材料和方法
RAR缺乏小鼠及其基因分型
风险调整比率-缺陷小鼠是通过交配产生的风险调整比率老鼠(风险调整比率α飞行/飞行、RARβ飞行/飞行或风险调整比率γ飞行/飞行) (Chapellier等人，2002a;Chapellier等人，2002b;Chapellier等人，2002c)带有第2a1列-Cre小鼠(Ovchinnikov等人，2000年)最终创造纯合子风险调整比率-软骨缺陷小鼠。简要地，第2a1列-Cre小鼠首先与单个RAR纯合子小鼠交配以产生杂合子第2a1列-克里+/风险调整比率（f）/+反过来交配生产的老鼠第2a1列-Cre公司+/风险调整比率飞行/飞行缺乏一个的小鼠风险调整比率在软骨中。为了产生双突变小鼠，将单个RAR缺陷小鼠相互交配以产生双杂合小鼠(第2a1列-Cre公司+/风险调整比率（f）/+/风险调整比率（f）/+). 产生的小鼠，通常第2a1列-Cre公司+/风险调整比率飞行/飞行/风险调整比率（f）/+，进行交配以获得双倍风险调整比率-缺陷小鼠(第2a1列-Cre公司+/风险调整比率飞行/飞行/风险调整比率飞行/飞行)在所有受体组合中（α/β、α/γ、β/γ）。C介导的切除删除了风险调整比率α和风险调整比率γ，编码大部分DNA结合结构域，并删除风险调整比率β编码大部分配体结合域。在每种情况下，缺失也会引起移码突变，从而导致所有香料形式的功能消融。基因分型程序和结果如下所示补充图S1和S2系列.
微计算机断层扫描（μCT）分析
胫骨和股骨在45 kVp下通过μCT进行分析。使用ScancoμCT 40仪器，使用专有软件分析和量化小梁骨体积、连通性、小梁厚度和矿物密度。
软骨细胞培养
用无钙无镁HBSS加抗生素和0.05%胰蛋白酶/0.01%EDTA清洗新生儿骨骺和3-5周龄肋骨的软骨碎片。碎片在37°C的新鲜胰蛋白酶/EDTA混合物中孵育20分钟，用0.1%睾丸胶原酶在αMEM中洗涤和孵育3-4小时。通过吸管分散新生小鼠软骨组织，将单个细胞接种到保存在10%FBS中的αMEM I型胶原蛋白涂层多孔培养皿上。用初始胶原酶处理部分消化来自3周龄和5周龄小鼠的肋骨软骨碎片。我们发现超过4小时的胶原酶处理不仅会破坏细胞活力，而且会降低软骨细胞的产量。为了避免这些问题，我们将部分消化的软骨碎片在10%FBS和1 ng/ml重组碱性FGF（R&D）中保存7-10天，然后在细胞汇合后，用0.1%胶原酶再次消化2-3小时。向培养基中添加抗坏血酸（10μg/ml）。软骨基质含量通过阿尔西安蓝染色（pH 1.0）测定。
转染
单报告人分析：4×104在转染前一天，将每个孔的细胞接种到I型胶原包被的96孔板上。细胞保存在MEM中100μl 10%FBS中。根据制造商的方案，更换培养基，并立即用0.2μg/孔的维甲酸反应元件（RARE）荧光素酶报告载体（Panomics，CA）和0.2μl的脂多卡因LTX（Invitrogen，CA）转染细胞。用指定剂量的全反式维甲酸（RA）（Sigma）、RARγ激动剂（VTP 204647）或RAR反向激动剂（INV）（AGN/VTP 194310）转染后24小时；平行对照培养只接受载体。48小时后，对细胞进行荧光素酶分析。
双报告分析：采用双报告分析系统研究单个RAR和Zac1的功能。细胞接种和维持条件与单报告人试验相同。为了获得功能实验，将0.1μg表达载体和RARE-luc以及1 ng phRG-SV40（Promega）与0.2μl Lipofectamine LTX共同转染。对于功能丧失实验，0.2 pmol siRNA（非特异性siRNA混合物D-001810-10；SMARTpool siRNA混合物靶向小鼠Zac1（Plagl1），E-046206；用0.2μl Lipofectamine 2000试剂（目录号25087w-pps，Invitrogen）将RARα，E-047625和RARγ，E-0040974，Dharmacon，CO）、30ng RARE-luc和1ng phRG-SV40（Promega）转染到每个孔中。一些培养物在转染后24-48小时用各种类视黄醇衍生物处理。转染48小时后，收集细胞并进行双荧光素酶检测（双荧光素酶报告检测系统，E1910，Promega）。通过phRG-SV40产生的Renilla荧光素酶活性使转染效率标准化。
蛋白质功能相互作用分析
利用Promega Checkmate哺乳动物双杂交系统检测RARγ与Zac1的相互作用。分别将亚克隆至pACT和pBIND载体的RARγ和Zac1用Lipofectamine LTX试剂转染至AD293细胞。以4:4:2的比例转染0.2μg pACT、pBIND和pG5-luc（GAL4-luc报告载体）。
蛋白聚糖分析
2×10接种新生骨骺软骨细胞4在10%FBS/αMEM中保持细胞/6mm良好。当融合时，培养物在αMEM/0.3%FBS中预培养24小时，用不同浓度的维甲酸处理4小时，并用5μCi/ml标记35硫酸硫持续20 h。通过测定蛋白酶消化后35S-硫酸钠与氯化十六烷基吡啶沉淀的材料的掺入量来测定蛋白聚糖的合成(Takebayashi等人，1995年).
