一种新型鞘氨醇激酶抑制剂诱导肿瘤自噬细胞^S公司⃞

摘要

目前大多数抗癌药物通过诱导细胞凋亡来杀死分裂活跃的细胞(富尔达，2009)。除此之外“经典”癌症化疗，阻断分子肿瘤细胞增殖途径及诱导替代细胞的治疗死亡途径对药物开发很重要(里奇和Zong，2006年)。凋亡细胞死亡涉及一系列事件，导致细胞形态的特征性变化，包括细胞膜不对称性的丧失，核分裂、染色质浓缩、染色体DNA分裂和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活(里奇和宗，2006年).不幸的是，癌细胞往往对激活凋亡因子的药物产生耐药性通路(富尔达，2009)。因此，替代电池死亡途径正在研究中，以用于癌症化疗(里奇和宗，2006年).

自噬是一个可逆的分解代谢适应过程，负责降解饥饿和/或生长因子缺乏时的长寿蛋白质和细胞存活(昆都和汤普森，2008)。在自噬过程中，部分细胞质被溶酶体消化，从而提供代谢物用于细胞内稳态。尽管自噬是一个在细胞中起主要作用的过程它还能够诱导细胞死亡，其特征是广泛消化细胞内细胞器(Bursch等人，2000年).重要的是，一些小分子（包括一些抗癌药物）激活癌细胞的体内和体外自噬（综述于Lefranc等人，2007年)表明这种生物的重要性化学疗法发展的过程。两个强有力的鞘脂第二信使，神经酰胺和鞘氨醇-1磷酸盐（S1P）也参与许多细胞与细胞内稳态相关的过程，包括凋亡和自噬(库维利埃，2007年;拉维厄等人，2008年;Wymann和Schneiter，2008年).鞘氨醇催化促凋亡鞘氨醇转化为前存活S1P激酶-1（SK1）和SK2，这些酶被认为是药物的重要靶点发展(Delgado等人，2006年;库维利埃，2007年)。SK1的过度表达在许多实体瘤中显示(French等人。，2003;Taha等人，2004年)，在可能的地方促进细胞存活和耐药性并调节自噬(Lavieu等人，2006年)。与SK1的作用相比了解SK2的作用，其活动似乎特定于细胞类型和细胞条件（综述于Taha等人，2006年).

最近，我们从一个化学库中鉴定出SKs的非脂质小分子抑制剂(French等人，2003年,2006)。乳腺癌同种异体移植中使用这些药物肿瘤模型对小鼠无毒性延迟肿瘤生长(French等人，2003年,2006)。我们的长期目的是识别SK1和SK2的特定小分子抑制剂并开发SK酶的药理学操作以获得治疗益处。为此，我们合成ABC294640(图1A） ，第一次口服可用的SK2选择性抑制剂。ABC294640在用鞘氨醇K（K）_我10μM用于重组人类SK2(French等人，2010年)并且有治疗作用糖尿病视网膜病变模型的疗效(Maines等人。，2006)和炎症性肠病(缅因州等al.，2008年)。重要的是，我们最近证明ABC294640良好的药理学特性，在小鼠血浆和无明显毒性的肿瘤(French等人，2010年).

在单独的窗口中打开

图1。

ABC294640在A-498细胞中诱导非凋亡细胞死亡。A、 化学式ABC294640.B，将细胞暴露于指定浓度的ABC29464和24、48或72小时固定。取细胞核，用PI染色，DNA通过流式细胞术分析含量，如下所述材料和方法C，细胞暴露于指示浓度的ABC294640持续72 h，用荧光法测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性描述如下材料和方法.顺铂(顺式-DDP）用作对照（黑条）。数据表示平均值三个实验的±标准误差。D、 细胞暴露于ABC294640的指示浓度持续72小时，并用PI和流式细胞术分析前的Annexin-V-FITC，如下所述材料和方法。对于每个面板，左下角表示Annexin V-和PI-阴性细胞；右下角表示膜联蛋白V阳性细胞（凋亡细胞）；右上角表示死亡膜可渗透PI的细胞（PI阳性细胞）用膜联蛋白V染色；左上角表示游离核。占总数的百分比单元格显示在每个象限中。

