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神经科学杂志。2010年8月4日；30(31): 10484–10492.
数字对象标识：10.1523/j欧洲科学.4721-09.2010
预防性维修识别码：项目经理2935844
尼姆斯：美国国立卫生研究院225966
PMID：20685991

Notch1是维持成年海马干细胞贮存所必需的

杰西卡·阿布尔斯,1 内森·德卡罗利斯,1 马德琳·约翰逊,1 菲利普·里维拉,1 郑良高,2 唐·库珀,三 弗雷迪·拉德克,4 谢珍妮,2和阿米莉亚·J·埃希通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Notch1在发育过程中调节神经干细胞（NSC）数量，但其在成人神经发生中的作用尚不清楚。我们生成了nestin-CreERT2段/R26R-YFP/槽口1液氧磷/液氧磷【Notch1诱导敲除（iKO）】小鼠允许三苯氧胺（TAM）诱导Notch1消除，并在成年海马颗粒下区（SGZ）巢蛋白表达的1型NSC及其子代中同时表达黄色荧光蛋白（YFP）。与之前的研究一致，野生型（WT）小鼠（nestin-CreER）颗粒下区（SGZ）中可见神经发生各阶段的YFP+细胞T2段/R26R-YFP/槽口1宽/宽)三苯氧胺（TAM后）后，产生成年生成的YFP+齿状回神经元。与WT同窝小鼠相比，Notch1 iKO小鼠TAM后13天和30天的SGZ YFP+细胞总数相似，但TAM后60天和90天的SGZ-YFP+细胞明显较少。在Notch1 iKO小鼠中，YFP+1型神经干细胞和瞬时扩增祖细胞（TAP）显著减少，导致YFP+颗粒神经元生成减少。令人惊讶的是，30天的跑步弥补了这一不足，因为Notch iKO小鼠的YFP+细胞总数与WT水平相当。考虑到1型NSC和TAP水库的持续赤字，这一点更为显著。我们的数据表明，Notch1信号传导是维持未分化细胞库和确保成年海马神经发生的连续性所必需的，但选择性的Notch和1型NSC非依赖性通路会对体力活动进行补偿。这些数据揭示了1型神经干细胞、成人神经发生、神经原生态位和环境刺激之间的复杂关系。

介绍

哺乳动物齿状回颗粒下区（SGZ）的神经发生贯穿成年期(Lagace等人，2007年;Imayoshi等人，2008年)与情绪和海马功能有关(Doetsch和Hen，2005年;Ming和Song，2005年). 成人神经发生是动态的，被认为由一系列阶段组成：表达巢蛋白的神经干细胞（NSCs）和瞬时扩增祖细胞（TAPs）的增殖，表达双皮质素（DCX）的神经母细胞的成熟，以及最终整合到海马回路中的成年神经元的存活(Kempermann等人，2004年;Duan等人，2008年). 每个阶段都受到各种内在和外在因素的离散调节，而无数刺激（如体育活动）对成人SGZ神经发生的调节是深入研究的重点(Eisch等人，2008年;赵等，2008). 然而，需要更多关于调节体内NSC、TAP和神经源性微环境或“神经源性生态位”之间的相互作用(Basak和Taylor，2009年).

Notch1是一种膜栓系转录因子，理想的位置是整合来自生态位的线索来调节神经发生的各个阶段(Artavanis-Tsakonas等人，1999年;Radtke等人，2005年;Yoon和Gaiano，2005年;Androutsellis-Theotokis等人，2006年;Johnson等人，2009年). 作为对邻近细胞表面信号的响应，Notch1控制胚胎神经干细胞的自我更新和命运(Yoon和Gaiano，2005年;Corbin等人，2008年). Notch1还促进出生后大脑中GFAP+NSC的放射状胶质样特性，并负向调节细胞周期退出和神经元分化(Breunig等人，2007年;Favaro等人，2009年). 然而，成年SGZ巢蛋白+1型NSC中Notch1信号受损的长期后果尚不清楚。与Notch信号也可以调节神经发生以应对刺激的想法一致，最近的研究表明，缺血诱导的神经发生变化依赖于Notch1(Carlén等人，2009年;Wang等人，2009年). 最近一项使用Hes5-GFP报告员的研究发现，Notch反应干细胞对各种刺激的反应不同(Lugert等人，2010年). 然而，目前还没有对Notch1、成人神经发生和体力活动之间的因果关系进行直接研究。

