慢性淋巴细胞白血病的异常O-GlcNA酰化特征

抗体和试剂

藻红蛋白和FITC-标记的CD19、CD83和肿瘤坏死因子（TNF）α抗体购自Pharmingen（加利福尼亚州旧金山，美国）。N-乙酰氨基葡萄糖、尿苷和佛波醇二丁酸盐来自西格玛（美国密苏里州圣路易斯）。TACE抑制剂TAPI，¹⁰来自肽国际（美国肯塔基州路易斯维尔）。TLR-7激动剂852A，¹¹来自3M制药公司（美国明尼苏达州圣保罗）。OGT抑制剂X1已在前面描述过。¹²白细胞介素-2（加拿大诺华制药公司、加拿大魁北克省多瓦尔市）、干扰素2b（加拿大先灵葆雅公司、美国魁北克州波因特克莱尔市）和硫酸长春新碱（加拿大福鼎市、魁北克市柯克兰市、加拿大）从医院药房购买。

RL2抗体¹³来自AbCam（美国马萨诸塞州剑桥市）。针对天然和磷酸化形式的Syk、Akt、c-Jun N-末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶、IκB和二级辣根过氧化物酶偶联的抗兔和抗小鼠抗体的抗体来自细胞信号技术公司（Beverly，MA，USA）。p53抗体来自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。抗-c-myc和β-actin购自Sigma。识别OGT的OGase和AL-28抗体如前所述升高。^14,15山羊抗人IgM Fc特异性抗体来自Jackson ImmunoResearch Labs（美国宾夕法尼亚州西格罗夫）。

细胞培养和激活

纯化CLL细胞（1.5×10⁶/ml）在AIM-V（GibcoBRL，Grand Island，NY，USA）和2-巯基乙醇（（Sigma）（5×10⁻⁵M） 在6孔或24孔板（Becton Dickinson Labware，Franklin Lake，NJ，USA）中，37°C，5%CO₂为了增加O-GlcNA酰化，用N-乙酰氨基葡萄糖（20 mM）和尿苷（5 mM）培养细胞过夜。¹⁶通过在胚胎干细胞培养基中用白细胞介素-2（100U/ml）和Resiquimod（加拿大安大略省伯灵顿Cedarlane实验室）（0.5μg/ml）激活正常B细胞，制备短期激活的B细胞系¹⁷（D-MEM-F12，15%敲除血清置换，1%100×谷氨酰胺-I（均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根），1%100 x MEM非必需氨基酸（加拿大魁北克州圣布鲁诺市Wisent）和2-巯基乙醇）。每5天，细胞密度重置为5×10⁵细胞/ml，细胞被重新激活。对于中的实验补充图1细胞在852A激活前休息2天，在葡萄糖胺和尿苷中培养过夜或不培养过夜。

膜TNFα（mTNFα）检测与免疫表型分析

这些流式细胞术分析如前所述进行。^8,10

实时PCR

使用RNeasy迷你试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）制备RNA，并根据制造商的说明，使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen）从2μg RNA合成cDNA。使用以下引物扩增GFAT1、GFAT2和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶转录本：GFAT1型正向，5′-GCAA GCAGTTGG CACAAGG-3′；背面，5′-CTCACTGCTTTTC TTCCAC-3′；GFAT2型向前，GGA 5′-GTC CGG AGC AAA TAC AAT-3′；反向，5′-GACCCG GTG AAT GGA GAG T-3′；高效放射治疗正向，5′-GAGGATTTGGAAAGGGTT-3′；背面为5′-ACA ATAGCTCTTCAGTCTGA-3′。聚合酶链反应在DNA引擎光学系统（MJ Research，Waltham，MA，USA）中进行，并在初始变性后（95°C，15分钟）循环34次，参数如下：在94°C下变性20秒，引物在58°C（GFAT1,2）或52°C下退火20秒次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并在72°C下延长20s。GFAT 1和GFAT 2 mRNA的丰度通过标准扩增曲线进行评估，该曲线是在分析起始拷贝数和周期数之间的关系的基础上建立的。从每个样品的两个独立cDNA制备中测定拷贝数。以一个cDNA为靶基因，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶为内标。最终结果表示为目标基因对次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的相对折叠变化。

UDP-GlcNAc测量

从CLL细胞或正常PBMC中提取核苷酸糖（用0.3 M高氯酸，然后用1:4 v/v的三辛胺和1,1,2-三氯三氟乙烷在冰上），在Partisil SAX阴离子交换HPLC柱上分离（4.6×250 mm；美国新泽西州皮斯卡塔韦的Whatman公司），并在80 mm磷酸钾中开发，pH 2.8，35%乙腈。UDP-N-乙酰己糖胺通过在254nm的UV吸附进行定量，并相对于UDP己糖的吸光度进行报告。¹⁶UDP-GlcNAc洗脱时间的参考标准来自Sigma。

