KCC2减少，但Cl没有明显扩散时⁻位于不同初级树突上的突触之间（下面板）。

低于体内条件下，神经元被突触输入持续轰炸[30]因此，我们测试了这种突触噪音是否影响[Cl⁻]_我不同于蜂窝室。我们在有无KCC2活性以及有无突触噪声的情况下进行了模拟。KCC2均匀分布于细胞隔室，模拟分布式持续突触输入，产生了清晰的体树突状[Cl⁻]_我梯度(图4A 黑色). 相反，在没有模拟突触噪声的情况下，没有显著的体树突状[Cl⁻]_我尽管存在KCC2(图4A 绿色). 缺乏显著的体树突状细胞[Cl⁻]_我在相反的情况下也观察到梯度，即在存在突触噪声但没有KCC2的情况下(图4A 红色). 因此，一种重要的体树突[Cl⁻]_我存在持续Cl时可能存在梯度⁻流入，Cl的重新分布⁻扩散荷载和Cl⁻KCC2挤压。这清楚地表明，差异挤压，即不均匀KCC2密度（见下文），对于不均匀跨膜Cl来说是不必要的⁻梯度。

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图4

一种直立的树突状氯离子⁻梯度是KCC2活性和GABA共同作用的结果_A类R介导的突触输入。

答：。[Cl的分布⁻]_我在Cl存在和不存在的情况下，模拟树突中与体细胞距离的函数⁻分布突触活动和Cl引起的负荷⁻通过均匀分布的KCC2挤压。B类.装有MQAE的示例电池的显微照片，带有寿命颜色编码（蓝色：低Cl⁻浓度，红色：高Cl⁻浓度）。细胞内Cl⁻在存在muscimol（Musc；100µM）和/或荷包牡丹碱（Bic；100μM）和（或）速尿（Furo；200µM。箭头表示进行测量的位置。C类.GABA的补益激活作用_A类[Cl上muscimol的Rs⁻]_我在实际树突中，作为与体细胞距离的函数（每个数据点代表10–12个神经元的平均±SEM；每个细胞的多个树突的值是平均值）。将荷包牡丹碱和/或速尿和/或VU 0240551添加到区块Cl⁻分别进行加载和挤压。

为了测试模型的预测，我们使用FLIM测量[Cl⁻]_我培养的MQAE负载神经元(图4B). 模拟分布式Cl⁻我们将培养物暴露在100µM的麝香酚中。FLIM测量表明⁻]_我枝晶梯度(图4B 顶部)要么被荷包牡丹碱还原(图4B 中间的和4C）或通过添加速尿或最近开发的更为特异的KCC2抑制剂VU 0240551进行阻断[25](图4B 底部和4C），与模拟预测一致（参见。图4A). 存在速尿时的较小剩余梯度可能表明存在模型中未考虑的另一种氯离子传输机制。

我们的模拟基于KCC2沿树突均匀分布的假设，这种结构似乎足以解释所观察到的体-枝梯度。然而，这并不排除KCC2沿着枝晶梯度的可能性。为了测试这种梯度的存在与否，我们试图对KCC2沿树突的分布进行定量荧光免疫细胞化学分析。然而，测量KCC2免疫标记可能不足以估计功能性KCC2的分布，因为最近有人认为KCC2的低聚物形式是功能性的[31],[32]为了特别测量KCC2二聚体沿树突的密度，我们利用了我们最近开发的一种技术，即空间强度分布分析（SpIDA）它可以通过免疫细胞化学标记的常规激光扫描共焦显微镜分析定量测量蛋白质的密度和寡聚化[33],[34]因此，我们应用SpIDA分析上述药理实验中所用神经元树突的KCC2免疫染色(图4). 在培养仅5天的神经元中，使用KCC2的免疫标记来评估单体量子亮度，因为在发育的那个阶段，KCC2基本上是单体的[31]单体量子亮度估计为3.9×10⁶±0.2（平均值±SEM）强度单位或3.9±0.2 Miu，沿5-DIV神经元树突（11个神经元中的52个区域）保持不变。使用自动强度二进制掩模[35]，仔细检测成熟神经元（>21DIV）的树突，并为每个分析区域生成强度直方图，并假设两种群（单体和二聚体）混合模型。对于每个分析区域，对在所选区域中具有最亮平均强度的z堆栈图像（图像之间0.5µm）执行SpIDA。为了估计KCC2的真实膜密度，在z堆叠的两个相邻图像上对每个区域的最终值进行平均。下面给出了一个带有示例区域的神经元及其对应的直方图和SpIDA拟合值图5A、B结果表明，KCC2沿树突的膜密度是恒定的，距离胞体中心至少200µm(图5C).

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图5

在培养的神经元树突中，KCC2的密度是恒定的。

A类。三个共焦图像平铺显示用荧光抗KCC2抗体染色的神经元。图像大小为1024×1024像素，像素大小为0.115µm，像素停留时间为9.1µs。三个红色方块代表分析的示例区域，如下所示B类，使用相应的二元掩模来描绘标记的树枝晶。划分的代表性分区的强度直方图A类如所示B类其对应的SpIDA拟合和单体恢复值（N₁)和二聚体（N₂)密度。距离（例如。，d日在里面A类)还测量了细胞体中心和分析区域中心之间的距离。C类枝晶表面KCC2二聚体密度与SpIDA获得的细胞体距离的函数关系图。从27个神经元中分析了823个区域。误差条显示SEM。

虽然我们的实验结果表明沿枝晶长度均匀分布，但这并不一定适用于所有条件，尤其是我们的分析没有关注局部不均匀性，例如微畴。因此，我们还试图确定纵向细胞内Cl⁻在小尺度上，CCC活性不均匀也可能导致梯度。例如，KCC2在亚微区水平的不均匀分布可能会产生与通过突触输入观察到的局部梯度相当的局部梯度（参见图3). 事实上，在一些突触附近观察到KCC2的聚集[36]，但兴奋性突触附近的KCC2被证明在支架中起作用，而不是作为共同转运蛋白[37]然而，为了测试KCC2的亚细胞分布是否能产生局部梯度，我们以20µm的间隔模拟了每个放电突触之间的高频突触Cl⁻通过KCC2的挤压定位在距离突触不同距离的一个点上(图6A). 在所有情况下，KCC2的位置都对E类 _氯因此，我们的模拟表明，KCC2的亚组分分布（即0-10µm空间尺度上的不均匀性）对E类 _氯.