我们假设Notch1信号对基础和运动诱导的SGZ神经发生都至关重要。为了解决这个问题，我们生成了nestin-CreERT2段/R26R-YFP/槽口1液氧磷/液氧磷[Notch1诱导敲除（iKO）]小鼠。三苯氧胺（TAM）诱导的重组使我们能够从巢蛋白表达的1型NSC及其后代中清除Notch1，并通过黄色荧光蛋白（YFP）追踪重组细胞。我们在3个月的基础和运行条件下评估了成年野生型（WT）和Notch1 iKO小鼠SGZ中YFP+细胞数量、增殖、分化和细胞死亡。我们发现Notch1是维持成年海马干细胞和祖细胞以及成年神经发生连续性所必需的。我们进一步表明，尽管神经干细胞持续丢失，但体力活动使神经发生缺陷正常化。

材料和方法

Notch1 iKO小鼠。

小鼠被安置在UT Southwestern经ALAAC批准的设施中，光/暗循环12小时。所有程序和饲养均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》。Nestin CreER公司T2段和R26R-YFP小鼠(Lagace等人，2007年)维持在C57BL/6J背景下的小鼠与漂浮的Notch1小鼠杂交(Radtke等人，1999年)维持在ICR（CD1）背景下，以产生可存活且发育正常的成年巢蛋白核心T2段/R26R-YFP/缺口宽/宽（WT）和嵌套核心T2段/R26R-YFP/槽口1液氧磷/液氧磷（Notch iKO）室友。小鼠的基因分型如前所述(Radtke等人，1999年;Lagace等人，2007年). WT和Notch1 iKO小鼠（4-5周龄，雄性和雌性）每天接受TAM，持续6天（180 mg/kg i.p.，30 mg/ml，加入10%EtOH/葵花籽油，Sigma-Aldrich）。只对F3杂交后代进行了检测，以控制不同背景的基因剂量，并确保所有同窝婴儿都是杂合的cre公司和yfp公司并且仅对漂浮的Notch1等位基因发生变化（观察到适当的孟德尔比率）。这一点很重要，因为跑步活动和神经发生都高度依赖于应变(Kempermann等人，2006年;Pietropaolo等人，2008年;Bednarzyk等人，2009年)，并将Cre和/或YFP介导的毒性降至最低(Imayoshi等人，2006年).

自愿体育活动。

老鼠被单独关在改良过的笼子里，笼子上有一个锁着的（无法转动）或打开的轮子（Coulbourn Instruments）。监测革命，并使用ClockLab（ActiMetrics软件）分析活动。在锁定车轮上的小鼠（笼子尺寸=13×31.8×13.7cm）和幼稚组内的小鼠（12.7×28.3×17.5cm）的任何测量值之间均无统计学差异，因此将这些非跑步组的数据合并并与跑步组进行比较。

组织制备和免疫组织化学。

在最后一次注射TAM后的13、30、60或90天，处死小鼠并进行灌流，并按照前面所述准备脑切片(Donovan等人，2006年;Lagace等人，2007年). 采用滑动安装（SM）或自由浮动（FF）进行染色(Lagace等人，2007年;Donovan等人，2008年)使用以下主要抗体：兔多克隆抗GFP（1:3000 SM；Invitrogen，目录号A11122）、鸡多克隆抗-GFP（1:500 SM，1:100000 FF，Aves Labs，目录号GFP-1020）、兔单克隆抗Ki67（1:500 SMS，Lab Vision/NeoMarkers，Thermo Fisher Scientific，目录号RM-9106-S），兔多克隆抗裂解胱天蛋白酶-3（AC3，1:500 SM，Cell Signal，目录#9661），山羊多克隆抗DCX（1:100 SM，1:5000 FF；Santa Cruz Biotechnology，目录#sc-8066），兔抗S100β（1:2000 FF，Swant，目录#37-a），小鼠抗GFAP（1:2500 FF，Millipore，目录#MAB360），小鼠抗NeuN（1:1000 FF，Millipore，目录#MAB377）。

对于SM IHC，将切片安装在载玻片上，并在0.01米柠檬酸（pH 6.0，100°C）15分钟，用于抗原回收。对于AC3，在0.1%氯化钙中的0.1%胰蛋白酶中进行额外渗透20.1英寸米Tris 10 min后，2N HCl在1×TBS中培养30 min。用封闭溶液（3%正常驴血清，0.3%Triton X-100在1×TB中）培养玻片≥20 min，然后在RT中培养载体中的一级抗体（3%正常驴血，0.3%吐温20在1×TSB中）过夜。DCX、Ki67、AC3的抗体染色，使用物种特异性荧光团结合二级抗体（1×TBS、Cy2、Cy3和Cy5中1:200，Jackson ImmunoResearch）发现鸡抗GFP。为了对YFP+细胞进行定量和形态学评估，用兔抗GFP对载玻片进行染色，并用生物素化二级抗体（1:200 in 1×TBS，Jackson ImmunoResearch）进行检测，并使用ABC Elite试剂盒（Vector Laboratories，目录号PK-6100）进行扩增并使用TSA Renaissance荧光扩增试剂盒（1:50，PerkinElmer Life Sciences，目录号NEL701）进行展示。内源过氧化物酶活性在0.3%H中猝灭2O（运行）2在ABC和TSA之前保持30分钟。所有切片在脱水并用DPX覆盖之前用DAPI（1:5000，罗氏应用科学，目录号236276）进行复染（Sigma-Aldrich，目录号44581）。遗漏初级或次级抗体不会导致染色，并作为阴性对照。