本研究的主要目的是确定生物过程负责ABC294640诱导的癌细胞死亡。为了实现这个目标，我们使用了A-498肾脏、PC-3前列腺和MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞表明ABC294640诱导非凋亡细胞死亡之前有自噬标记，包括酸化细胞质小泡，LC3分裂增加，自噬体积聚。在此外，对携带A-498异种移植物的小鼠给予ABC294640可延迟肿瘤生长和来自治疗小鼠的肿瘤免疫染色显示出特征体内自噬反应。

材料和方法

结果

描述ABC294640对细胞凋亡、对照细胞核和处理后的细胞用PI染色并用流式细胞仪分析(图1B） ●●●●。结果表明，只有一小部分ABC294640处理的细胞（<1%）含有亚G₁DNA数量，即使在有毒药物浓度（>50μM）和长期治疗时次（72小时）。DNA片段的缺失表明ABC294640没有诱导A-498细胞凋亡。这些结果被缺乏半胱天冬酶所证实即使在暴露72小时后，ABC294640处理的细胞中仍有3/7的活化(图1C） 。Annexin-V定量凋亡/坏死是基于磷脂酰丝氨酸的不对称分布，诱导细胞凋亡后，从质膜的细胞质表面翻转到可与附件五结合的外传单。添加PI区分坏死或晚期凋亡细胞与早期凋亡细胞。作为在中演示图1D、 Annexin-V染色ABC294640处理的细胞毒性浓度（50或90μM）和长暴露时间（72小时）显示染色细胞数量增加通过膜联蛋白-V+PI或单独的PI（分别为30%和16.4%），但只有少数细胞凋亡细胞被Annexin-V染色，但不被PI染色（90μM时<6%）。这个与细胞对PI具有渗透性相一致（因为血浆受损膜），之前没有激活凋亡机制。来自所有三种凋亡检测表明，大多数A-498细胞暴露于ABC294640死亡时没有显示凋亡的特殊特征。

ABC294640处理的A-498细胞缺乏凋亡指标促使我们调查其他可能导致细胞死亡的过程。最近的报告指出了角色自噬和溶酶体在某些癌症诱导的肿瘤细胞死亡中的作用化学疗法(Lefranc等人，2007年;Klonsky等人，2008年)，所以各种自噬标记进行了检查。管蛋白相关蛋白LC3是一种被裂解的细胞溶质蛋白在自噬诱导后，产生胞质LC3-I（18kDa）和自噬体相关LC3-II（16kDa）。我们发现ABC294640引起剂量-和A-498细胞中LC3的时间依赖性分裂，在72小时时程(图2A） ●●●●。已知的自噬诱导鞘脂神经酰胺也促进了快速而显著的分裂LC3的。双SK1和SK2抑制剂4-[[4-（4-氯苯基）-2-噻唑基]氨基]苯酚（SKI-2）和DMS也在24、48或72小时诱导LC3解理(图2B） ●●●●。暴露于任何三种SK抑制剂显示细胞质中存在点状小点，表明LC3-II向自噬体募集(图。2C） 。暴露于ABC294640、SKI-2或DMS显示LC3阳性细胞在统计学上显著增加(图2D） ●●●●。虽然DMS已知会改变其他激酶的活性(Igarashi等人。，1989;Megidish等人，1995年)，的证明LC3裂解和自噬体的形成是由三种结构不同的SK抑制剂支持自噬是一种常见的假说对SK的药理学抑制的反应，而不是对ABC294640。