为了测试RARγ或Zac1在蛋白聚糖合成中的过度表达，软骨细胞被转染RARγ（pCMV-HA-RARγ）、Zac1（pCMV-Zac1）或无插入表达载体，使用脂质体-赖氨酸LTX反向转染方案，其中将0.1μg DNA和0.4μl脂质体-LTX在20μl Opti-MEM培养基中分配到每个孔中。新分离的软骨细胞（5×104细胞）悬浮在10%FBS/αMEM培养基中，接种到预涂孔上。6小时后，将培养基更换为维甲酸缺失培养基（0.5%煤焦处理血清、1x ITS混合物和DMEM中0.5%BSA），用维甲酸处理培养物或不处理培养物。转染后24-48小时对细胞进行裂解以进行报告基因检测，或用5μCi/ml35S-硫酸钠20小时，以测量蛋白聚糖合成。使用接受相同处理的平行培养物来测定DNA含量(Johnson-Wint和Wellis，1982年).
结果
RAR基因表达模式
在这个项目的开始，我们确定了风险调整比率α,风险调整比率β和风险调整比率小鼠肢体生长板中的γ，令人惊讶的是，文献中仍然缺乏这方面的信息。在E15.5胚胎中，风险调整比率α和风险调整比率β轻度表达()，但是风险调整比率γ在静息区、增殖区和肥大前区表达非常强烈(，箭头），并在肥大区下调(，箭头）。在1周龄和3周龄小鼠的胫骨生长板中观察到类似的总体模式(（分别是），而且也有可观的风险调整比率软骨膜中α的表达()和风险调整比率γ在原发性海绵体中的表达(，箭头）。显然风险调整比率在哺乳动物的生长板和风险调整比率γ是表达最丰富的家族成员。
风险调整比率长骨生长板的表达模式。
(α-L)原位杂交分析风险调整比率α,风险调整比率β或风险调整比率使用野生型E15.5片段的γ表达(A-D公司)、1周龄（E-H）和3周龄(I-L公司)胫骨近端生长板和3周龄风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷胫骨生长板(M-P型). 在(D类)，箭头指向上部生长板区，而箭头指向肥厚区。在(五十、 P（P）)，双箭头指向初级海绵状突起。OC，次级骨化中心。尺寸棒：A-D，200μm；E-H，300μm；I-P为75μm。
条件化合物RAR缺乏小鼠
为了确定RAR在生长板中的作用，我们制作了双风险调整比率-交配牙线致软骨缺陷小鼠风险调整比率带有第2a1-Cre列老鼠(Ovchinnikov等人，2000年)（均为129/SvPas-C57Bl/6混合背景）。突变小鼠以孟德尔比率出生。确定风险调整比率缺失、肋骨和四肢生长板软骨碎片的DNA样本以及新生儿野生型（WT）和双胎肝的DNA样本风险调整比率-对缺陷小鼠进行基因组PCR，使用引物区分野生型（W）、漂浮型（F）和无效（N）等位基因(图S1).风险调整比率突变软骨中的基因已被删除，但肝脏中的基因未被删除(图S1). 的效率风险调整比率双重γ烧蚀风险调整比率α/风险调整比率γ-或风险调整比率β/随机存取存储器γ缺陷软骨几乎完全(图S1)，而效率风险调整比率α和风险调整比率β消融平均超过80%(图S1). 南方杂交也表明风险调整比率软骨中的基因被删除，但心脏、肝脏、大脑、脾脏和骨髓DNA中的基因没有被删除；删除效率超过95%随机存取存储器γ和约80%风险调整比率α和风险调整比率β (图S2). 3周龄儿童胫骨切片原位杂交风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷小鼠()证实了风险调整比率生长板中γ基因表达显著降低()，但在原发性海绵体上仍能观察到信号(，箭头）。
