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基因组研究。2009年1月；19（1）：12–23。
数字对象标识：10.1101/gr.086082.108
预防性维修识别码：PMC2612960型
PMID：19047519

新引入的基因组原噬菌体岛是利物浦流行株体内竞争力的关键决定因素铜绿假单胞菌

克雷格·温斯坦利,1 摩根·G.I.兰吉尔,2 乔安娜·福瑟吉尔,1,6 伊雷娜·库卡维卡·伊布鲁尔吉,三，6 凯瑟琳·帕拉迪斯·布鲁,三，6 弗朗索瓦·桑沙格林,三，6 尼古拉斯·R·汤姆森,4 杰夫·L·温莎,2 迈克尔·A·鹌鹑,4 尼古拉·伦纳德,4 亚历山德拉·比涅尔,4 路易斯·克拉克,4 凯西·西格,4 大卫·桑德尔斯,4 大卫·哈里斯,4 朱利安·帕克希尔,4 罗伯特·汉考克,5,7 菲奥娜·布林克曼,2和罗杰·列夫斯克三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

铜绿假单胞菌分离物具有高度保守的核心基因组，占总基因组序列的90%，并带有额外的可变辅助基因，其中许多位于基因组岛或胰岛中。1996年在一个儿童囊性纤维化（CF）单元中发现了利物浦流行株（LES），随后在英国的几个中心进行了观察，这对之前广泛存在的假设提出了挑战，即CF患者只获得独特的囊性纤维化菌株铜绿假单胞菌从环境出发。为了了解影响这一重要流行株发展的因素，对最早存档的LES分离物LESB58的基因组进行了测序。序列显示存在许多大的基因组岛，包括五个原噬菌体簇、一个缺陷（pyocin）原噬菌器簇和五个非噬菌体岛。为了确定这些簇的作用，进行了无偏见的标记突变研究，然后在慢性大鼠肺部感染模型中进行选择。通过测序鉴定了47个突变体，包括已知参与假单胞菌属感染。此外，还鉴定了来自四个原噬菌体簇和一个基因组岛的基因，并与亲本分离物进行了直接竞争研究；在慢性大鼠肺部感染模型中，有四种药物对竞争力有强烈影响。这强烈表明，增强体内竞争力是维持和多样化选择这些基因组原噬菌体基因的主要驱动因素。

铜绿假单胞菌是一种普遍存在的生物，广泛分布于环境中，包括土壤和水，并与各种活的宿主生物共生。它是人类机会性感染最常见的原因之一，也是囊性纤维化（CF）患者最终致命、持续呼吸道感染的最常见原因。人们认为它的多才多艺是由于它的遗传复杂性。四个菌株的测序(Stover等人，2000年;Lee等人，2006年;Mathee等人，2008年)，以及其他人的分子遗传学分析，揭示了一个约6至7-Mb的基因组，具有约5500个开放阅读框。基于前两者的比较铜绿假单胞菌PAO1菌株的基因组测序(Stover等人，2000年)和PA14(Lee等人，2006年)（在对240株菌株的一项研究中，后者是在不同生境中遇到的最常见的基因型；Wiehlmann等人，2007年)结果表明，有一个高度保守的核心基因组，占总基因组序列的90%；随后的研究揭示了核心基因组的惊人相似性，平均核苷酸差异为～0.5%（每200个核苷酸中就有一个）。其他可能发生的变化包括核心基因因缺失而丢失，或因突变而丢失表达（例如，pyoverdine和O-抗原生物合成基因；Spencer等人，2003年).