为了让FF IHC评估YFP/S100β/GFAP或YFP/DCX/NeuN的共定位，首先用鸡抗GFP抗体鉴定YFP，然后对其他抗原进行染色。鸡抗GFP和山羊抗DCX染色时，切片在改良封闭液（3%正常驴血清、0.3%Triton X-100、2%ABC Elite试剂盒试剂A，1×TBS）中孵育≥20分钟，然后在改良载体（3%正常驴血、0.3%吐温20、2%ABC精英试剂盒试剂B，1×TB）中培养一级抗体RT过夜。切片在1%H中孵育2O（运行）230分钟，在1×TBS中洗涤4×5分钟，然后在RT中与生物素化二级抗体（1:200，在1.5%的正常驴血清中，在1 x TBS中）孵育4～6小时，洗涤，用ABC Elite试剂盒扩增1小时，洗涤4×10分钟，用TSA Renaissance荧光扩增试剂盒显色12分钟。使用物种特异性荧光团结合二级抗体（1×TBS中1.5%的正常驴血清中1:200）在RT时对NeuN、GFAP和S100β进行抗体染色，染色时间为4-6小时。所有染色完成后，用DAPI对切片进行复染20分钟，清洗，贴在不带电的载玻片上，并用DPX覆盖。

免疫反应细胞分析。

如前所述，使用奥林巴斯BX-51显微镜（400×）进行量化(Mandyam等人，2004年;Donovan等人，2006年;Lagace等人，2007年,2008,2010). 简单地说，一名对实验组视而不见的观察者通过光学分馏器方法，在整个齿状回的每九个冠状断面（距角-0.82 mm至-4.24 mm）中计数SGZ中的免疫反应细胞。通过光学分馏器方法，由对实验组盲的观察者对具有1型NSC或神经元形态的YFP+SGZ细胞和YFP+SBZ细胞进行类似的定量。YFP+1型NSC或YFP+神经元的比例通过将具有任一形态的YFP+细胞数量除以YFP+总细胞数量来确定(Donovan等人，2008年;Imayoshi等人，2008年). 对于表型和树突状形态分析，通过使用蔡司Axiover 200/LSM510共焦显微镜（发射波长488、543和633、630×）在三重免疫荧光标记切片的Z平面上扫描和光学切片来确定信号的共定位。对于表型分析，每只动物100–150个YFP+细胞(n个每组≥3个），通过将YFP+细胞总数乘以每只动物表达标记物的比例，计算Ki67或DCX免疫反应的YFP+阳性细胞总数。为了进行树突状分析，将DCX+YFP+细胞的Z堆叠以及延伸至GCL的过程导入到Neurouscida（版本8，MicroBrightField）中，以获得神经元（3–15个细胞/只动物，n个=每组3人），然后进行Sholl分析(Breunig等人，2007年;Dahlhaus等人，2008年). 统计显著性通常通过单因素或双因素方差分析确定，其次是Bonferroni事后（post-hoc），中提供了详细的统计信息表2（见下文）和补充表1（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