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图6

不均匀的CCC分布可产生大规模但非精细的细胞内[Cl⁻]_我梯度。

答：。 左边：研究KCC2的突触周围分布是否能产生精细的细胞内[Cl⁻]_我梯度，我们通过将KCC2集中在每个隔室的单个位置，在距突触爆发不同距离处，改变KCC2的亚隔室分布。我们将隔间分为20个1µm长的部分。每个隔室的KCC2总量恒定在100%。抑制性突触彼此相距20µm，并在高频下被激活。赖特：结果表明，小室分布对突触周值影响不大E类 _氯，这与高频突触输入的影响形成对比（参见图3)但与扩散负责细胞内Cl的快速再分配相一致⁻负载。B。在没有突触活动的情况下，我们在轴突起始段（AIS）插入不同水平的NKCC1活性，并监测轴突-躯体-树突状细胞[Cl⁻]_我KCC2活性高（100%）和低（33%）水平的梯度（均匀分布，AIS除外）。Soma对应于上的0x个-轴线；如左图所示，正距离向树突延伸，负距离向轴突延伸。C、。存在背景突触活动(如果 _inh公司 =  0.4赫兹；如果 _交易所 =  0.1 Hz），我们模拟了不同水平的KCC2活性（均匀分布，AIS除外），并监测了轴-体-树突状[Cl⁻]_我AIS中存在（100%）或不存在NKCC1时的梯度。

上述结果并不排除其他细胞类型中CCC表达梯度的不均匀性，以及轴突起始段和胞体相对于树突的不均匀。例如，轴突起始段（AIS）缺乏KCC2[9],[38]，选择性表达向内Cl⁻AIS中的运输车NKCC1[28]，或者这两种表达模式的组合将导致E类 _氯在AIS中减少负面影响。要测试E类 _氯在AIS及其对邻近隔室的影响中，我们模拟了AIS中NKCC1的不同水平，以及在有或无背景突触输入的情况下，躯体和树突中KCC2的不同水平(图6B–C). 在AIS中表达NKCC1可产生轴-体细胞[Cl⁻]_我梯度，但这种梯度不会延伸到树突中，如果有的话(图6B). 正如预期的那样，结合AIS中NKCC1的表达和突触噪声（如图4A)导致“双梯度”(图6C右侧面板 ).

因此，我们的电扩散模型中的模拟表明GABA的亚细胞分布_A类R输入和CCC活动可以在E类 _氯，这应该转化为抑制性输入，根据突触的位置具有不同的功效。即使KCC2活性在背景GABA存在下均匀分布，情况也是如此_A类R输入。此外，焦点Cl⁻通过一个突触（或一簇突触）的流入可以影响邻近突触的功效，尽管这取决于这些相互作用的突触的亚细胞定位，例如接近胞体。相反，KCC2活动的小室不均匀性不足以导致局部[Cl⁻]_我梯度。

扩散和KCC2活性决定了在高频突触输入期间跨膜氯化物梯度维持的强度

图4和​和66强调[Cl的空间变化⁻]_我可能由正在进行的GABA引起_A类R输入。将这些结果扩展到包括E类 _氯，我们考虑了[Cl⁻]_我在刺激瞬变期间进化。这是由实验观察得出的E类 _GABA公司在GABA爆发时会迅速崩溃_A类R突触事件[20],[28],[39],[40]。活动相关的变化E类 _GABA公司取决于输入的位置：躯体输入对E类 _GABA公司比树枝状输入[4],[28]。我们的电扩散模型中的模拟复制了这些实验数据(图7A)以及简单模型的结果[19]胞体的突触输入序列在E类 _GABA公司转化为GABA的小幅减少_A类R介导电流。去极化偏移E类 _GABA公司更大且发生得越来越快，以便输入到越来越多的远端树突。尽管有KCC2(红色). 拆卸KCC2(黑色)增加了Cl坍塌的幅度和速度⁻高频输入远端树突时的梯度，但对体细胞的输入几乎没有影响。这一发现表明，去除KCC2后，每个隔室中初始突触事件的振幅都不受影响，这似乎与观察到的站立[Cl⁻]_我梯度取决于KCC2活性（参见图4). 我们假设这是由于没有持续的氯离子⁻背景突触活动不足引起的负荷。因此，我们重复了中所示的模拟图7A但有背景突触输入(图7B). 正如预测的那样，当背景突触输入存在时，初始IPSC振幅受KCC2活性水平的影响（比较图7B和A). 这些结果表明，局部细胞内Cl的比率⁻积累主要取决于扩散（扩散重新分配细胞内Cl⁻负荷），而积累的程度取决于KCC2活性（这会降低细胞内Cl⁻通过挤压加载）。

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图7

Cl的依赖性⁻突触输入位点和KCC2水平的积累。

在模拟中，位于四个位置之一的突触处的抑制性突触后电流（IPSC）序列（40 Hz）：胞体和近端、中间和远端树突（分别距胞体40、100和240µm）(A类)和(B类)背景突触输入(如果 _inh公司 =  0.4赫兹，如果 _交易所 =  0.1赫兹）。在这组模拟中，相对于以下总结的细胞几何形状，单个枝晶被延长（并且隔室数量增加到60个）图1A在没有KCC2的条件下，远端树突中IPSC的反转明显(右侧面板).C类.平均爆发内IPSC变小(即超极化程度降低）。突触背景活性与B类平均IPSC是在模拟时间50秒内，以40赫兹每秒200毫秒的频率激活的“测试”突触上测量的。的稳态值E类 _氯(D类)以及E类 _氯接近稳态(E类)不同KCC2水平和“测试”突触与躯体的距离。稳态E类 _氯在中报告D类测量值为E类 _氯GABA时收敛_A类测试突触的R被人为打开。该收敛与一个单指数拟合，以确定报告的时间常数E类.