在单独的窗口中打开

图2。

SK抑制剂对A-498细胞LC3裂解和自噬体形成的影响细胞。A、 用指定浓度的ABC294640或5处理细胞μM神经酰胺用于指定的时间。LC3-II的产生是按下述方法进行Western blotting检测材料和方法。通过剥离和重新处理，确认了荷载相等抗肌动蛋白抗体。B、 细胞暴露于指示浓度的SKI-2或5μM DMS，LC3裂解由Western评估如下文所述，在24、48或72小时对细胞裂解物进行印迹材料和方法C，A-498细胞暴露于载体ABC294640，SKI-2或DMS 48小时，然后固定并免疫染色LC3在下面材料和方法.D，LC3阳性的定量细胞。细胞暴露于50μM ABC294640，30μM SKI-2，或5μM DMS 48小时。数据表示三个样品的平均值±S.E实验。Western blots下面的数字表示相对LC3-II/肌动蛋白比值与载体处理细胞±S.E.的比较。

进行电子显微镜检查以进一步证实A-498中的自噬诱导细胞。将细胞暴露在50μM ABC294640中24小时，导致产生许多大的空空泡和含有残余物的自噬空泡消化物质或完整的细胞器(图3A） ●●●●。与之前的数据一致，没有染色质凝聚或核碎裂观察到凋亡死亡迹象。相反，只有少数小的自噬在载体处理的细胞中观察到液泡(图。三B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图3。

ABC294640诱导A-498细胞自噬空泡化或凋亡。A类和B，用50μM ABC294640（A）或载体（B）处理细胞24小时后，按照以下说明生成电子显微照片材料和方法低倍下的典型显微照片（左，bar=10μm）或高倍率（右侧，bar=0.5μm）显示了细胞的超微结构。箭头表示自噬液泡。用ABC294640或3-MeA单独或在组合72小时，然后处理以分析其DNA含量（C）或胱天蛋白酶3/7活性（D），如下所述材料和方法黑色条表示处理过的细胞中caspase 3/7的活性对于载体，深灰色条表示细胞中caspase 3/7的活性用90μM ABC294640处理后，浅灰色条代表半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶用5 mM 3-MeA处理的细胞中有3/7的活性，白色条表示72小时后，用二者处理的细胞中caspase 3/7活性E，A-498细胞单独使用ABC294640（正方形）或DMS（三角形）处理（填充符号）或与5 mM 3-MeA（开放符号）联合48小时，细胞存活率为通过SRB染色进行评估。F、 A-498野生型单元格（填充符号）或SK2shRNA-转染的A-498细胞（开放性标志）用顺铂治疗（循环）或神经酰胺（方格）48小时，并根据标准评估其生存率SRB测定。

自噬通常是各种有毒侮辱的防御机制(《金与白》，2008年)。确定自噬是否是a-498细胞的一种防御机制，我们试图通过创建一个Atg7基因的稳定shRNA敲除(Yu等人。，2004)。然而，这导致了致命性，因此没有稳定的克隆可以证实了自噬在这些肿瘤生存中的重要性细胞。因此，我们用III类抑制剂通过药物阻断自噬磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks），3-甲基腺嘌呤（3-MeA），如前所述(Herman-Antosiewicz等人，2006年;Cui等人，2007年)。A-498细胞暴露于ABC294640单独或在5 mM 3-MeA存在下，以及DNA含量、半胱天冬酶3/7测定活性和细胞存活率。与上述结果一致，ABC294640和3-MeA均未诱导DNA片段化(图3C） 。然而，ABC294640加3-MeA治疗这种结合导致了DNA碎片细胞的大量积累。在此外，经该组合处理的细胞表达了大量caspase 3/7活性表明细胞凋亡，而这两种化合物都没有单独引起这种效应(图3D） ●●●●。向培养物中添加3-MeA减少ABC294640和DMS的细胞毒性(图3E） ，这表明自噬至少在一定程度上是细胞死亡的原因。添加3-MeA至A-498细胞阻断响应ABC294640的LC3-II的产生（补充图1A），证明3-MeA在抑制自噬方面有效在这些细胞中。将ABC294640与自噬抑制剂氯喹(阿马拉瓦迪等人。，2007)导致两种化合物产生拮抗细胞毒性（数据未显示）。