表2。

统计结果和数值分析

数量图互动方差分析统计第页价值
YFP+细胞总数1c（c）基因型×时间F类(3,52)= 9.55第页< 0.0001
YFP+1类NSC2e（电子）基因型×时间F类(3,41)= 3.08第页= 0.04
YFP+Ki67+DCX−电池2（f）基因型×时间F类(3,26)= 1.74第页=纳秒
基因型F类(1,26)= 7.92第页= 0.009
YFP+Ki67+DCX+电池2克基因型×时间F类(3,28)= 4.79第页= 0.008
YFP+Ki67−DCX+电池2小时基因型×时间F类(3,26)= 6.29第页= 0.002
YFP+神经元2我基因型×时间F类(3,35)= 3.06第页= 0.04
YFP+Ki67+细胞2j个基因型×时间F类(3,19)= 8.66第页= 0.0008
YFP+DCX+电池2k个基因型×时间F类(3,19)= 10.62第页= 0.0003
AC3+电池总数2我基因型×时间F类(3,31)= 1.07第页=纳秒
YFP+GFAP+细胞S-1号机组一不适用，学生的t吨测试—第页= 0.05
YFP+1类NSCS-1号机组一不适用，学生的t吨测试—第页= 0.01
YFP+NeuN+细胞S-1号机组d日不适用，学生的t吨测试—第页= 0.04
YFP+神经元S-1号机组d日不适用，学生的t吨测试—第页= 0.02
YFP+DCX+树枝晶/YFP+DCX+胞体三一不适用，学生的t吨测试—第页=纳秒
十字路口三b条基因型×半径F类(43,1763)= 3.07第页< 0.0001
次级神经球4一不适用，学生的t吨测试—第页= 0.0009
车轮转数5一基因型×天F类(29,290)= 1.13第页=纳秒
YFP+电池总计−重量S-5系列一住房状况F类(2,13)= 4.14第页= 0.04
YFP+细胞总数−iKOS-5系列b条住房状况F类(2,14)= 11.52第页= 0.02
YFP+细胞总数5c（c）基因型×运行F类(1,27)= 4.41第页= 0.045
YFP+1类NSC6一基因型×运行F类(1,26)= 0.34第页=纳秒
YFP+Ki67+DCX−电池6b条基因型×运行F类(1,19)= 0.04第页=纳秒
YFP+Ki67+DCX+电池6c（c）基因型×运行F类(1,20)= 5.90第页= 0.02
YFP+Ki67−DCX+电池6d日基因型×运行F类(1,19)= 0.60第页=纳秒
正在运行F类(1,19)= 23.87第页< 0.0001
YFP+Ki67+细胞6e（电子）基因型×运行F类(1,21)= 7.59第页= 0.012
YFP+DCX+电池6（f）基因型×运行F类(1,21)= 1.73第页=纳秒
正在运行F类(1,21)= 21.15第页= 0.0002

N/A，不适用；S-，补充图（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

神经圈隔离。

如前所述，从脑室下区分离出神经球(布鲁尔和托里切利，2007年)TAM后40天的小鼠。简单地说，将两个WT或Notch1 iKO小鼠的解剖标本汇集在一起，在37°C下酶解40分钟，然后以相同密度（10个细胞/μl）进行电镀。将神经球保存在补充有N2、B27、bFGF、EGF和肝素的无血清培养基中，并使用胰蛋白酶-EDTA在融合时传代（每隔7–10天）。在汇合处（电镀后7天）使用1 mm网格皿对次级球体进行计数。从第4代神经球中分离出基因组DNA，并使用正向引物5′-ctg act tag tag ggg gaa aac和反向引物5’-tac tcc gac acc caa tac ct PCR确认基因组重组。

结果

Notch1 iKO小鼠的产生

为了靶向成年海马巢蛋白表达细胞的Notch1信号的破坏，我们制造了Notch1-iKO小鼠。TAM给药诱导WT和iKO小鼠中YFP的表达，以及启动子和第一外显子的消除槽口1来自iKO小鼠巢蛋白表达祖细胞(图1一,b条). YFP+细胞呈现出与SGZ神经发生阶段一致的形态和表型。YFP+星形胶质细胞（S100β+）和少突胶质细胞在齿状回极为罕见，这与我们之前的发现一致，即SGZ中表达巢蛋白的细胞的后代主要是神经元(Lagace等人，2007年).

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Notch1 iKO小鼠在SGZ中的YFP+细胞较少。一、雀巢CreERT2段和R26R-YFP小鼠与漂浮的Notch1小鼠杂交产生Notch1 iKO小鼠。大部分老鼠巢穴基因驱动Cre重组酶和修饰雌激素受体（CreER）融合蛋白的表达T2段). 服用三苯氧胺（TAM）导致启动子和槽口1和R26R-YFP的“停止”信号。这导致Notch1的消除以及巢蛋白表达细胞及其后代中YFP的表达。b条，TAM后40天分离的神经球PCR证实槽口1该基因在Notch1 iKO小鼠TAM后重组，但未在WT同窝小鼠中重组。底漆（如中箭头所示一)是针对牙线部分以外的区域设计的槽口1.c（c）WT和Notch1 iKO小鼠中的YFP+SGZ细胞。d日，YFP+SGZ小区号**第页< 0.01, ***第页<0.001 vs WT，Bonferroni事后（post-hoc）;n个=5–11/组。比例尺：(c（c）)，50微米。

成年Notch1 iKO小鼠SGZ YFP+细胞较少

为了确定巢蛋白表达的1型神经干细胞及其后代的Notch1消融对成年SGZ神经发生的影响，我们评估了WT和Notch1 iKO小鼠中YFP+细胞的数量。定性而言，Notch1 iKO小鼠在TAM后60和90天的YFP+细胞较少(图1c（c）). 定量评估证实，如前所示，WT小鼠中YFP+细胞的数量随着时间的推移而增加(Lagace等人，2007年)，但不适用于Notch1 iKO小鼠(图1d日)表明Notch1对成人SGZ细胞的连续生成是必要的。