免疫印迹和免疫沉淀

新分离的CLL-B细胞或以下不同细胞的蛋白质提取物在体外处理，在放射免疫沉淀分析缓冲液中制备。为了进行免疫沉淀，将100μg总蛋白与RL2抗体在4°C下孵育过夜，然后与UltraLink固定化蛋白g（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德，美国）孵育1h。用磷酸盐缓冲盐水将溶解液-抗体-海藻糖珠混合物洗涤四次。将总蛋白提取物（50μg）或免疫沉淀（200μg）与SDS-PAGE样品缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，2 mM EDTA，10%甘油，2%十二烷基硫酸钠，2%2-巯基乙醇和0.025%溴酚蓝）混合，在1001C下加热5分钟，然后在8%SDS聚丙烯酰胺微凝胶中运行。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（Immobilion，Millipore，Bedford，MA，USA）上。在与一级抗体孵育过夜后，用抗兔或鼠辣根过氧化物酶偶联二级抗体将印迹孵育1h。为了确认O-GlcNAc组分的结合是特异性的，RL2抗体预先与500 mM N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）孵育，在室温下溶解于磷酸吐温缓冲盐水缓冲液中30min，然后进行免疫印迹。用超强信号辣根过氧化物酶增强化学发光试剂（Pierce）检测信号，并将印迹暴露在柯达Biomax MR胶片（Sigma）上。根据制造商的方案进行其他抗体的Western blot分析。

RL2指数的测定

使用Syngene Genius 2 Bioimager（Syngene Frederick，MD，USA）4.00版GeneTools分析软件量化凝胶上所有RL2染色带的总强度，并将其归一化为β-肌动蛋白染色强度。为了控制在不同印迹上比较大量样品时所涉及的实验变化，将该数字再次归一化为从单个CLL患者（患者106）处获得的50μg参考标准品的结果，该患者始终使用每种凝胶。为了进一步控制实验变化，运行了三个单独的凝胶。第二个和第三个印迹参考标准的归一化RL2密度除以第一个印迹参照标准的归一化RL2浓度，并用于乘以在各自凝胶上获得的患者样品的归一化RL2密度。凝胶一的结果与凝胶二和凝胶三的加权结果的平均值称为“RL2指数”。换句话说，

其中n是凝胶数，X（X）_n个是单个患者样本和P106的总RL2染色相对于β-肌动蛋白染色的密度测定值_n个是106号患者RL2总染色相对于β-肌动蛋白染色的密度测定值。

CLL细胞中的OGT靶点

尽管还没有一致的序列可用于生物信息学现场测绘。²⁰其中一些蛋白质在其他系统中鉴定出来，但与CLL相关，包括OGT本身，²⁰p53，²¹c-myc、，²²和Akt。⁵通过免疫沉淀五个不同患者样本中的RL-2结合蛋白，然后用特定抗体进行免疫印迹，这些蛋白在原代CLL细胞中也被发现是O-GlcNAcylated(图1e). 首先用特异性抗体进行免疫沉淀，然后用RL2进行免疫印迹（未显示），证实了这一发现。为了证明RL-2抗体结合O-GlcNAcylated残基，如材料和方法部分所述，在存在0.5 M GlcNAc的情况下重复免疫印迹，反应带消失（未显示）。

免疫受体介导的CLL细胞O-GlcNAc水平升高

中的结果图1提示CLL细胞中己糖途径被激活。激活导致细胞内葡萄糖水平升高的信号通常会导致非造血细胞内己糖途径的流量增加。⁶免疫受体配体，如抗原、细胞因子和TLR激动剂，被认为可以激活增殖中心的CLL细胞。¹因此，在用IL-2和TLR-7/8激动剂刺激CLL细胞后，测定O-GlcNA酰化蛋白水平²³(图2a（左面板）或干扰素-α2b(图2a，右侧面板），并在1小时内增加。这种变化可能是由OGT活性增加或OGase活性降低引起的(图1). 然而，它们被X1抑制(图2b)在小分子库筛选中被鉴定为OGT抑制剂¹²之前显示可防止心肌细胞低氧诱导的O-GlcNA酰化，²⁴提示CLL细胞中O-GlcNA酰化的免疫受体介导的增加是通过OGT实现的。