为了进一步研究SK2在诱导自噬中的潜在作用，我们创建了使用慢病毒传递的shRNA从A-498细胞中获得稳定的SK2敲除克隆。在与Atg7的研究相比，建立了几个克隆。然而，定量检测这些克隆中SK2 mRNA的表达水平实时PCR表明SK2敲除是可变的和不完整的（补充图1B），因此没有SK2mRNA水平低于对照约30%的克隆获得细胞。这与我们使用siRNA针对SK2显示抑制SK2可阻止A-498细胞增殖（未发表数据）。部分SK2敲除克隆的水平没有显著增加LC3-II（补充图1C），表明SK2的部分敲除不会诱导自噬。然而，SK2酶的部分敲除使A-498细胞敏化为以顺铂和神经酰胺为代表的凋亡和自噬诱导剂，分别(图3F） ，表明ABC294640与其他化疗药物联合使用可能有效。

因为碱性亲脂性化合物可以作为溶酶体促生长剂，因此对可能的自噬调节剂、溶酶体形态进行评估以获得进一步的信息ABC294640诱导自噬的机制。与对照细胞相比，ABC294640处理24小时后，LysoTracker Red的积累增加染色和溶酶体增大（“肿胀”）（补充图2）。量化后ABC294640处理的细胞为204，而车用处理的细胞则为160(第页<0.05（两个值），表明溶酶体较高ABC294640处理的细胞中染料的积累。酸化加剧吖啶橙染色证实细胞器存在。吖啶橙进入细胞酸性区室，并被质子化和隔离。在低pH值下，染料当被蓝光照射时，会发出红光。ABC294640处理细胞的染色吖啶橙显示酸性囊泡的数量和大小增加细胞器（补充图2）。相比之下，我们将细胞暴露于神经酰胺或他莫昔芬，两种已知可诱导癌细胞自噬的分子(Scarlatti等人，2004年; Pattingre等人，2008年）。作为通过LysoTracker或吖啶橙染色显示，A-498细胞暴露于他莫昔芬或C6陶瓷表现出类似的溶酶体肿胀，证实两者三苯氧胺和神经酰胺是溶酶体促生长剂（补充图2、D和E）。线粒体MitoTracker绿色染色显示ABC294640处理的细胞MitoTracker染料的正常积累量表明药物治疗期间细胞保持极化(普特（Poot et）1996年)。四甲基罗丹明染色证实了这一点细胞渗透性荧光染料，容易被活性线粒体和通过流式细胞仪检测，因为ABC294640不影响染料积累（数据不如图所示）。

评估ABC294640对自噬（另外两种癌症）影响的一般性采用前列腺癌（PC-3）和乳腺癌（MDA-MB-231）细胞系。这些细胞暴露于ABC294640也会导致与之无关的细胞死亡DNA断裂，即使在高浓度（90μM）和长时间暴露时间（72小时）(图4)。然而，在这两者中MDA-MB-231和PC-3细胞ABC294640在24小时时引起LC3的剂量依赖性分裂胞浆中酸性小室增加。因此，诱导自噬ABC294640不仅限于特定的细胞系，而且似乎是一种常见的肿瘤细胞之间的反应。

在单独的窗口中打开

图4。

PC-3和MDA-MB-231细胞自噬激活。A、 PC3细胞（左）或MDA-MB-231细胞（右）用载体或90μM ABC294640处理72小时后，将细胞固定在乙醇中，并用PI染色，通过流式细胞术如下所述材料和方法.B，第3页（左）或MDA-MB-231（右）细胞暴露于指示浓度的ABC294640（μM）24小时，然后溶解和免疫印迹。箭头表示LC3-II。C、 PC3（左）或MDA-MB-231（右）细胞暴露于50μM ABC294640 24小时，用MitoTracker绿色和LysoTracker红色染料，共焦成像如下文所述材料和方法。