Notch1 iKO小鼠中YFP+SGZ 1型NSC和TAP减少

为了评估巢蛋白表达细胞中Notch1消除对哪些神经发生阶段的影响，根据IHC标记物的表达将YFP+SGZ细胞分为不同类别(图2一,表1) (Kempermann等人，2004年). YFP+TAP（Ki67+DCX-）、增殖神经母细胞（Ki67+DCX+）和有丝分裂后未成熟神经元（Ki67-DCX+）在WT和iKO小鼠中都很明显。YFP+1型神经干细胞(图2b条)和成熟神经元(图2d日)根据先前报道的独特形态进行鉴定(Lagace等人，2007年). 使用形态学标准或表型标记获得了类似的结果（补充图1a–f，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。TAM后早期，WT和iKO小鼠的YFP+细胞数量或表型分布没有差异。虽然WT小鼠中YFP+1型神经干细胞的数量保持不变，但iKO窝友TAM后≥60天标记的神经干细胞数量显著减少(图2e（电子）)，通过YFP+GFAP+S100β−NSC的量化证实了这一点（补充图1a–c，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。Notch1 iKO小鼠的TAP少于WT小鼠(图2（f）)TAM后≥60天，YFP+成神经细胞显著减少(图2克)，未成熟神经元(图2小时)和成熟神经元(图2我)在iKO小鼠中，后一结果通过YFP+NeuN+神经元的量化得到证实（补充图1d–f日，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。有趣的是，虽然我们发现Notch iKO小鼠产生的YFP+细胞数量与WT同窝小鼠相比存在显著差异(表2)，我们发现生成的细胞类型比例没有差异（补充图1克–克，补充表1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），表明YFP+细胞在Notch1 iKO小鼠中的命运没有受到影响。然而，我们确实发现Notch1 iKO小鼠的增殖细胞比例降低（补充图1j个，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。与增殖减少一致，我们发现Notch1 iKO小鼠细胞周期中的细胞更少(图2j个). 此外，iKO小鼠的Ki67+细胞没有扩张，导致Notch1 iKO鼠的峰值提前，神经发生减少(图2k个). 我们确定这些细胞数量的差异不是由于细胞凋亡增加引起的(图2我). 先前的报道表明，Notch1也调节成年神经元的树突形态(Breunig等人，2007年). 虽然我们发现不同基因型之间的分枝数量没有差异(图3一)，Sholl分析显示Notch1 iKO小鼠YFP+Ki67−DCX+未成熟神经元中的树突树较小(图3b条,c（c）). 总之，这些数据表明，从巢蛋白表达细胞及其子代中去除Notch1后，在不影响细胞命运的情况下，在神经发生的所有阶段都减少了YFP+细胞的数量，减少了TAPs的比例而不改变细胞死亡，并减少了未成熟神经元树突树的大小体内.

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从巢蛋白表达细胞中去除Notch1会减少YFP+SGZ NSC数量和神经发生。一，YFP+SGZ细胞在神经发生的各个阶段表达标记物。b条，YFP+GFAP+S100β−1型NSC（箭头）。c（c）、YFP+Ki67+DCX−（箭头）和YFP+Ki67−DCX+（箭头）单元格。d日，YFP+NeuN+神经元（YFP+NeuN−细胞，箭头）。e（电子），Notch1 iKO小鼠在TAM后延长时间内的1型NSC显著减少。（f），无论TAM后的时间长短，Notch1 iKO小鼠中的TAP（YFP+Ki67+DCX−细胞）较少。克在TAM后60天，Notch1 iKO小鼠的成神经细胞（YFP+Ki67+DCX+细胞）显著减少。小时在TAM后延长时间，Notch1 iKO小鼠的未成熟神经元（YFP+Ki67−DCX+细胞）显著减少。我在TAM后延长时间，Notch1 iKO小鼠的YFP+神经元显著减少。j个在TAM后延长时间，Notch1 iKO小鼠的增殖（Ki67+）YFP+细胞显著减少。k个TAM后延长时间，Notch1 iKO小鼠中成为神经元的YFP+细胞（DCX+）数量显著减少。我与WT同窝小鼠相比，Notch1 iKO小鼠SGZ中的细胞凋亡没有增加*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001 vs WT，Bonferroni事后（post-hoc）;n个=3–7/组。比例尺：(b–d段,我)，20微米。