为了更彻底地研究这些过程，我们系统地改变了突触内的频率、“测试”突触的位置和KCC2活性，并测量了整个突触内“测试”的平均IPSC振幅。在向远端树突高频输入期间，通过GABA的净平均电流_A类R突触从外向内转换，而相同速率的体细胞输入继续产生强大的外向电流(图7C). 因此，虽然增加内爆发频率可以有效地增强体细胞的超极化，但它在树突中迅速失效，甚至可以在远端树突中去极化。对于固定的爆发内频率，E类 _氯收敛到不同的稳态水平(图7D)以不同的费率(图7E)取决于测试突触的位置和KCC2活性的水平。换句话说，[Cl的稳态值⁻]_我随着与躯体的距离增加（令人想起图4A和C)随着KCC2活性的增加，其含量降低。另一方面，Cl⁻随着KCC2活性的增加以及与胞体的距离的增加，积累更快地收敛到稳定状态。这两个收敛过程是由于不同的现象造成的：KCC2活性增强使树枝晶限制了Cl的范围⁻累积（见上文），而Cl⁻由于有效体积较小，扩散受到限制，所以在远端树突中积累较快。总之，在动态条件下，远端树突的受限扩散会导致E类 _GABA公司，但这次坍塌的程度受到KCC2的限制，与实验测量结果一致[8],[9],[28].

在枝晶中，分布着GABA_A类R输入比高频焦点输入介导更大的抑制

上述结果使我们预测，对于等效的总突触输入，许多广泛分布的GABA_A类低频激活的R突触比高频激活的少数簇状突触（或仅一个突触）产生更大的超极化，尤其是位于远端树突的突触。我们通过比较一个突触在50 Hz的内爆发频率下产生的外向电流与十个分布式突触在5 Hz下产生的总超极化电流来验证这一点；树突和躯体定位突触重复了这一点(图8A). 在胞体中，10个在5赫兹下激活的突触比一个在50赫兹下激活的突触产生更多的向外电流(图8A 中间的). 这是因为由于饱和，总突触电导与频率不成线性关系。更重要的是，分布式树枝状输入能够产生强大的外向电流，尽管存在氯离子⁻而聚集的树突状输入在产生外向电流方面完全无效。这些结果表明，树突状抑制在空间分布时最有效，与图3和​和6。6.维护空间分布的GABA_A类树突中的突触也很重要，因为远端超极化GABA的快速动态崩溃_A类R电流将限制其控制体细胞信号的有效性，因为膜电位的变化远大于电导的变化[8],[41]考虑到即使在E类 _氯崩溃后，我们将神经元提交给分布式兴奋性输入，并测量模型神经元的平均放电频率，以验证超极化电流的损失转化为有效的去抑制(图8A 正确的). 我们发现，射速的降低反映了携带电荷的变化（参见。图8A 正确的和中间的面板）。

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图8

抑制效果取决于GABA的时空特征_A类R输入。

答：。示意图显示突触定位(左侧面板). GABA公司_A类R输入聚集在单个突触上(红色)产生的外向电流小于分布在十个空间分离突触上的相同总输入电流(绿色)尤其是对远端树突的输入(中央面板). 确保“总电荷”转化为功能相关抑制(即减少峰值），我们将模型提交给分布式兴奋性输入(如果 _交易所 =  0.2 Hz）和测量的燃烧率。正如预期的那样，当抑制输入空间分布时，放电频率的降低幅度更大(右侧面板).B。通过“测试”突触的净电荷(颜色)KCC2活性降低时持续下降，但频率增加(左侧面板)，时间常数(中间面板)或电导(右侧面板)突触的输入不一定会增加电流振幅。对于左侧面板，当输入频率和KCC2水平变化时，时间常数保持在10ms；虚线表示最佳频率，重新绘制D类。对于中间面板当时间常数和KCC2水平变化时，输入频率保持在30Hz。对于右侧面板当电导和KCC2水平变化时，输入频率和时间常数分别保持在30Hz和10ms。这些模拟包括背景突触活动(如果 _inh公司 =  0.4赫兹，如果 _交易所 =  0.1赫兹）。测试突触位于距躯体50µm处。C类。我们进行了与中类似的模拟B类但增加了分布式兴奋性输入，以根据放电率降低而不是总电荷来评估抑制(左侧面板). 倒钟形曲线的图案与B类从而证实了在整个细胞水平上抑制的净变化。上的图表正确的说明了使用包括Ca在内的模型进行模拟得到的结果²⁺-激活的K⁺通道或持续Na⁺频道。我们还将树枝状HH通道集中在分支点，同时保持这些通道的总电导。结果在质量上与左边.D。最佳输入频率取决于KCC2水平和时间常数(左侧面板)和相应的电流(右侧面板). 黑色曲线对应于左面板上的虚线B类注意，这是激活单个“测试”突触的最佳频率；最佳输入频率必然会随着激活突触数量的增加而减少，尽管确切的关系取决于这些激活突触的空间分布（参见A类)以及背景突触活动的水平。

加强GABA_A类在氯稳态受损的情况下，R输入可能无法增强抑制

除了突触的位置，突触输入的速率和持续时间预计将与E类 _GABA公司改变抑制效果。虽然增加了GABA的速度或持续时间_A类R输入最初可能会增加IPSC振幅，这种变化也会加速Cl的消耗⁻梯度，从而最终降低IPSC振幅，至少当Cl⁻流入淹没了局部扩散机制和Cl⁻挤出能力。利用我们的模型，我们研究了KCC2活性水平、突触频率和GABA时间常数的影响_A类R介导事件（τ_IPSC公司)树枝状GABA的平均电流_A类R突触。模拟表明，KCC2活性的增加总是导致较大的平均外向电流。相反，增加突触输入频率(图8B 左边)或τ_IPSC公司(图8B 正确的)不一定会增加平均电流；在这两种情况下，在这些参数的中间值时，平均电流最大。同样，在这些参数的中间值时，平均射速降低最多(图8C). 为了确定结果的通用性和稳健性，我们对具有不同离子通道的神经元重复模拟，以影响尖峰的产生。我们添加了非活性钙²⁺-激活的K⁺已知可降低放电率或持续Na的通道⁺我们还进行了模拟，其中树枝状霍奇金-霍克斯利（HH）通道集中在分支点。尽管对模型的这些修改改变了总体射速，但我们的定性发现保持不变；也就是说，如果GABA_A类R输入超出了一定的水平(图8C 正确的).