考虑到突变小鼠出生时的孟德尔频率和出生时的表现正常，我们对它们的年龄进行了密切监测。从大约3周开始，我们注意到风险调整比率α/风险调整比率γ-和风险调整比率β/风险调整比率γ-缺乏小鼠始终小于对照鼠（迄今为止，对照鼠表现为双鞭毛风险调整比率小鼠缺乏第2a1-Cre列) (). 到2个月时，突变雌性和雄性的总体生长发育迟缓，与对照组相比约为25%(). 这一趋势在四肢骨骼元素（如股骨）中得到证实(). 值得注意的是，小鼠缺乏风险调整比率α/风险调整比率β基因在两个体型上几乎与控制同卵双胞胎相似()和骨架元素长度(). 我们总共检查了来自不同窝的115多只小鼠（见图例详细信息）和上述表型变化风险调整比率α/风险调整比率γ-和风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷小鼠总是出现。显然风险调整比率α/风险调整比率γ或风险调整比率β/风险调整比率软骨中的γ基因导致显著的骨骼生长迟缓，而风险调整比率α/风险调整比率β缺乏是可以耐受的。
对照组和风险调整比率-缺陷小鼠。
(A类)这两个风险调整比率β/风险调整比率右侧的5周龄γ缺乏小鼠（表示为βγ缺乏）明显小于左侧的对照鼠。(B类)5周龄对照组与对照组相比，体重无明显差异随机存取存储器α/风险调整比率β缺乏的室友。(首席财务官)男性、女性对照组和双胎组的平均身体和股骨长度风险调整比率-8周龄缺陷小鼠。测量从鼻尖到骶骨区域的身体长度。本实验中分析的突变小鼠数量为：风险调整比率α/风险调整比率β缺陷型（αβ-def，n=13）和同窝对照型（αβ-cont，n=19），随机存取存储器β/风险调整比率γ缺陷（βγ-def，n=24）及其控制（βγ-cont，n=32），以及风险调整比率α/风险调整比率γ-缺乏（αγ-def，n=13）及其控制的同卵（n=14）。E和F中的对照是所有三个对照窝友的总数（n=65）。获得的数据经过了Mann-Whitney检验。*与βγ-def相比p<0.05；#与αγ-def相比p<0.05
生长板组织和功能
生长迟缓的原因是什么？正常情况下，生长板通过以下方式维持骨骼生长：（a）软骨细胞增殖；（b） 基质合成与积累；和（c）软骨细胞肥大(Hunziker，1994年;Wilsman等人，1996年). 为了确定这些参数是否以及哪些参数受到影响，对3周和5周龄的对照组和风险调整比率β/风险调整比率对γ-缺乏的窝友进行组织学、组织化学和基因表达分析。有趣的是，突变生长板的高度(，垂直绿线）在两个年龄段都持续短于对照组同窝伙伴(，垂直绿线）。缩短似乎主要影响上部区域(垂直红线），而肥厚区似乎基本上未受影响。
生长板组织、软骨细胞增殖和聚集蛋白聚糖表达分析。
(α-L)3周龄儿童胫骨近端生长板连续切片(A-B、E-F和I-J)或5周龄(C-D、G-H和K-L)控制和风险调整比率β/随机存取存储器对同窝出生的γ缺乏型进行组织学分析(A-D公司)和增殖标记物的原位杂交H4C型(E-H公司)或aggrecan（Agg）(I-L公司). 注意，突变生长板高度的降低（垂直绿线）主要影响上部区域（红线），在5周龄小鼠中更为明显。尺寸棒，75μm。
为了评估增殖情况，对相关切片进行了仔细的组织学评估和组蛋白4C的基因表达(H4C型)是有丝分裂细胞的一般标记。对照组3周龄和5周龄胫骨生长板增殖区软骨细胞的平均数量分别为180±13和179±5。有趣的是，这个数字下降到151±15和150±11英寸风险调整比率β/风险调整比率3周龄和5周龄胫骨生长板γ缺乏（p<0.01）。在处理的相关节段中观察到类似的趋势H4C型表达；突变增殖区中阳性软骨细胞较少(，箭头）比控件(，箭头）。
为了监测基质的合成和积累，我们重点关注聚集蛋白聚糖，因为它在生长板功能中具有重要作用。Aggrecan转录物在对照生长板中极其丰富，尤其是在增殖区和前肥厚区(). 相反，aggrecan的表达在风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷生长板(). 这些杂交是在相同的玻片上安装和处理对照和突变生长板切片，因此杂交信号是直接可比的。
为了可视化蛋白多糖，用藏红O或阿尔西安蓝对3周龄对照组和同一玻璃载玻片上的突变同窝鼠的生长板切片进行染色。在对照组中，染色很强()，但明显低于风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷生长板(). 在相同突变动物的其他部位（包括椎体终板和纤维环）也观察到蛋白聚糖含量降低(图S3).