表1。

神经发生阶段SGZ细胞的分类标准

单元格类型形态学Ki67免疫反应DCX免疫反应
国家安全委员会三角体，通过GCL的单个投射，一簇非常精细的突起终止于内分子层很少呈阳性否定
TAP接头体不规则，无突起积极的否定
成神经细胞不规则体，无/小突起积极的积极的
未成熟神经元圆形胞体，过程通过GCL延伸否定积极的
神经元圆形胞体，通过GCL投射，完整的树突树延伸到整个分子层否定否定
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Notch1 iKO小鼠的树突状形态学下降。一在TAM后90天，两种基因型在SGZ的YFP+DCX+细胞中每个细胞体的树突数量没有差异。b条，对YFP+DCX+细胞的Sholl分析显示Notch1 iKO小鼠的树突状交叉明显较少，特别是在960–1060μm的半径范围内。c（c），代表性YFP+DCX+神经元追踪*第页<0.05 vs WT、Bonferroni事后（post-hoc）;n个=3–4/组。

与消除Notch1后1型神经干细胞和祖细胞的下降一致体内(图2)，从成年Notch1 iKO小鼠分离的神经干细胞生成的次级神经球减少70%在体外与WT室友相比(图4一). 虽然来自WT小鼠的神经球可以持续传代，但来自Notch1 iKO小鼠的神经球不能持续传代(图4b条). 因此，Notch1对于成年SGZ中巢蛋白表达细胞的扩张和自我更新是必要的体内和在体外.

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从表示嵌套的1型NSC中消除Notch1体内减少神经圈形成在体外.一，从WT和Notch1 iKO小鼠脑室下区TAM后40天分离的细胞形成的二级球体数量。b条，WT和Notch1 iKO小鼠第6代神经球的代表性显微照片。比例尺，100μm*第页< 0.05,t吨测试；n个=每组3–4次重复。

跑步可以拯救Notch1 iKO小鼠的YFP+神经发生，但不能拯救1型NSC或TAP

鉴于体力活动能有效刺激海马神经发生(van Praag等人，1999b;Naylor等人，2008年)并特别增加TAP和成神经细胞的增殖(Fabel和Kempermann，2008年)，我们探讨了体力活动是否可以缓解Notch1 iKO小鼠YFP+细胞数量的不足。TAM后30天，WT和Notch1 iKO的同窝仔可以使用转轮30天(图5一). WT和Notch1 iKO小鼠跑了相似的距离，具有相似的跑步模式(图5一). 在单独饲养的带锁定轮子的老鼠和幼稚的群居老鼠之间没有发现统计差异，因此将这些非跑步组的数据合并并与跑步组进行比较。例如，幼稚WT小鼠中的总YFP+细胞与单独用锁轮饲养的WT小鼠没有显著差异（补充图2一,b条，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。而体力活动增加了YFP+细胞总数(图5b条,c（c）)，它未能拯救Notch1 iKO小鼠中的1型NSC或TAP(图6一,b条). 然而，体力活动恢复了扩散(图6e（电子）)和神经发生(图6（f）)特别拯救了YFP+成神经细胞和未成熟神经元细胞数量(图6c（c）,d日; 补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些数据表明，与成神经细胞不同，1型神经干细胞和TAP独特地需要Notch1来调节成年SGZ中的数量。

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体力活动可以挽救Notch1 iKO跑步小鼠的YFP+细胞总数。一从TAM后30天开始，给予动物30天的自由活动时间。WT和Notch1 iKO小鼠在任何一天的活动量没有差异。b条WT和Notch1 iKO非流道和流道中的YFP+SGZ细胞；白盒，1类NSC。c（c），YFP+SGZ细胞总数。比例尺，20μm*第页<0.05 vs WT和‡第页< 0.05,‡‡‡第页<0.001 vs非跑步者，Bonferroni事后（post-hoc）;n个=4–11/组。

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在Notch1 iKO小鼠中，体力活动可以拯救YFP+神经新生，但不能拯救YFP+1型NSC或TAP。一，30天的跑步没有影响YFP+1型NSC的数量。b条，30天的运行不会影响TAP的数量（YFP+Ki67+DCX−细胞）。c（c），Running挽救了Notch1 iKO小鼠的成神经细胞数量（YFP+Ki67+DCX+细胞）。d日，Running挽救了iKO小鼠中未成熟神经元（YFP+Ki67−DCX+细胞）的数量。e（电子），30天的运行足以使Notch1 iKO小鼠中增殖的（Ki67+）YFP+细胞的数量正常化至WT水平。（f），在WT和iKO小鼠中，DCX+YFP+细胞的数量在跑步后均增加。#第页< 0.1, *第页< 0.05, **第页<0.01 vs WT、Bonferroni事后（post-hoc）;n个=3–8/组。