上述结果表明，GABA更多或更长_A类R输入可能并不总是产生更多的抑制，即更强的外向电流。因此，我们问GABA_A类R输入条件产生最强的抑制？通过测量哪些参数组合产生最大外向电流来解决这个问题。我们发现GABA_A类产生最大外向电流的R输入频率随KCC2活性增加而增加，随τ减小_IPSC公司(图8D). 当KCC2活性耗尽至其正常值的10%和τ_IPSC公司设置为50ms；换句话说，GABA_A类R介导的突触事件以低于或高于6赫兹的频率发生，产生的外向电流较少。最佳GABA_A类当KCC2活性设置为基线和τ时，R输入频率攀升至28 Hz_IPSC公司设置为10毫秒。因此，最佳GABA_A类R输入频率可能因其他因素而变化很大，但关键的观察结果是超出某一点（由Cl的稳健性决定⁻体内平衡），更多GABA_A类R输入不一定产生更多抑制。增加GABA的频率_A类当估计携带总电荷或发射率降低时的有效抑制时，R输入显示出类似的倒钟形曲线(图8B和C).

通过GABA的净电流_A类R取决于氯化物和碳酸氢盐通量的平衡

中显示的仿真结果图7表明通过GABA的电流_A类如果细胞内Cl积累充足，R可以逆转极性⁻然而，作为Cl⁻梯度坍塌，人们会认为Cl⁻通量停止，但不改变其方向；同样，预计IPSC将变小，但不会反转。的确，如果GABA_A类R建模为仅传递Cl⁻离子，IPSC以Cl形式减小⁻在细胞内积累，但不反转方向(图9A)因此，必须考虑碳酸氢盐通量才能解释IPSC反转[42],[43]。我们模型的一个重要且新颖的特征是HCO_三 ⁻不假定为常量。即使[HCO的相对稳定性_三 ⁻]_我已证明是HCO之间复杂相互作用的结果_三 ⁻流出、碳酸酐酶介导的反应和质子挤压机制，大多数模型都选择将其视为常数事实上的然而，模拟[HCO中涉及的各种机制_三 ⁻]_我事实证明，管理层是调查承担[HCO的合法性的有用工具_三 ⁻]_我为常数，用于研究Cl之间的潜在相互作用⁻和HCO_三 ⁻动力学。碳酸氢盐流出会产生向内的电流，但该电流（通常）被Cl产生的更大的向外电流所掩盖⁻由于Cl之间的渗透率比⁻和HCO_三 ⁻阴离子约为4∶1[2],[43]但作为Cl⁻-介导的外向电流变小，HCO_三 ⁻-介导的内向电流变为相当地更大，最终导致通过GABA的净电流_A类R向内。与Cl不同⁻梯度，HCO_三 ⁻坡度往往不会塌陷(图9B)因为细胞内HCO_三 ⁻由碳酸酐酶催化的一氧化碳转化补充₂它可以很容易地扩散到膜上[44],[45].

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图9

HCO稳健性之间的权衡_三 ⁻和Cl⁻平衡。

答：。GABA引起的突触电流随时间的变化_A类R突触保持打开状态。标准模型中的注意事项(黑色)电流最终倒转；相反，在没有HCO的模型中，电流衰减到零，但没有反转_三 ⁻流出，流出(红色).B。标准模型和相同试验条件下的反转电位随时间的变化A类虽然与中的变化相比较小E类 _氯,E类 _{HCO3（高氯酸盐）}确实发生了变化（方向相反）。这些变化的平衡决定了E类 _GABA公司，解释了在C类和D类–减少了E类 _{HCO3（高氯酸盐）}应该在以下方面产生更大的变化E类 _氯，而E类 _氯应该在以下方面产生更大的变化E类 _三氯化氢.C、。鼓励HCO_三 ⁻通过GABA流出_A类持有R[HCO_三 ⁻]常数(绿色)加剧了去极化转变E类 _氯.阻碍HCO_三 ⁻通过减少H流出⁺挤压到正常（黑色）的33%，这反过来阻碍了碳酸酐酶催化的正向反应，并加速细胞内HCO的消耗_三 ⁻，缓解了E类 _氯.D。相反，鼓励Cl⁻通过GABA流入_A类R通过持有[Cl⁻]常数(黑色)加剧了超极化偏移E类 _{HCO3（高氯酸盐）}.令人沮丧的Cl⁻通过将KCC2活性降低至正常（绿色）的10%来缓解超极化偏移E类 _{HCO3（高氯酸盐）}。中的效果C类比那些D类这说明了互译是如何不对称的，即pH调节对[Cl的影响更大⁻]动力学比Cl⁻在这里模拟的条件下，调节对pH动力学有影响。E.公司。模拟与C类和D类已执行，但添加了Cl⁻/HCO公司_三 ⁻换热器处于不同的活动水平。F、。我们进行了一个模拟，其中我们添加了一个人工H⁺注入5s（水平杆）。质子流入导致[HCO显著下降_三 ⁻]_我从而产生超极化偏移E类 _{HCO3（高氯酸盐）}; 在没有Cl的模型中，这种变化更大⁻/HCO公司_三 ⁻交换器（未显示）。由此产生的HCO变化_三 ⁻导致氯离子倒置的梯度⁻/HCO公司_三 ⁻导致E类 _氯; 这并不是在没有Cl的情况下发生的⁻/HCO公司_三 ⁻交换器。