长骨的组织化学和μCT分析。
(A-D公司)3周龄和5周龄对照组胫骨近端长骨生长板的纵切面风险调整比率β/随机存取存储器用藏红O或阿尔西安蓝对γ-缺乏的窝友进行组织化学蛋白多糖染色。注意突变生长板中的染色显著减少。(E-H公司)5周龄对照组和风险调整比率β/风险调整比率用μCT扫描γ缺乏的室友，并将其视为2D图片(E-F公司)或3D剪贴画(G-H公司). 注意突变样本中的小梁骨显著减少。
鉴于软骨内骨化也需要生长板功能(Chan和Jacenko，1998年;Jacenko等人，1993年)，我们预测上述生长板缺陷，尤其是aggrecan含量的下降(Poole等人，1982年)，应损害小梁骨形成。因此，我们对胫骨和股骨进行了控制风险调整比率-通过微计算机断层扫描（μCT）显示矿化组织。事实上，在风险调整比率β/随机存取存储器γ缺陷小鼠()和风险调整比率α/风险调整比率γ缺陷小鼠(表S1)而骨骼结构和质量在风险调整比率α/风险调整比率β缺陷小鼠(表S1).
总之，RAR是维持正常生长板和软骨细胞功能和骨形成所必需的，尤其是促进聚集蛋白聚糖的表达和含量。
RARs和蛋白聚糖表达
如果RARs确实有利于聚集蛋白聚糖基因的表达和生产风险调整比率、和风险调整比率γ尤其应增加此类参数。此外，由于生长板的增殖区和前肥厚区（其中风险调整比率γ和aggrecan强烈共表达）主要缺乏内源性维甲酸(冯·施罗德和海尔西，1998年),风险调整比率γ应作为无配体因子影响aggrecan的表达。为了测试这些有趣的可能性，用编码全长小鼠的CMV驱动表达质粒转染新生野生型小鼠的骺软骨细胞风险调整比率γ（HA标记）或控制空载体。细胞保存在含有0.5%炭样剥离无维甲酸血清的培养基中(Koyama等人，1999年)并被标记为脉冲35硫酸S-测定蛋白多糖的生成。显然，蛋白质多糖合成在风险调整比率γ转基因表达培养物与对照组比较(). 从3-4周大的肋骨分离出的软骨细胞产生了相同的数据（未显示）。为了证实上述数据风险调整比率β/风险调整比率对γ缺陷小鼠进行同样的实验。过度表达随机存取存储器γ转基因确实增加了这些突变培养物中蛋白聚糖的合成(). 有趣的是，未经治疗患者的基线蛋白聚糖合成风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷培养物始终低于野生型培养物，可能反映出内源性较低风险调整比率突变细胞中的基因水平().
蛋白质聚糖的合成和含量风险调整比率γ过度表达和反向激动剂治疗。
(A-B公司)对照和风险调整比率β/风险调整比率γ-缺乏软骨细胞培养物过度表达风险调整比率γ (pCMV-HA-RAR病毒γ） 或使用反向激动剂治疗后。(C-H公司)控制和风险调整比率β/风险调整比率未经处理的对照培养物（无）和用300 nM维甲酸（RA）或100 nM反向激动剂（INV）处理的伴随培养物中的γ-缺陷软骨细胞。(I-L公司)对照组和对照组的阿尔西安蓝染色风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷培养物用反向激动剂、RA或RARγ选择性激动剂治疗6天。在三个独立的实验中建立了结果的一致性。
当RAR为无配体时，它们作为转录阻遏物发挥作用(Koide等人，2001年;Kurosawa等人，1995年;Mannervik等人，1999年). 基于上述数据，我们可以预测RAR阻遏物功能的实验性增加将导致蛋白聚糖合成和水平的进一步增加。为了验证这个有趣的想法，我们使用了合成的类视黄醇类“反向激动剂”。与标准激动剂（刺激RAR转录活性）不同，反向激动剂通过增强辅阻遏物结合来刺激RAR阻遏剂功能(Germain等人，2002年;Gronemeyer等人，2004年;Klein等人，1996年;Thacher等人，1999年). 在煤焦处理的培养基中对半融合培养物进行100 nM反向激动剂（INV）处理2天；伴随培养物用载体（EtOH）处理。成立35S-硫酸盐在处理过的培养物中的作用几乎是未处理培养物的两倍(，白色直方图）。用100或300 nM的反向激动剂对配对培养物进行6天的治疗（每两天添加一次新鲜药物），以观察这种延长的治疗是否会导致蛋白聚糖含量升高。很明显，与对照组相比，长期治疗显著增加了阿尔西安蓝阳性蛋白多糖基质的数量(). 经过处理的软骨细胞被明亮且高度折光的轮廓包围（由细胞周蛋白多糖积累产生），其相显微镜外观也显示出这种增加()与未经治疗的软骨细胞更柔和的外观相比().
如果蛋白聚糖合成和积累的这些增加反映了阻遏物/共阻遏物功能的反向激动剂依赖性刺激，则可以预测（a）在用诱导配体依赖性RAR转录活性的标准类视黄醇激动剂处理的培养物中应该看到相反的情况；（b）在风险调整比率-缺乏文化。与这些预测一致，对照软骨细胞培养物的治疗-反式-维甲酸（RA）或RARγ选择性激动剂：（i）显著减少蛋白多糖积累(); （ii）使细胞的外观变得相当暗淡(); 和（iii）蛋白质多糖合成显著降低（未显示）。相比之下，这些参数在风险调整比率β/风险调整比率对RA或RARγ选择性激动剂无反应的γ缺陷培养物()和反向激动剂().