讨论

我们提供了几行证据，证明巢蛋白表达细胞中的Notch1信号在基础条件下维持了成年SGZ中未分化干细胞和祖细胞池的大小。我们发现在我们的诱导转基因小鼠中，从巢蛋白表达细胞中消除Notch1的YFP+SGZ细胞数量较少。虽然iKO小鼠神经发生各阶段的细胞数量减少，但未分化的1型NSC和TAP群体似乎特别容易被Notch1信号消融。随着时间的推移，YFP标记的1型NSC急剧减少，同时TAP也显著减少。细胞数量的减少不太可能是细胞死亡的结果，因为我们没有发现凋亡增加的证据。相反，我们将Notch1 iKO小鼠中NSC和TAP的减少解释为未能自我更新和扩大YFP+种群。最终，NSC和TAP的早熟细胞周期退出导致神经母细胞和未成熟神经元减少，最终导致不含Notch1的YFP+神经元减少50%。除了这些强大的体内研究发现，成年Notch1 iKO小鼠的祖细胞在神经圈测试中自我更新和增殖能力受损在体外，进一步强调Notch1在调节和维持成人干细胞贮存中的重要性。

我们的时间进程研究显著扩展了先前报告的数据，这些报告表明Notch1调节神经干和祖细胞的细胞周期进入和退出(根切夫和麦凯，2006年;Breunig等人，2007年;郭等人，2009;Wang等人，2009年). 基于这些研究和Notch信号的抗分化性质(Yoon和Gaiano，2005年)，我们假设，从巢蛋白表达细胞中去除Notch1将导致YFP+神经元的比例增加，而干细胞和祖细胞的成本增加。令人惊讶的是，WT和Notch1 iKO小鼠在TAM后早期（≤30 d）无法区分，直到后来（≥60 d），我们才发现Notch1 i KO小鼠中的1型NSC和TAP显著减少，细胞周期（Ki67+）中的YFP+细胞更少。我们将这些发现分别解释为干细胞更新减少和细胞周期退出增加，尽管较短和较长的时间点可能揭示Notch1信号的缺失是否迫使1型神经干细胞进入细胞周期并成为TAP(Imayoshi等人，2010年). 然而，与Bruenig及其同事和我们自己的假设相反，我们从未观察到Notch1 iKO小鼠中DCX+的YFP+细胞比例增加。此外，我们没有观察到神经元数量的增加会损害神经干细胞；相反，Notch1 iKO小鼠产生的YFP+神经元总数减少，但与WT小鼠的YFP+神经元数量成比例。总之，这些数据表明，从巢蛋白表达细胞中诱导性去除Notch1后，1型神经干细胞和TAP退出细胞周期，从而阻止祖细胞扩张，减少可成熟为新神经元的YFP+祖细胞数量。重要的是，我们的数据没有证明Notch1在调节巢蛋白表达细胞后代命运中的作用。

Breunig和同事之间的差异以及我们自己的观察结果可能反映了重组干细胞群体的差异(GFAP公司与巢穴)尤其是考虑到Notch信号的上下文相关性质(Poellinger和Lendahl，2008年;Cau和Blader，2009年). 也许在表达GFAP的神经干细胞中，Notch1调节增殖和神经元命运，而在表达巢蛋白的干细胞中，神经元命运可能已经确定(Lagace等人，2007年;Steiner等人，2008年)-Notch1可能只调节增殖。最终，我们的数据和Breunig及其同事的数据都支持Notch1是维持成年SGZ中增殖未分化细胞池所必需的。这些结果强调了诱导性转基因方法的威力，它可以剖析多功能蛋白（如Notch1）在动态、复杂和环境相关的生理过程（如神经发生）中的作用。