我们还测量了A-498细胞中几种信号和存活蛋白的水平通过免疫印迹法暴露于ABC294640。beclin 1的表达水平肿瘤抑制因子是自噬途径中的关键蛋白之一在48和72小时时随着ABC294640浓度的增加而增加(图5A） ●●●●。MEK/ERK通路在抗肿瘤中的作用ABC294640的活性通过磷酸化Akt和用该化合物处理的A-498细胞中的磷酸化ERK。有趣的是，尽管Akt和ERK通路可以激活mTOR信号，从而阻断自噬(Meijer和Codogno，2006年)，ABC294640没有显著降低磷酸化-mTOR水平。因此，A-498细胞中的自噬诱导ABC294640治疗不会引起磷酸化状态的改变mTOR，但与beclin 1上调有关。

在单独的窗口中打开

图5。

ABC294640对信号通路的影响及ABC29464的联合作用用格尔德霉素或MG-132。A、 细胞暴露于指示浓度ABC294640进行48 h，用SDS-PAGE进行分级，并探测指示的蛋白质的Western blotting，如下所述材料和方法也显示了Beclin 1在24和72小时的表达。数字下面的蛋白质印迹表明磷酸化蛋白/总蛋白与载体处理的细胞相比的蛋白质比率±标准与处理过的车辆相比，相对beclin-1/actin比率的误差单元格±标准误差。将A、B和C、A-498细胞暴露于单独ABC294640（灰色条）、格尔达霉素（B，白色）的指示浓度条）、MG-132（C，白色条）或ABC294640和格尔德霉素的组合或MG-132（黑条），72小时后通过SRB试验评估存活率。CalcuSyn为各个组合计算的组合指数（CI）如右图所示。CI值介于0和1之间表示协同作用，CI大于1的值表示对抗。强大的协同作用由接近的值表示到0.*，第页< 0.05.

抗癌化疗通常是由不同药物的联合用药具体时间表。基于自噬细胞死亡的发现ABC294640，并且知道一些错误折叠的蛋白质会被自噬降解(丁和尹，2008年)，我们假设药物诱导未展开的蛋白质反应，例如蛋白酶体抑制剂（例如MG-132）或热休克蛋白90抑制剂（如格尔德霉素）可能影响ABC294640。因此，A-498细胞暴露于ABC29464+格尔德霉素或MG-132不同药物-药物比例的组合。细胞存活部分药物治疗72小时后测定人群(图。5、B和C）。对组合指数（CalcuSyn）的分析证实ABC294640和格尔德霉素的组合具有协同细胞毒性，即组合指数<1.0(图5B） ●●●●。同样，ABC294640和MG-132的组合也具有协同毒性(图5C） ●●●●。

为了进一步研究ABC294640的体内抗肿瘤特性，我们使用了SCID载体A-498细胞的异种移植。如所示图6A、，每天服用50 mg/kg ABC294640导致治疗4周后肿瘤生长。28天后，切除肿瘤组织，固定切片，并对玻片进行免疫染色，以评估beclin 1和LC3和TUNEL染色以确定凋亡细胞的数量(图6B） ●●●●。如所示图6C、 beclin 1和LC3的染色强度在暴露于ABC294640的小鼠的肿瘤与使用汽车治疗的小鼠相比老鼠。相反，在ABC494640和车用治疗肿瘤(图6，B和C，底部），表明细胞凋亡的增加不是本模型中肿瘤在体内生长的延迟。这些数据与体外观察到自噬诱导和非凋亡细胞死亡。