综上所述，上述数据强化了这样一个观点，即当在无维甲酸的条件下操作时，RAR，尤其是RARγ，有利于软骨细胞中的蛋白聚糖表达，因此可能作为无配体阻遏物。
寻找RAR辅阻遏物
哪些因素可能作为软骨中的RAR联合阻遏物？在其他系统中，研究最广泛的辅阻遏物是NCoR-1或NCoR-2/SMRT(Hermanson等人，2002年;Jepsen等人，2007年)但它们在生长板和骨骼生长中的可能功能尚不清楚。此外，研究表明，无配体RARα确实有效地招募NCoR-1和NCoR-2，但RARβ和RARγ没有(Wong和Privalsky，1998年). 鉴于此风险调整比率γ表达最丰富随机存取存储器在生长板中，我们使用以下标准搜索数据库，以确定潜在的RAR联合阻遏物候选物：（1）候选物应与核激素受体相关并具有阻遏功能；候选基因应在骨骼组织中表达。这项电子搜索让我们找到了Zac1(z（z）inc指蛋白调节细胞凋亡c自行车制动）(Spengler等人，1997年). Zac1可以作为核激素受体的转录共同阻遏物或共同激活物(Huang和Stallcup，2000年)有趣的是，老鼠缺乏Zac1号机组表现出生长迟缓和骨形成改变(Varrault等人，2006年). 我们发现Zac1在小鼠生长板软骨中有非常强的表达；NCoR1和NCoR-2也表达，但表达水平低5倍以上(). 小鼠生长板原位杂交证实Zac1号机组强烈表达，其表达模式与风险调整比率γ,Sox9指数和aggrecan(). 事实上，无维甲酸野生型软骨细胞培养物中的蛋白聚糖合成受到以下因素的刺激风险调整比率γ过表达，并且由于两者的过表达几乎增加了一倍风险调整比率γ和Zac1号机组(). 为了观察Zac1实际上与RARγ相互作用，我们过度表达了风险调整比率γ和Zac1号机组在AD293细胞系中，处理全细胞提取物进行Zac1免疫沉淀，然后进行RARγ的western blot；显然，Zac1与RARγ有关(). 为了测试Zac1是否在RARE水平上影响RAR功能，我们将野生型软骨细胞培养物与RARE报告基因构建物和全长小鼠联合转染Zac1号机组表达载体；平行培养物仅接受RARE报告基因构建体。显然，基本的RARE报告活动是降低通过Zac1号机组与对照细胞相比，反向激动剂AGN联合治疗可进一步降低过度表达(). 然而，基本的罕见报道活动是增加当内源性Zac1号机组或随机存取存储器siRNA抑制γ表达(). 抑制风险调整比率α表达没有影响，证明了随机存取存储器γ (); siRNAs的特异性在.
分析Zac1号机组表达模式、相互作用和功能。
(A类)：新生儿胫骨和股骨骺软骨转录共因子的实时PCR分析。表达水平是相对于GAPDH显示的。(B类)：的表达式模式Zac1号机组，聚合聚糖（Agc），风险调整比率γ和Sox9指数在E15.5小鼠胚胎胫骨的纵切面上，高倍（上面板）和低倍（下面板）观察。(C类)：在原代软骨细胞培养物中过度表达Zac1号机组和/或风险调整比率γ. 转染后24至36小时，在无维甲酸培养基中保存的培养物用35-硫酸盐脉冲标记。图中显示了三份培养基中的平均掺入+/-SD。*学生的p<0.05t检验对照空载体转染培养物的比较与Zac1和风险调整比率γ转染的培养物。(D类)：RARγ和Zac1之间物理相互作用的免疫沉淀和免疫印迹分析（左面板）。与免疫前兔IgG相比，通过全细胞裂解物的免疫沉淀证实Zac1抗体的特异性（右图）。(E类)：原代培养软骨细胞中罕见的报告活性Zac1号机组使用或不使用反向激动剂AGN治疗的过度表达（左面板）。使用或不使用维甲酸（RA）治疗的类似分析（右图）。(F类)：哺乳动物双杂交分析表明，RARγ和Zac1相互作用可引发非常强的报告活性（实心黑色柱）。pACT-MyoD和pBIND-Id作为阳性对照，无插入pACT和pBIND作为阴性对照。(G公司)智能池siRNA特异性混合物转染后原代培养软骨细胞中罕见的报告活性Zac1、RARα或随机存取存储器γ无（-）或（+）与100nM反向激动剂联合治疗；对照组使用非特异性（NS）。(H-I公司)转染siRNAs后指示基因内源性RNA水平的RT-PCR分析Zac1号机组(H（H）)或风险调整比率γ (我); 注意，在每种情况下，只有靶RNA减少。所有报告检测的转染效率均通过联合转染的phRG-SV40载体产生的Renilla荧光素酶活性进行标准化。进行了两个独立的siRNA转染实验和三个独立的其他转染实验，并产生了类似的结果。