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图2

免疫受体激动剂和己糖途径底物对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞O-GlcNA酰化的影响。(一)来自基线O-GlcNAc水平相对较低的患者26和111的样本与指示浓度的X1孵育30分钟，然后分别用IL2（100 U/ml）和852A（0.1μg/ml）（左侧）或干扰素-a2b（1000 U/ml，右侧）刺激。1h后制备提取物，并用RL2抗体进行免疫印迹。RL2染色相对于β-肌动蛋白水平的强度通过密度计测定，并显示在每个泳道下方。其他两个样品也获得了类似的结果。(b条)X1的化学结构。¹²(c（c）)患者46的CLL细胞在AIM-V中单独培养2天，与O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）转移酶（OGT）抑制剂X1（50μM）或GlcNAc（20 mM）和尿苷（5 mM）（GU）一起培养，为OGT提供底物。然后用RL2和活化Akt抗体检查蛋白质提取物^T308电话通过密度测定法对与β-肌动蛋白相关的染色强度进行量化（右侧面板）。GU增加O-GlcNAc水平，降低Akt^T308电话而X1则有相反的作用。(d日)细胞大小由流式细胞仪的前向散射参数指示。GU处理的细胞较小，而X1处理的细胞略大于单独培养的细胞。直方图中的数字是M1区域的平均值。该图总结了其他八个CLL样本（患者128、133、171、172、173、125、26和174）的结果，并显示了因己糖途径底物负载导致的细胞大小差异的平均误差和标准误差(P（P）<0.02（八个样品）。

O-GlcNA酰化增加对CLL细胞信号反应的影响

虽然细胞因子和TLR激动剂的急性刺激增加了基线水平相对较低的CLL细胞中O-GlcNAcylated蛋白的水平(图2a)，我们想确定高基线O-GlcNAc水平对CLL细胞后续信号传导的影响。为了增加O-GlcNAcylated蛋白水平，在N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和尿苷中培养细胞，尿苷进入GFAT下游的己糖途径(图1a)增加UDP-GlcNAc和OGT活性。¹⁶为了降低O-GlcNAc水平，细胞在X1的存在下培养，以防止形成新的O-GlcNAc部分，同时允许OGase去除预先存在的修饰。

在脂肪细胞中，O-GlcNAcylation通过干扰磷酸化，特别是苏氨酸308，抑制Akt的活性。⁵为了确定Akt在CLL细胞中是否以类似方式调节，新鲜患者样本在X1存在下培养2天（以降低O-GlcNAc水平），或在GlcNAc和尿苷中培养2天。如RL2染色所示，X1降低O-GlcNAc水平，导致Akt的高表达^T308电话(图2c，中间车道）。相反，GlcNAc和尿苷增加RL2水平，显著降低磷酸化Akt的表达(图2c，右车道）。流式细胞术的前向散射参数表明，与Akt活性下降一致，在GlcNAc和尿苷中培养的CLL细胞小于单独培养的细胞(图2d). X1处理的细胞通常也比未处理的细胞大。

刺激4h后，通过流式细胞术测量细胞表面TNF-α的表达，显示TLR-7的信号反应。^10,25RL2免疫印迹显示，GlcNAc和尿苷增加了CLL细胞中O-GlcNAcylated蛋白的水平(图3a，右侧面板），而对852A的反应中TNF-α表达减少(图3a，比较上下点位）。当O-GlcNAc水平被X1降低时(图3b，右图），852A刺激后TNF-α表达增加(图3b，比较上下点位）。这些发现表明TLR-7信号强度与细胞内O-GlcNAc水平成反比。

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图3

改变O-GlcNAc水平对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中toll-like receptor（TLR）-7信号转导的影响。(一)在用TLR-7激动剂852A（0.1μg/ml）刺激之前，将来自患者116的CLL细胞单独或在GlcNAc和尿苷（GU）中培养过夜。RL2抗体的免疫印迹证实O-GlcNAcylated蛋白水平增加（中间面板），通过密度测定法（相对于β-actin水平）进行量化（右侧面板）。CD83和肿瘤坏死因子（TNF）-α的表面表达（反映TLR-7信号¹⁰)4h后用流式细胞仪检测。右上象限中的数字是表达膜TNF-α（mTNF-β）的CLL细胞的百分比。(b条)164名患者的CLL细胞单独培养24小时或与OGT抑制剂X1（50μM）共同培养24小时，以降低O-GlcNAcylation（经RL2抗体免疫印迹和密度测定证实），然后用852A刺激。其他10个样品的TNF-α产量也有类似的增加。(c（c）)患者80（左面板）和患者125（右面板）的CLL细胞在有无GU的情况下培养过夜，然后用852A刺激。在指定的时间，收集蛋白质提取物，并通过免疫印迹法检测磷酸化和总c-Jun N末端激酶（JNK）、IκB以及RL2的表达，以确认O-GlcNA酰化蛋白水平的增加。其他两个样品也有类似的结果。