但尽管碳酸酐酶催化反应的反应物(即一氧化碳₂和H₂O） 未耗尽，正向反应生成H⁺除HCO外_三 ⁻.通过去除HCO_三 ⁻、GABA_A类R活性有望降低细胞内pH值，这已在实验中观察到[24].由于细胞内H积累⁺改变反应的平衡点，细胞内HCO_三 ⁻缓慢减小，时间常数约为几秒，这解释了超极化的微小偏移E类 _{HCO3（高氯酸盐）}在中看到图9B在长时间尺度上。由E类 _氯和E类 _{HCO3（高氯酸盐）}朝相反方向移动，E类 _GABA公司倾向于膜电位。因此，我们预测E类 _{HCO3（高氯酸盐）}将导致E类 _氯反之亦然，减少E类 _氯将导致E类 _{HCO3（高氯酸盐）}为了测试第一个预测，[HCO_三 ⁻]_我保持恒定（从而保持HCO_三 ⁻流出），增强了E类 _氯; 另一方面，增加细胞内HCO_三 ⁻通过Na减少质子挤压耗尽⁻-H（H）⁺交换器（从而减少HCO_三 ⁻流出）缓解了E类 _氯(图9C). 为了测试第二个预测，[Cl⁻]_我被人为地保持恒定，这增强了E类 _{HCO3（高氯酸盐）}; 相反，增加细胞内Cl⁻通过减少Cl积累⁻通过KCC2挤压减轻了超极化偏移E类 _{HCO3（高氯酸盐）}(图9D). 这些结果证明了[Cl稳定性之间的权衡⁻]_我基于对[HCO的共同依赖，细胞内pH值的稳定性_三 ⁻]_我。[Cl是否⁻]_我或者细胞内pH值在正常条件下受到更强烈的调节，但可以合理推断，当KCC2活性降低时，初级去极化偏移E类 _氯将与在E类 _{HCO3（高氯酸盐）}产生较大的去极化偏移E类 _GABA公司这与稳态条件特别相关，因为在单个突触事件的时间尺度上，pH缓冲机制没有饱和，而在较长的时间尺度下，HCO的限速成分_三 ⁻稳态是HCO的较慢动力学_三 ⁻和H⁺膜转运蛋白。

Cl公司⁻/HCO公司_三 ⁻交换器还可以在pH管理和Cl中发挥作用⁻体内平衡调节。为了深入了解此交换器的影响，我们重复了以下模拟图9C–D添加不同水平的Cl⁻/HCO公司_三 ⁻模型的交换器活动。与此类离子交换器的情况一样，Cl⁻/HCO公司_三 ⁻交换器将驱动E类 _氯和E类 _{HCO3（高氯酸盐）}相互靠近，即去极化E类 _氯和超极化E类 _{HCO3（高氯酸盐）}(图9E). 这一结果似乎违反了直觉，因为交换器有望在pH值管理中发挥有益的作用。然而，在另一个酸化源的例子中，E类 _三氯化氢可以发生超极化移动，并且由此产生的HCO变化_三 ⁻梯度可以反转Cl⁻/HCO公司_三 ⁻运输，驱动Cl⁻输出和HCO_三 ⁻从而防止明显酸化(图9F).

这些结果预测E类 _氯在酸化过程中会变得更加超极化。为了测试这一点，我们对H建模⁺超过5秒的流入，并监测E类 _氯在有和没有Cl的模拟中酸化期间和之后⁻/HCO公司_三 ⁻交换器。在这种模拟中，质子内流触发了与HCO的反应_三 ⁻从而导致[HCO减少_三 ⁻]_我反过来，这会导致超极化E类 _{HCO3（高氯酸盐）}最终会变得比E类 _氯，有效地反转交换器并导致超极化E类 _氯(图9F). 随着H的流入⁺停止，H⁺通过Na挤压⁺/H（H）⁺交换可以恢复pH值，碳酸酐酶介导的反应能够补充细胞内的HCO_三 ⁻由于[HCO的缓慢变化_三 ⁻]_我转化为氯离子活性的变化⁻/HCO公司_三 ⁻交换器的值E类 _氯慢慢地变得更加去极化，直到它恢复到静止值(图9F). 正如预期的那样，这些变化E类 _氯在没有Cl的情况下进行模拟时无法观察到⁻/HCO公司_三 ⁻交换器(图9F). 因此，Cl⁻/HCO公司_三 ⁻交换器可以被视为一种防止明显酸化的故障保护机制，至少当这种酸化不是由HCO引起时_三 ⁻通过GABA流出_A类频道。

细胞外钾的积累影响GABA_A类通过多步反馈回路的R介导电流

挤出Cl⁻从单元格中，KCC2必须传递相等数量的K⁺因为净过程是电中性的。因此，K⁺KCC2外排可降低跨膜钾⁺梯度并产生去极化偏移E类 _K（K）从而减少氯离子⁻由于KCC2驱动力的减小，通过KCC2挤出。为了研究这种假定的负反馈机制，我们改变了KCC2活性，并测量了其对E类 _K（K）（在体部测量）在接受固定水平的背景兴奋性和抑制性突触输入的模型神经元中。仿真结果表明，在分布式GABA条件下_A类R输入在体内-与背景频率一样，KCC2活性实际上对E类 _K（K）不像它对E类 _氯(图10A，比较左边和正确的面板）。我们通过监测钾的细胞内外浓度进一步研究了这一点⁺(图10B). 虽然绝对值很大，但变化[K⁺]_我相对而言较小，在E类 _K（K）比那些观察到的E类 _氯此外，KCC2活性对[K⁺]_o（o）主要由K余额控制⁺泄漏电导，Na主动泵送⁺-K（K）⁺-ATP酶和细胞外扩散。

在单独的窗口中打开

图10

[Cl之间的相互作用⁻]法规和[K⁺]监管。

答：。KCC2水平的变化导致E类 _氯(右侧面板)但对E类 _K（K）(左侧面板). 背景突触活动如果 _交易所 =  0.2赫兹和如果 _inh公司 =  0.8赫兹。B。钾的细胞内外浓度⁺对于中报告的相同模拟A类虽然细胞外K⁺水平较低，[K⁺]_o（o）由于其他机制而保持相对稳定，例如细胞外扩散。这解释了为什么E类 _K（K）在中保持相对恒定A类.C、。最大值[K⁺]_o（o）通过对树枝晶施加500 nS GABA电导达到。在100和200 ms时测试FH空间的扩散时间常数（对应于正常和50%较慢的细胞外K⁺间隙）以及可变细胞外间隙。D类.E类 _氯作为不同固定水平[K的抑制输入平均频率的函数⁺]_o（o）.