蛋白多糖表达的调节
RAR的明显阻遏功能如何有利于聚集蛋白基因的表达？一种合理的可能性是无配体RAR刺激袜队9是软骨生成的关键调节器(Bi等人，1999年)并且是aggrecan表达所必需的(Bridgewater等人，2003年;Lefebvre和Smits，2005年). 为了评估这种可能性，用100 nM的反向激动剂（INV）处理原代半融合软骨细胞培养物2天；为了进行比较，用标准激动剂（RA）处理伴随培养物。对整个RNA进行RT-PCR处理。反向激动剂治疗确实会同时刺激aggrecan和Sox9指数表达式()而RA抑制了两者(). 在转染有索克斯包含4×48 bp Sox结合的报告结构第2a1列增强剂(Zhou等人，1998年) (). 验证这些药物在基因组水平而不是通过其他途径调节RAR功能(Aggarwal等人，2006年;Alsayed等人，2001年)，控制和随机存取存储器-用RARE报告质粒转染标准培养基中缺陷软骨细胞培养物，并用反向激动剂、RA或RARγ选择性激动剂处理。在对照组培养中，反向激动剂显著降低了基线报告活性()如上所示（参见)而RA或RARγ选择性激动剂显著刺激(). 使用风险调整比率α/风险调整比率β缺陷培养物(). 然而，在缺乏风险调整比率β/风险调整比率γ ()或风险调整比率α/风险调整比率γ ().
aggrecan和Sox9指数表达水平和模式。
(A-C公司)Aggrecan和Sox9指数表达水平（A-B）和4x48bp索克斯与未经处理的培养物相比，用100 nM反向激动剂（INV）或1μM RA处理的原代软骨细胞培养物中的报告活性（C）（无）。(D-K公司)很少有记者活动受到控制，风险调整比率α/风险调整比率β-,风险调整比率β/风险调整比率γ-和风险调整比率α/随机存取存储器用反向激动剂、RA或RARγ选择性激动剂治疗前（无）或治疗后的γ缺陷软骨细胞培养物。所有报告分析重复3-5次，我们获得了可重复的结果。(L-O型)原位杂交分析Sox9指数3周龄（L-M）和5周龄（N-O）对照组（L和N）胫骨近端生长板中的表达风险调整比率β/风险调整比率γ-缺乏（M和O）的同窝伴侣。
如果RAR如上述数据所示，通过Sox9调节aggrecan表达，人们预计会看到Sox9指数表达伴随着aggrecan表达的减少风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷生长板。根据这一预测Sox9指数3周龄和5周龄突变体与对照生长板的转录本().
讨论
该研究为RAR在骨骼生长中的作用提供了全新的见解。我们发现RARs在出生前和出生后小鼠长骨生长板的不同区域有差异表达，其中RARγ是表达最丰富的成员，其表达显著地表征了上部区域。并发缺陷风险调整比率α/风险调整比率γ或风险调整比率β/随机存取存储器软骨中的γ导致生长板同时出现缺陷，最显著的是其总高度降低，软骨细胞增殖和聚集蛋白聚糖表达及含量降低。这些生长板缺陷与原发性海绵状骨和小梁骨的紊乱有关，与对照组同窝婴儿相比，这些缺陷不符合标准。由于软骨细胞增殖和基质沉积是决定生长速度的最关键因素之一(Hunziker，1994年;Wilsman等人，1996年)，这两个参数的不足很可能直接导致突变小鼠的骨骼生长迟缓。很明显，RAR在生长板软骨细胞功能和对骨骼生长产生局部影响方面具有显著的但以前未被认可的作用。这些数据相关性很好，极大地扩展了以前用一般对偶方法获得的结果风险调整比率α/风险调整比率γ-或随机存取存储器β/风险调整比率γ-阴性小鼠(Mendelsohn等人，1994年). 在这些小鼠中观察到的额外骨骼畸形及其新生儿死亡率可能反映了由于普遍的双重RAR缺失而导致的更广泛的系统缺陷。另一方面，单个RAR-null突变体中相对轻微的缺陷重申了其他家族成员可以弥补缺乏一个RAR基因的想法。
产后生长迟缓