根据Notch1 iKO小鼠增殖下降的观察结果，我们假设运动可以挽救祖细胞的缺陷，运动是成年SGZ中最有效的神经发生诱导剂之一(van Praag等人，1999a;范普拉格，2008). 跑步可以增加TAP和成神经细胞的增殖活性和数量，但增殖活性或1型NSC的数量没有明显变化(Kronenberg等人，2003年;Suh等人，2007年;Lugert等人，2010年). 令人惊讶的是，我们发现跑步可以增加Notch1 iKO小鼠的成神经细胞增殖并挽救神经新生，尽管1型NSC和TAP池中都存在持续的缺陷。因此，虽然Notch1对维持未分化祖细胞至关重要，但Notch1缺陷本身并不能抑制身体活动依赖性神经发生(图7). 一种解释是，1型神经干细胞对跑步诱导的扩散是不必要的，这与上述报告一致，即神经干细胞在跑步后会适度增殖（如果有的话）。然而，与最近的研究结果相反，通常对跑步反应的巢蛋白+TAP可能需要Notch1信号留在细胞周期中(Lugert等人，2010年). 或者，剩余的缺乏Notch1的YFP+神经母细胞可能对运行和增殖反应过度，以克服祖细胞的缺陷。也许运动诱导神经发生所必需的神经营养因子和神经原生态位成分，如BDNF、VEGF、β-内啡肽和/或内源性大麻素，在没有Notch1信号的情况下足以增加成神经细胞增殖(Fabel等人，2003年;Kitamura等人，2003年;Björnebekk等人，2005年;Koehl等人，2008年;Hill等人，2010年;Lafenítre等人，2010年). 也有可能，替代途径（例如由GSK3、Shh、Wnt或Sox2介导）可以弥补DCX+分化细胞中Notch1的缺乏，但在未分化的1型NSC或TAP中没有(赫尔布特等人，2007年;Annenkov，2009年;Favaro等人，2009年; D.Chichung Lie，个人沟通）。无论如何，观察到的成神经细胞增殖和YFP+神经元数量的正常化突显了干细胞和祖细胞、神经原生态位和环境刺激之间的复杂相互作用，并鼓励对Notch1如何调节一般成年神经发生，特别是1型神经干细胞进行机制研究。

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提出Notch1在基础条件下和体力活动后调节成人神经发生的模型。如果没有Notch1，巢蛋白表达细胞的自我更新和扩张就会受到破坏，成年产生的齿状回神经元的净数量就会减少。体力活动通过增加成神经细胞增殖，增加WT和Notch1 iKO小鼠成年生成的神经元。然而，在Notch1 iKO小鼠中，体力活动不能挽救1型NSC或TAP数量。

这里提供的数据有几个含义。特别有趣的是，我们观察到跑步可以绕过具有关键细胞后果的遗传损伤（神经祖细胞逐渐耗尽），并且仍然可以使成年神经发生正常化。这些数据强调了在神经发生相关记忆和情绪障碍中进行基于体力活动的治疗的可能性，并鼓励分析我们突变体的突触可塑性和行为。此外，我们对完整Notch1信号在NSC维持中的关键作用的证明，敦促临床谨慎使用γ-分泌酶抑制剂（GSI）治疗阿尔茨海默病和其他疾病。Notch1的激活需要γ-分泌酶裂解，因此GSI也抑制Notch1活性(Geling等人，2002年)和SGZ祖细胞增殖(Breunig等人，2007年). 我们的数据表明，由此产生的Notch1活性抑制可能导致海马神经发生减少，并最终耗尽海马神经干细胞。鉴于阿尔茨海默病模型显示海马神经发生减少(Donovan等人，2006年;赵等，2008;Lazarov和Marr，2010年)我们的结果表明，长期使用广谱GSI治疗可能会加剧阿尔茨海默病的进展。虽然还需要更多的工作来评估GSI对NSC维持的长期影响，但这里提出的诱导模型将有助于阐明成年SGZ中Notch信号的潜在机制，并有助于探索靶向治疗如何抵消与记忆、情绪障碍、，和神经退行性疾病。

脚注

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）——美国国家药物滥用研究所资助A.J.E.（DA023701，DA023555，DA016765）；NIH T32基金（T32 DA007290和MH076690）支持N.A.D.、M.A.J.和J.L.A.的培训。；以及NIH个人培训拨款基金（F31 NS064632），以支持N.A.D.的培训。我们感谢Diane Lagace博士、Scott Russo、Josh Breunig、Euiseok Kim博士以及Eisch实验室成员对该项目及其结果进行的宝贵讨论；Jane Johnson博士治疗小鼠；纽约西奈山医学院Fishburg神经科学系Eric Nestler博士使用共焦显微镜；Kerstin Ure用于神经球解剖；艾莉森·奎斯特、克里希纳·苏里、迈克尔·罗比科、莱多·贝波和阿米娜·伊格提供了卓越的技术援助。J.L.A.设计了该研究，进行了动物繁殖和治疗，分析并记录了YFP与IHC标记物的Notch消除、运行和共定位，并进行了树突状分析和神经圈实验，并撰写了论文。N.A.D.设计了这项研究，确定了TAP、成神经细胞、未成熟神经元分析和树突状追踪研究的免疫组化参数并进行了这些研究，讨论了这些解释，并撰写了手稿。M.A.J.分析并记录了AC3+细胞，并撰写了论文。P.D.R.分析并记录了YFP/Ki67的共定位，并撰写了论文。Z.G.执行并记录了神经圈实验，并撰写了论文。D.C.C.提供了运行轮并撰写了论文。F.R.产生了漂浮的Notch1小鼠。J.H.监督神经圈实验并撰写论文。A.J.E.设计并监督了该研究，讨论了结果，制定了解释，并撰写了论文。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会