KCC2活性对[K的影响不显著⁺]_o（o）与实验观察结果明显不一致[46]但这些实验涉及使用重Cl⁻负荷，与图10A和B.测试是否存在较大的Cl⁻负荷可能引起KCC2介导的[K的增加⁺]_o（o），我们模拟了一个恒定的5 nS，500 ms长的GABA_A类树枝晶上的R电导。在这些条件下，[K⁺]_o（o）KCC2活性显著改变，如[K的最大值之间的正相关所示⁺]_o（o）和KCC2级(图10C). 用降低的细胞外钾重复这些模拟⁺清除证实细胞外扩散并没有显著改变[K⁺]_o（o）在这些“重载”条件下(图10C). 无论KCC2活性是否影响细胞外K⁺积聚，细胞外K⁺尽管如此，预计累积会通过降低KCC2的驱动力来降低其功效。为了测试这一点，我们重复了中所示的模拟图1D具有不同的固定值[K⁺]_o（o）并观察到细胞外钾确实会降低KCC2的功效⁺当[K⁺]_o（o） =  10毫米(图10D).

重要的是要了解[K中的变化⁺]_o（o）对…有更大的影响E类 _K（K）比[K的等效绝对变化⁺]_我因此，尽管KCC2活动本身预计不会改变E类 _K（K）在正常生理条件下（见上文）E类 _K（K）由其他因素引起(例如高射速，钠含量降低⁺-K（K）⁺-ATP酶活性等）降低KCC2活性。换句话说，没有关闭直接连接KCC2和E类 _K（K），但外部因素可以调节Cl⁻影响细胞外钾的挤压⁺积累。事实上，重要的是Cl⁻在过度刺激（可能是去抑制的结果）导致细胞外钾的情况下，挤压可以减少（从而使抑制无效⁺积累-这将构成一个多步骤的正反馈回路（另见下文）。

频道

离子电流服从方程哪里E类_x个表示离子的反转电位x个和克_x个是相对于离子的通道电导x个在模拟过程中，使用能斯特方程不断更新反转电位哪里R（右）是理想气体常数T型是绝对温度，取310°K（37°C）。因为GABA_A类受体通过两个Cl⁻和HCO_三 ⁻阴离子的比例为4∶1[24],E类 _GABA公司使用Goldman-Hodgkin-Katz方程计算

在计算各自离子种类浓度的变化时，考虑了每一种离子电流，其总和产生了用于更新膜电位的净电流。

突触输入被建模为泊松过程。每个抑制性突触的平均激活频率为0–10 Hz，而每个兴奋性突触则以0–2 Hz的平均频率激活。除非另有说明，抑制性突触的最大电导为1±0.3 nS（平均值±标准偏差），动力学建模为瞬时上升和指数衰减，τ_IPSC公司30毫秒[30],[68]–[70]GABA公司_A类R突触密度为每100µm 60个突触²在AIS中，每100µm有40个突触²体细胞和每100µm 12个突触²在树突中。兴奋性突触的密度为每100µm 60个突触²树突中没有兴奋性突触[21],[30]除非另有说明，兴奋性突触的最大电导为0.5±0.2 nS（平均值±标准偏差），动力学建模为瞬时上升和指数衰减，τ_EPSC公司10毫秒。

Hodgkin-Huxley（HH）通道使用以下报告的参数值进行建模[12]与电压相关的Na⁺电流由

在哪里？V（V）_T型 = −58毫伏和V（V）_S公司 = −10 mV。电压选通K⁺通道描述如下

HH通道密度为12 mS/cm²AIS和1.2 mS/cm²在胞体和树突中[21],[30]。该模型还包括K⁺和Na⁺相应密度为0.02 mS/cm的泄漏通道²和0.004 mS/cm²体细胞，0.03 mS/cm²和0.006 mS/cm²在近端树突中，0.1 mS/cm²和0.02 mS/cm²在远端树突中，0.02µS/cm²和0.004µS/cm²轴突节间，15 mS/cm²和3 mS/cm²在轴突节点中，如所述[21],[30].

对于一些模拟，我们添加了其他类型的电导来解释许多可能的尖峰产生机制。也就是说，我们添加了非活化钙²⁺-激活的K⁺通道和持续Na⁺分别测试峰值降低和峰值增强机制的通道。加利福尼亚州²⁺-激活的K⁺信道遵循以下方程组

辅助功能由

常数定义为c_虚拟机 = 28.9毫伏，c_公里 = 6.2毫伏，ctm=0.000505秒，c_vtm1型 = 86.4毫伏_千吨1 = -10.1毫伏_vtm2型 = -33.3毫伏，c_平方公里 = 10毫伏τ_z（z） = 1s，ch=0.085，c_甚高频 = 32毫伏，c_千赫 = -5.8毫伏，c_第个 = 0.0019秒，摄氏度_vth1型 = 48.5毫伏_千吨1 = -54.2毫伏，c_{vth2（vth2）} = -54.2毫伏，c_第2节 = 12.9毫伏。

持久性Na⁺通道由以下方程组描述：

辅助功能由

其中常数由v给出_平方米 = −2毫伏和伏_第页 = −5毫伏。

最后，解释非突触性、张力激活的氯离子⁻电导，在一些模拟中我们添加了GABA_A类氯离子比率相同的泄漏通道⁻：HCO_三 ⁻作为突触通道的介电常数，这些通道的密度为0.003 mS/cm²体细胞，0.0045 mS/cm²在近端树突中，0.015 mS/cm²轴突节间0.003µS/cm2，2.3 mS/cm²在轴突节点中。

钠钾泵和阳离子氯化物联合运输器

纳⁺-K⁺-ATP酶泵利用一个ATP分子水解产生的能量来泵送三个Na⁺神经元中的离子和两个K⁺内部离子。该泵的活动取决于[K⁺]_o（o）和[Na⁺]_我以及观察到的膜电位[71].Na⁺通过泵的电流由以下方程式给出