我们的数据表明，骨骼生长迟缓影响风险调整比率α/风险调整比率γ-和风险调整比率β/随机存取存储器γ-缺乏小鼠在出生后3周左右变得明显，在成年期继续存在，并且在以后的年龄段没有得到补偿。年轻时明显缺乏生长迟缓，这与我们的观察结果密切相关，即突变小鼠出生时具有预期的孟德尔频率，因此可能在产前发育阶段对RAR缺乏症很难耐受。长期以来，人们都认识到，胎儿骨骼的生长在很大程度上受包括印度刺猬在内的局部自分泌和旁分泌因素的控制，而出生后系统因素变得很重要(Fowden，1995年;Kronenberg，2003年;Nilsson等人，2005年). 例如，生长激素在小鼠胚胎骨骼生长中没有明显作用，尽管其受体表达，但GH缺乏会导致出生后2周左右开始的生长迟缓。相关研究表明，生长激素和胰岛素样生长因子1（或肝脏IGF-1和不耐酸亚基）同时缺乏会导致出生后3周左右开始的小鼠骨骼发育严重迟缓(Lupu等人，2001年;Yakar等人，2002年). 在表达人类FGF-R3无软骨增生突变型的转基因小鼠中观察到类似的趋势；这些小鼠在产前和新生儿期明显正常，但从4周龄开始生长迟缓，同时生长板软骨细胞增殖减少(Naski等人，1998年). 显然，骨骼生长是一个复杂的过程，在产前和产后生活中遵循多种常见和不同的途径和机制。我们的数据表明，RAR缺乏在产前和新生儿生长期间具有良好的耐受性，但无法得到补偿，并且从3周龄开始，由于聚集蛋白聚糖生成和沉积以及软骨细胞增殖的减少，对生长有害。RAR缺乏是否影响软骨细胞对系统性因素的反应能力以及受其影响尚待确定。
维甲酸和阻遏功能
软骨因其无血管性而在组织中是独特的，生长板软骨也不例外，尤其是在其上部区域。事实上，生长板在很大程度上是缺氧的，并且对应对这种异常代谢状态所需的基因消融非常敏感(Schipani等人，2001年). 由于没有血管，上层生长板区域很可能无法接受肝源性、血源性和蛋白质结合的维甲酸前体，而这些前体是细胞内生产生物活性维甲酸所必需的(布兰纳和奥尔森，1994年)因此基本上不含此类视黄醇。事实上，von Schroeder和Heersche展示了一种广泛使用的稀有报告鼠系列(Rossant等人，1991年)小鼠肢体生长板的上部区域几乎没有报告活性，因此也没有活性的类视黄醇，而在下部肥大区域和其他富含类视黄醇的器官中可以检测到报告活性(冯·施罗德和海尔西，1998年). 我们通过生物测试获得了类似的证据(Koyama等人，1999年)现在已经使用LC/MS/MS程序通过直接测量进行了确认(Kane等人，2005年)（手稿正在准备中）。总之，这些研究表明，在上部生长板区表达的RAR可能缺乏活性配体，并且可能主要（如果不是唯一的）发挥无配体阻遏功能。在我们的风险调整比率α/风险调整比率γ-或风险调整比率β/风险调整比率因此，γ缺乏小鼠可能是由于缺乏这种阻遏物功能所致。
核受体介导的转录抑制在调节发育过程中与转录激活一样重要(Kurosawa等人，1995年;Mannervik等人，1999年). 例如，不符合项报告-或HDAC1型-空白小鼠在妊娠期间死亡(Jepsen等人，2000年;Lagger等人，2002年)和消融HDAC4型（通常由肥大前软骨细胞表达）扰乱生长板软骨细胞成熟并导致过早肥大(Vega等人，2004年). 可以想象，在上部生长板区域表达的无配体RAR，尤其是RARγ，可以与HDACs（如HDAC4）合作抑制靶基因，维持这些区域的软骨细胞功能，包括聚集蛋白表达，并允许生长板和骨骼以正常速度生长。有趣的是，我们的数据表明Sox9指数基因表达在风险调整比率β/风险调整比率γ-缺乏的生长板，在培养的软骨细胞中受到反向激动剂治疗的刺激（同时刺激蛋白聚糖合成）。最近的一份相关报告显示，配体结合的RARs或TNFα通过限制p300的可用性来抑制软骨基质基因的表达，p300是Sox9活性的重要辅因子(Rockel等人，2008年). 研究结果表明，当RARs缺乏配体时，可用于激活Sox9的p300增加。因此，生长板中RAR阻遏物功能的正常体内作用可能有利于袜队9与p300一起表达和功能，并促进软骨细胞表型。类似的RAR阻遏物功能，主要由RARα介导，在肢体间充质软骨细胞分化过程中发挥作用，是最初上调袜队9基因表达(Weston等人，2002年). 这些作者认为RARα依赖性阻遏物功能将直接阻断“基因X”的表达，该基因是Sox9指数基因表达。尽管软骨生成中基因X的性质尚不清楚，但在其他系统中也取得了进展。例如，Jepsen等人最近报道，NCoR-2/SMRT和无配体RAR合作直接抑制组蛋白去甲基酶的表达JMJD3公司这样，神经干细胞分化为神经元的正常时空进程就得以实现(Jepsen等人，2007年).