在单独的窗口中打开

图6。

ABC294640对小鼠肿瘤生长的影响及其组织学特征ABC294640治疗肿瘤。A、 雌性SCID小鼠(n个=每组8个）将悬浮在PBS中的A-498细胞皮下注射肿瘤形成后，每天用0(♦) 或50 mg/kg ABC294640(○). 值代表平均值±S.E.肿瘤体积标准化至每只小鼠治疗第1天。*，第页< 0.05; **,第页<0.01. 治疗开始后第27天处死小鼠在福尔马林中固定，并对肿瘤切片进行TUNEL染色LC3和beclin 1的免疫染色如下所述材料和方法.B，TUNEL阳性细胞的定量。黑色酒吧代表车辆治疗的肿瘤，白色条代表ABC294640治疗的肿瘤肿瘤。数据表示三个实验的平均值±S.E。C、，ABC294640治疗肿瘤的组织学特征。

讨论

S1P在细胞生长和肿瘤发展中的广泛参与促使我们开发几种具有体内外活性的小分子SK抑制剂(French等人，2003年,2006;缅因州等，2006年,2008;史密斯等人al.，2008年)。开发了一种当前的SK2铅抑制剂ABC294640，以改善口服生物利用度和酶的特异性阻碍了其他药物的开发类脂质SK抑制剂(French等人。，2010)。我们之前已经证明ABC294640在活体(缅因州等，2006年,2008;Smith等人，2008年)和在这项工作中，它也具有抗肿瘤活性(图。6)。ABC294640的药代动力学研究表明，该化合物达到口服剂量为50μM后，血浆峰值浓度约为20μMmg/kg，清除半衰期约为4.5小时(French等人，2010年)，这意味着更多更高剂量和/或更频繁地使用可以获得显著的抗肿瘤效果管理。ABC294640目前处于经认证的良好实验室规范毒理学领域并有望在2010年进入临床试验。这里展示的工作是首次详细研究ABC294640在人类肿瘤细胞中的抗肿瘤特性在体外和体内。出乎意料的是，我们发现肿瘤细胞暴露在这种药物下诱导自噬，这可能导致非凋亡细胞死亡。

自噬杀死癌细胞的确切机制尚未确定。然而，很可能是细胞自噬降解的长期激活组分，例如负责细胞代谢的关键蛋白质和细胞器（可能）细胞凋亡，最终使细胞超过恢复点，进入非凋亡性死亡(图7)。这与提出了蛋白酶体抑制抗癌药物如Velcade的作用机制。在暴露于ABC294640的A-498细胞中，我们观察到生前MAPK的下调尽管细胞保存在完全培养基中。然而，只有一小部分细胞能够激活凋亡途径，除非通过添加3-甲基丙烯酸甲酯。因此，自噬似乎是细胞死亡的主要机制ABC294640治疗肿瘤细胞。

在单独的窗口中打开

图7。

ABC294640对肿瘤细胞死亡的反应模型。A、 正常生长下条件下，MAPK和Akt通路激活，导致高细胞增殖和低凋亡。有一个基本水平的自噬来提供代谢产物支持细胞的快速增殖和能量需求。B、，暴露于ABC294640后，MAPK和Akt通路下调，从而抑制增殖，减弱对凋亡的限制。同时，ABC294640诱导神经酰胺的产生（通过抑制SK）加速自噬（表现为自噬体的产生增加）不可持续点，导致自噬死亡。C、 在3-MeA在场的情况下，自噬被阻断，导致肿瘤细胞凋亡DNA断裂和胱天蛋白酶激活。