[72],[73].使用K_{m、 Ko公司} = 1.5毫微米（K）_{m、 奈伊} = 10 mM和Na_一半 = 20 mM.输出Cl⁻通过KCC2的通量根据[2],[4]通过

K系列⁺假设通过KCC2的电流的绝对值相等，但极性与Cl相反⁻使通过KCC2的净电流等于零。最大Cl⁻通过KCC2的电流被认为是我_{Cl，最大值} = 0.3毫安/厘米²正常活动水平。选择此值是为了提供E类 _氯 =  −当抑制和兴奋的平均突触输入频率分别为3.2 Hz和1.6 Hz时，为80 mV。该值也会产生最大Cl⁻清除率接近10 mM/s，与实验数据一致[4].驱动力的值(E类 _氯-E类 _K（K）)其中Cl⁻通过KCC2的电流达到一半最大值(V（V） _一半)设置为40 mV。这对应于[Cl⁻]_我 =  假设[Cl⁻]_o（o） =  120 mM和E类 _K（K） =  -95毫伏。

在一些模拟中，我们还对AIS中的NKCC1活动进行了建模。Cl公司⁻通过NKCC1的流入被建模为

在哪里？E类 _NKCC1公司是的值E类 _氯其中Cl⁻通过NKCC1的流量方向相反，由下式给出E类 _NKCC1公司 =  (E类 _K（K）+E类 _纳)/2. 最大Cl⁻通过NKCC1的电流被认为是我_{Cl，最大值} =  0.3毫安/厘米²正常活动水平等于通过KCC2的最大电流值。纳⁺和K⁺通过NKCC1的电流为我_氯，NKCC1因此，通过NKCC1的净电流等于零。

最后，在一些模拟中，我们还对Cl进行了建模⁻/HCO公司_三 ⁻交换剂普遍存在于神经元中，均匀分布于细胞膜上。换热器的动力学由以下简化方程描述。

哪里最大ICl =  0.1毫安/厘米²和Vhalf公司设置为50 mV。HCO3^-和Cl^-通过交换器的电流振幅相等，但方向相反，因此交换过程是电中性的。

碳酸氢盐和pH值管理

自HCO以来_三 ⁻离子也流经GABA_A类R通道（见上文），对离子通量和调节[HCO的反应进行建模很重要_三 ⁻]. 细胞内HCO_三 ⁻通过GABA输出通量引起的损失_A类R由碳酸酐酶催化反应进行补偿 [3],[44],[56],[74]由于CO的扩散₂气体通过膜的速度比离子通量通过通道的速度快，我们处理了pCO₂作为常量。反应的平衡常数为10^−6.35M和CO的速率常数₂水合作用为10⁶秒⁻¹ [75]由于上述反应会导致pH值下降[42],[44],[56]通过引起细胞内H⁺积累，我们还模拟了H⁺和主要缓冲离子H₂人事军官₄ ⁻这样H⁺通过反应发生缓冲虽然其他反应在pH缓冲中起着重要作用，但我们保持模型尽可能简单，同时保持pH缓冲容量的全局值，估计为25–30 mMol/pHU[76],[77]缓冲反应负责在短时间尺度（～100 ms）下保持pH值恒定，但通过交换器的质子挤压在较长时间尺度（>10 s）上起着重要作用。为了简单起见，我们仅限于对Na进行建模⁺-H（H）⁺质子通量由

这是运输公司的通用方案。我们使用我_{H、 最大值} =  0.03毫安/厘米²和V_一半 =  10 mV。选择这些值是为了使模型与健康神经元的总质子挤压速率一致，该速率已被测量为0.04 pHU/s[78]–[80].

电扩散

该模型的一个重要且新颖的特点是，K的胞内和胞外浓度⁺，纳⁺，钙²⁺，氯⁻、HCO_三 ⁻以及细胞内H浓度⁺、HPO₄ ²⁻和H₂人事军官₄ ⁻被视为在每个时间步每个隔室中更新的动态变量。每个隔室被划分为四个同心环形小室，以解释径向扩散。假设扩散系数与水中相同（10⁻⁵厘米²/s） ：Cl为2.03⁻，钠1.33⁺，1.96表示K⁺和9.33（H）⁺ [81].纵向电扩散由方程式描述哪里年代表纵轴，D类 _x个关于离子种类的扩散系数x个,音量用于截面体积和冲浪用于横截面的表面[66]第一项是由纯扩散引起的，而第二项是由作用在离子上的电场引起的。第二项仅用于计算树枝状截面外环之间的电扩散，内环设置为0，这与电场仅延伸到膜附近的薄区域的事实一致。这是因为薄膜起到了电容器的作用，电场会迅速减小[82]。径向扩散的计算方法类似，但使用年表示径向轴。

细胞外空间表示为一个薄壳（即Frankenhaeuser-Hodgkin或FH空间），其等效体积等于相应细胞室细胞内体积的四分之一。FH空间的内表面与相邻的细胞内隔间连通，而外表面与无限大的蓄水池相连，其中假设离子浓度恒定。该建模考虑了[K中的变化⁺]_o（o）仅由于我们的单元格，因此不处理[K中的更改⁺]_o（o）由于网络活动。对这种网络相关效应的研究超出了当前研究的范围。用于更新细胞外离子浓度的方程式如下所示哪里z（z）是离子价，k个_洗澡是离子的浓度x个在无限水库和τ_FH公司时间常数为100 ms[79],[83].