Zac1作为潜在的联合阻遏物
虽然生长板软骨中RAR抑制的假定直接靶点的性质也有待进一步研究，但我们目前的数据已确定Zac1是可能的RAR辅因子。我们的数据不仅表明Zac1号机组表达模式与风险调整比率生长板中的γ，但也表明：Zac1在功能上与RARγ相关；Zac1号机组在无维甲酸的软骨细胞培养中，过度表达进一步促进了蛋白聚糖的生成；如RARE报告分析所示，Zac1和RARγ协同降低转录率。如上所述，Zac1是许多发展过程的基本因素(Spengler等人，1997年)、和Zac1号机组-空白小鼠出生时死亡，表现出明显的缺陷，包括生长迟缓和骨形成改变(Varrault等人，2006年). 这些作者进行了详细的电子网络基因分析，进行了直接启动子和基因表达测试，并得出结论，Zac1是许多系统基因的上游，包括Igf2/H19、Cdkn1c和深1，这将共同控制胚胎生长。由于Zac1号机组-没有对空白小鼠进行研究，作者没有阐明一般消融Zac1号机组had用于局部软骨细胞和/或成骨细胞功能。根据我们的数据，我们可以推测Zac1号机组可能降低了生长板中RAR阻遏物的功能，可能影响了受条件RAR消融（如aggrecan表达）影响的相同表型性状，甚至可能由于上游基因表达不规范而产生额外的系统性后果。
我们的两个杂交试验表明，Zac1和RARγ表现出功能性相互作用，这可能反映了物理相互作用。就像RAR一样(Chambon，1996年)Zac1被区分为几个功能域：一个N末端锌指区；中心脯氨酸富集区；富含疏水性氨基酸的小而高度保守的基序（称为ΦXXΦ基序或NR盒）；和C端P/E富域(Spengler等人，1997年). Huang等人使用下拉分析表明，Zac1与雄激素、雌激素和甲状腺激素受体的AF2结构域相互作用(Huang和Stallcup，2000年)Zac1可能与RAR中的同一域交互。有趣的是，我们的电子分析尚未确定Zac1中与HDAC相互作用的一致序列（未公布的数据）。因此，可能的Zac1/RAR复合物可能通过与其他HDAC结合因子的结合间接招募HDAC，或可能使用替代策略，包括NCoR1所示的SUMO化(Tiefenbach等人，2006年).
生长板功能失调
聚集蛋白聚糖表达、软骨细胞增殖和小梁骨沉积同时减少，表明RARs对生长板正常功能的多种重要贡献。正如我们的体内和体外数据所表明的那样，RAR功能降低可能导致袜队9基因表达会导致aggrecan表达降低和基质沉积不达标。这些发现和结论的一个非常有趣和深远的含义是，通过遗传手段或药物（例如我们研究中使用的药物）对软骨中RAR阻遏物功能的实验刺激可能具有治疗价值，并可用于稳定或改善软骨细胞（包括关节软骨细胞）的表型和基质生成。
RAR缺乏小鼠的其他生长板变化的原因是什么？软骨细胞增殖显然对骨骼的发育和生长至关重要，可以抵消软骨-骨交界处肥大软骨细胞的丢失。软骨细胞增殖受系统因素控制(Nilsson等人，2005年)以及印度刺猬（Ihh）监管的当地机制(Shimo等人，2004年;St-Jacques等人，1999年). 有趣的是，发现用维甲酸（诱导RAR转录活性）处理生长板软骨细胞培养物可以强烈抑制Ihh公司表达式(Wu等人，2002年). 因此，在正常情况下，上生长板区无配体RAR阻遏物的功能可能有助于维持生理Ihh公司表达水平。
同样，尚待澄清的是，是什么原因导致了在风险调整比率α/风险调整比率γ-或风险调整比率β/风险调整比率γ-缺陷小鼠。如上所述，人们早就意识到，骨小梁沉积需要正常的生长板功能和正常的基质组成。Poole及其同事的工作首次揭示了这种先前未被怀疑的范式，他们最初表明聚集蛋白聚糖存在于原发性海绵小梁的钙化软骨核心中，随后在继发性海绵细胞形成后通过蛋白水解作用被清除(Poole等人，1982年). Jacenko及其同事提供了第一条遗传线索，他们发现生长板X型胶原功能改变的小鼠会发展成骨骼造血疾病表型，包括生长板受压、原发性海绵细胞减少和骨髓发育不全(格雷斯和杰森科，2000年). 最近，一个有趣的发现是，小鼠中RARγ（而非RARα）的普遍缺失实际上会导致骨髓缺陷，其特征是造血干细胞改变，甚至在衰老过程中小梁骨显著减少(Purton等人，2006年;Walkley等人，2007年). 很明显，生长板和骨髓之间存在必要且密切的相互作用，这是骨骼生长的生理过程以及造血和骨祖细胞的发育所必需的，这些细胞可能会因生长板或骨髓的故障而紊乱。