控制肿瘤细胞命运的因素包括受体、酶（如SK1/2）和转录因子，所有这些都被连接成复杂且通常是冗余的信令网络。临床肿瘤学的当前方法是使用多种药物来避免这种冗余。这其中的一个主要缺点方法是需要同时使用多个dug，这可能导致累积毒性(胡和宣，2008)。一种有效的方法克服这个障碍是激活可导致肿瘤细胞的替代过程死亡。在肿瘤细胞死亡的研究中，细胞凋亡受到了最大的关注，但很明显，可以通过其他机制去除癌细胞。一个研究不足的途径是自噬，这是一种进化上保守的过程，允许细胞在营养缺乏的压力下生存。在自噬过程中细胞质和细胞器被双膜泡状结构吞噬，称为自噬体。这些小泡随后与溶酶体融合，其内容物被降解通过溶酶体水解酶。越来越多的证据表明自噬在一些抗癌药物治疗后被激活，但它对细胞的贡献死亡和/或抗癌药物耐药性尚不清楚(Lefranc等人，2007年;Wang等人。，2008)。最近，一种小分子选择性地靶向von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因缺失的肾细胞癌被证明可以杀死肿瘤细胞仅通过激活自噬，证明这种机制可以导致导致肿瘤细胞死亡(Turcotte等人，2008年).凋亡和自噬之间存在相互作用，因为自噬经常被阻断促进细胞凋亡(Thorburn，2008年).

自噬的启动和自噬体的延伸涉及几种蛋白质，包括支架蛋白beclin 1和与自噬体相关的LC3-II。一些信号蛋白对此进行调节过程。例如，mTOR信令网络接收来自生长因子的输入通过I类PI3K信号通路的受体。PI3K/Akt/mTOR和MEK/ERK当激活时，这些通路抑制自噬。在A-498细胞中，用ABC294640，我们观察到磷酸化Akt和磷酸化ERK1/2水平降低，但没有mTOR磷酸化状态的变化，这表明ABC294640不需要降低磷酸化-mTOR水平。与中的报告相比其他系统(Cheng等人，2007年)，我们没有发现自噬（和凋亡）抑制剂Bcl-2水平的变化（数据未显示），结合并抑制beclin 1。另一方面，beclin 1的上调暴露于ABC294640的A-498细胞在72小时时观察到蛋白质水平在人类结肠癌HT-29细胞中观察到beclin1的上调接触C6陶瓷后的自噬(斯卡拉蒂等人al.，2004年)。我们假设beclin 1的上调对于ABC294640诱导的长时间自噬。翻译成动物模型，每天服用ABC294640导致皮下生长延迟肾癌细胞的异种移植。beclin 1和LC3上调，缺乏肿瘤的免疫染色也发现了细胞凋亡（通过TUNEL分析测定）组织。这些结果可能表明自噬的诱导而不是体内细胞凋亡的增加在延缓肿瘤生长中起着重要作用。

选择A-498肾癌细胞作为生化和细胞研究，因为肾脏SK2酶的表达相对较高(Taha等人，2006年)。此外，肾癌是临床上特别难以治疗。因此，了解SK抑制剂可以激活这些细胞中的哪些死亡机制它们作为潜在的肾癌药物的进一步发展。这项研究也代表肾癌细胞自噬的首次报道。重要的是，机械这一发现扩展到了其他癌症细胞系，因为MDA-MB-231和PC-3的暴露细胞对ABC294640没有激活细胞凋亡，而是导致LC3蛋白和细胞内隔间酸化，表明其普遍存在促进肿瘤细胞自噬的能力。此外，我们观察到LC3裂解和暴露于其他结构分化SK的A-498细胞中自噬体的形成抑制剂（DMS和SKI-2），表明其他SK抑制剂也诱导自噬，尽管对于这两种化合物，SK1和SK2的作用无法区分。

作为其临床前开发的一部分，我们还测试了几种ABC294640与其他抗癌药物在细胞培养中。我们发现两种化合物激活未折叠蛋白反应MG-132和格尔德霉素，协同提高ABC294640在细胞培养中的细胞毒性。这些发现对于用于未来临床前和临床研究的抗癌药物组合的设计，特别是，建议可能使用ABC294640治疗多发性硬化症骨髓瘤。其他研究表明，与信号抑制剂联合使用具有疗效和抗代谢物（未发表的工作），为广泛抗肿瘤提供了有力的证据ABC294640的活性。其促进自噬能力的当前证明肿瘤细胞强调需要在研究中考虑这种经常被忽视的反应抗癌药物。

补充材料

鸣谢

工具书类