数值方法

微分方程采用向前欧拉方法进行积分，时间步长为0.05 ms。一些初步模拟表明，该时间步长对于精确的方程求解来说足够小，而对于合理快速的计算来说足够大。初始细胞内浓度为（mM）：[Cl⁻]_我 = 6，[克⁺]_我 = 140，[纳⁺]_我 = 10，[六氯环己烷_三 ⁻]_我 = 15[高₂人事军官₄ ⁻]_我 = 30和[HPO₄ ²⁻]_我 = 30.初始细胞外浓度单位为（mM）[Cl⁻]_o（o） = 120，[K⁺]_o（o） = 3，[Na⁺]_o（o） = 45和[HCO_三 ⁻]_o（o） = 25[81]进行了初步模拟，以确定初始浓度，使其在正常条件下稳定（在没有高频突触输入的情况下）。对于最大Cl值的模拟⁻通过KCC2的电流(我_{氯、氯化钾})与上述正常情况不同(我_{Cl，最大值} = 0.3毫安/厘米²)，[Cl的不同初始值⁻]_我根据初步测试确定，用于在接近稳态时启动模拟。除非另有说明，否则模拟运行时间为200 s，短到足以进行可管理的模拟，长到足以收集足够大的数据样本，以确保平均值的相关性。

细胞培养

如前所述，从Sprague-Dawley大鼠分离海马神经元[84]在P0至P2处电镀，密度约为500–600个电池/mm²并在体外21–30天后进行成像（DIV）。用Ara-C在5 DIV时阻止胶质细胞增殖。

氯化物成像

将细胞装入5 mM的Cl溶液中⁻指示器MQAE(N个-6-甲氧基喹啉乙酰乙酯；分子探针）在37°C下保持30分钟[85]在观察之前，将细胞转移到灌注室，并在含有100 NaCl、2.5 KCl、1 NaH的碳酸氢盐缓冲盐水中浸泡₂人事军官₄，26氯化钠_三，1氯化镁₂和1.2氯化钙₂如结果部分所述，选择性地添加麝香醇（100µM，Tocris）、速尿（50-200µM（Sigma））、红藻氨酸（50 nM，Tochris）、VU 0240551（25-50µM，Tocrus）和荷包牡丹碱（100µ）。在加入药物后，细胞被允许调整10–20分钟，然后才得到其Cl的稳态图像⁻内容已拍摄。

使用Becker&Hickl SPC-830模块与蔡司LSM 510显微镜耦合，获得MQAE的荧光寿命图像。MQAE通过一个40倍的水浸物镜（蔡司，0.8 NA），使用调谐为760 nm的飞秒脉冲Ti-Sapphire激光器（Chameleon Ultra，相干）激发。荧光寿命数据通过显微镜的非去扫描端口收集，使用带通滤波器（469/35 nm，Semrock）耦合到激光块（短通750 nm；Semroce）。使用PMC-100-1光电传感器（滨松）检测光子发射。使用SPCImage软件（Becker&Hickl）计算并提取每个细胞室的寿命。在不包括细胞核区域的整个细胞体区域内，细胞体的平均寿命是平均的，而在树突中，树突长度超过120µm时，平均寿命为4µm。使用荧光寿命测量是因为它们对我们使用的范围内的染料浓度（峰值强度）不敏感[85],[86]因此，寿命测量不受不同细胞的染料负载差异或不同细胞隔室中可能发生的体积变化的影响(图2A). Cl公司⁻MQAE寿命的依赖性由Stern-Volmer关系（τ₀/τ=1+Ksv[Cl⁻]_我)，式中τ₀是荧光寿命，单位为0 mM Cl⁻和Ksv，Stern-Volmer常数，是Cl的量度⁻MQAE敏感性(图2B).

电池中的氯化物校准

用于校准绝对Cl⁻在不同已知细胞外[Cl⁻]（8、15或20 mM）。消散Cl⁻跨膜梯度，20µM三丁基锡（Cl⁻-使用OH交换器）和20µM黑精（K⁺-H（H）⁺添加交换器）以使用高K来钳制细胞内pH值⁺Cl时的驱动力⁻变化。含有KCl和KNO的校准溶液（单位：mM）_三（140 K⁺合计所需量Cl⁻)，10 D-葡萄糖，10 HEPES，1.2 CaCl₂，1氯化镁₂，使用KOH将pH调节至7.2。

免疫细胞化学

原代海马培养物（5和28 DIV）用4%的多聚甲醛固定10分钟，然后用0.2%的triton在10%正常山羊血清（NGS）中渗透45分钟。使用KCC2多克隆标记物（兔抗KCC2 1∶500，Upstate）在5%NGS存在下在4°C下进行一级抗体孵育过夜。在室温下应用Alexa 546结合二级抗体（1∶750；Invitrogen、Eugene、OR）2小时。使用63X/1.4NA油物镜（蔡司）在蔡司LSM 510显微镜上获得图像。

空间强度分布分析（SpIDA）

SpIDA是最近开发的一种分析方法，它可以通过拟合其强度直方图来解析单个荧光图像中不同单体和低聚物标签混合物的浓度。技术和探测器校准的详细信息见[33]简而言之，密度系统的强度直方图拟合函数属于N颗粒为：

在哪里？具有 _.我(第页)是激发激光的照明强度分布，ε表示单个荧光粒子的量子亮度，以及k个是观察到强度光的数量（假设与发射的光子数量成比例）。H（H）对所有强度值进行归一化，因此k个给出了一个。一个常数，A类引入了，这是图像中荧光粒子分布的分析区域中的像素数。这允许进行图像强度直方图拟合。拟合了三个参数：像素数(A类)，荧光粒子密度(N个粒子/激光束有效焦距）和量子亮度（ε强度单位，iu，每单位像素积分时间）。在共焦激光扫描显微镜中，使用光子倍增管（PMT）测量荧光强度，收集的光电子数是偏振电压的函数。

如果样品中存在二聚体，它们将产生2ε的量子亮度。当单体和二聚体种群在空间的同一区域内混合时，总直方图成为两个单独分布的卷积：

为了获得准确的结果，还必须研究探测器的噪声特性，并在分析中加以考虑，请参见[33]进行完整分析。

对于每个样品，选择最佳的激光功率和PMT电压设置，以最小化像素饱和度和光漂白。所有样品和对照品的CLSM设置保持不变（激光功率、滤波器、分色镜、极化电压、扫描速度）。采集参数始终设置在通过校准确定的探测器线性范围内[33]所有图像均为1024×1024像素，像素大小为0.115µm，像素驻留时间为9.1µs。z堆叠是通过光学切片获得的z（z）每幅图像0.5µm的步长。