CLL细胞TLR-7激活后JNK和IκB正常磷酸化(图3c).¹⁰然而，用GlcNAc和尿苷治疗显著损害JNK磷酸化(图3c和IκB磷酸化动力学改变(图3c第三和第四面板）。此前，发现CLL细胞在TLR-7激动剂作用下不能产生TNF-α时，也伴随着类似的异常信号传导。¹⁰为了确定己糖胺途径负载对TLR-7介导的JNK磷酸化的抑制作用是否仅限于CLL细胞，对直接从血液中分离的正常B细胞和短期B细胞系进行了类似研究，因为CLL细胞被视为活化B细胞的转化对应物。²⁶在这两种状态中，至少一种JNK亚型的磷酸化被葡萄糖胺和尿苷的过夜培养所抑制(补充图1).

微管抑制剂长春新碱也激活了CLL细胞中的JNK和核因子-κB信号通路(图4a).²⁵长春新碱对JNK的磷酸化反应也特别受损(图4a，顶部两个面板），当细胞内O-GlcNAc水平通过与GlcNAc和尿苷的预培养而增加时(图4a，底部面板）。

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图4

细胞内O-GlcNA酰化变化对化疗药物、B细胞受体交联和佛波酯反应的影响。慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞在有无GlcNAc和尿苷（GU）的情况下培养过夜，并用(一)长春新碱（0.3μg/ml）（患者80（左）和173（右））或(b条)抗人IgM抗体（10μg/ml）（患者108（左）和21（右））。在0、10、30和60分钟收集提取物，并表达磷酸化和总JNK和IκB（长春新碱）、细胞外信号调节激酶（ERK）以及Syk^YY525/526年（用于BCR激活），以及RL2，以证实O-GlcNA酰化增加，通过免疫印迹进行检查。每个刺激的另外两个样本也有类似的结果。(c（c）)对来自患者152、113、74、149、155、130、1、5、26、55、38和154（实心钻石）和三名正常供体（开环）的新鲜分离的CLL细胞进行纯化，并立即用二丁酸佛波酯（PDB）（100 ng/ml）刺激。CD19上CD83表达的平均荧光强度差异⁺4h后用流式细胞仪检测B细胞与未刺激细胞的比较。使用新鲜细胞的蛋白质提取物测定RL2指数。结果表明，细胞内O-GlcNAcylated蛋白基线水平较高的CLL细胞对PDB刺激反应较低。

B细胞受体信号传导在慢性淋巴细胞白血病的发病机制中具有重要作用。²⁷作为B细胞受体信号、磷酸化-Syk的读数^Y352型和-ERK^T202/Y204型尽管一些CLL细胞具有无能性特征，但在B细胞受体交联后，其水平通常会增加，因此对其进行了测量。^三与TLR激动剂和微管抑制剂对JNK激活的抑制作用相反(图3c和​和4a），4a类)GlcNAc和尿苷对B细胞受体参与的细胞外信号调节激酶磷酸化没有显著影响，尽管背景水平似乎增加(图4b、第二和第三面板）。然而，Syk磷酸化动力学的改变伴随着O-GlcNAcylated蛋白水平的增加(图4b，顶部面板）。

综上所述，这些结果表明，代谢负荷引起的O-GlcNA酰化增加对CLL细胞中信号通路的亚群有显著影响。确定CLL细胞中基线O-GlcNAc蛋白水平的自然变化(图1b)可能同样影响信号传递过程，在用二丁酸佛波酯激活前和激活后4h，通过流式细胞术测量新分离的CLL样品的CD83表达，我们以前曾用此方法来反映蛋白激酶C信号传递。¹同时，制备并冷冻蛋白质提取物，以便随后测定基线RL2指数。具有高基线RL2指数的CLL样品对蛋白激酶C激动剂的反应较小，反之亦然(图4c). 在所有情况下，CLL细胞对二丁酸佛波酯的反应均弱于正常B细胞，正常B细胞的胞内O-GlcNAcylization本质上非常低(图1b). 以前已经注意到正常B细胞和CLL细胞对免疫调节剂反应性的差异。^1,28

这项工作得到了安大略省癌症研究所（OICR编号07Nov-61）、加拿大卫生研究院（CIHR）（编号190633）和加拿大白血病和淋巴瘤学会（致DS）的资助，卡米尔·德雷福斯教师学者奖（编号TC-03-009）（致SW），CIHR拨款MOP-79405和MOP-43938，以及Genome Canada通过安大略省基因组研究所（向JWD）提供的拨款，NCI R01CA42486和NIDDK R01 DK61671（向GWH）以及CIHR第15095号拨款（向JPD）。我们感谢Dimitar Efremov、Mark Minden和Suzanne Kamel-Reid的有益讨论。