除了这个核心基因组外，还有一些可变的辅助基因，这些基因主要与基因组岛（GI）和胰岛有关，这些岛屿受到所谓的多样化选择，或由于某些选择压力而发生的快速变化。其中一些GI已被很好地描述，包括可移动的108-kb致病岛PAPI-1(邱等人，2006)在PA14菌株中携带几个调节基因，包括聚乙烯吡咯烷酮调节抗生素耐药性和生物膜形成，一个较小的（11-kb）PA14致病岛PAPI-2编码外毒素ExoU，PAK的14基因岛编码鞭毛蛋白糖基化机制(Arora等人，2001年)PAO1（但广泛分布）中的两个串联缺陷噬菌体（pyocin）岛是氟喹诺酮敏感性的决定因素(巴西和汉考克2005)和来自克隆C分离物的103-kb可移动GI pKLC102，其似乎包含质粒和噬菌体特征的混合物(Klockgether等人，2004年). 虽然已经研究了这些具体的例子，并且对多样化地理信息的一般特征也有了很好的了解，但对于形成基因组多样性的力量是什么，仍然存在相当大的争议铜绿假单胞菌分离物，特别是可变的辅助基因提供了哪些选择优势。我们认为，从CF患者肺部发现流行菌株为解决这一问题提供了前所未有的机会。

普遍认为CF患者只获得独特的铜绿假单胞菌在英国利物浦的一家儿童CF单位，当分子分型用于证明一种β-内酰胺耐药菌株，即现在的利物浦流行株（LES）的传播时，受到了来自环境的挑战(Cheng等人，1996年). 英国其他CF流行株的后续鉴定(斯科特和皮特2004;Lewis等人，2005年)和澳大利亚(Armstrong等人，2003年;O’’Carroll等人，2004年)表明可传播铜绿假单胞菌在一些CF中心，菌株对患者的感染起着重要作用。LES是从英格兰和威尔士CF患者中分离出的最常见克隆(斯科特和皮特2004)苏格兰也有报道(Edenborough等人，2004年). 此外，LES可导致二次感染(McCallum等人，2001年)，在干燥表面上的生存能力增强(Panagea等人，2005年)与其他疾病相比，与更高的患者发病率相关铜绿假单胞菌菌株(Al-Aloul等人，2004年). 在两起罕见的病例中，一名CF患者向两名非CF父母传播LES菌株，导致严重的发病率和持续感染(McCallum等人，2002年)，以及从CF患者到宠物猫(Mohan等人，2008年). LES菌株，包括LESB58菌株，表现出一种不寻常的表型，其特征是早期（生长曲线中）细胞敏感性依赖的群体感应调节子过度表达，包括毒力相关的分泌因子，如LasA、弹性蛋白酶和绿脓杆菌素(Salunkhe等人，2005年;Fothergill等人，2007年). 此外，已知LESB58是一种生物膜增生因子(Kukavica-Ibrulj等人，2008年). 因此，LES是一种成功且具有攻击性的克隆，特别适合CF肺。虽然所有铜绿假单胞菌这些菌株与其他引起慢性感染的CF菌株一样，本质上对抗生素具有耐药性，LES很容易发生突变，对治疗中使用的常见抗生素产生耐药性（尽管LESB58不像许多其他成熟CF分离株（包括其他LES分离株）那样具有突变表型）。事实上，LES首次被确定是因为铜绿假单胞菌在常规使用头孢他啶单药治疗的诊所中表现出头孢他定耐药性的菌株(Cheng等人，1996年). 对多个LES分离株的调查表明，该菌株也能对美罗培南、氨曲南、妥布霉素和环丙沙星产生耐药性(Fothergill等人，2007年).

这个铜绿假单胞菌之前将菌株PAO1和PA14与LES分离物LESB58进行比较，以评估慢性肺部感染大鼠模型中的体内生长、感染动力学、细菌持久性和组织内定位(Kukavica-Ibrulj等人，2008年). 三个人铜绿假单胞菌在竞争性体内试验中，菌株在体内表现出相似的生长曲线，但在肺组织分布和毒力方面存在差异。LESB58菌株持续存在于用于将细菌输送至支气管腔的琼脂糖珠中，而PAO1和PA14菌株被发现扩散到肺泡区域，并在感染后14天以大菌落的形式生长。

为了了解影响这一非常重要的流行株发展的因素，我们对最早的LES分离物LESB58的基因组进行了测序。LESB58是1988年从一名利物浦CF患者身上获得的，早于首次发表LES研究的8年(Cheng等人，1996年). 序列显示存在许多大型GI，包括五个前吞噬簇、一个缺陷（pyocin）前吞噬簇和五个非吞噬岛。为了确定这些簇的作用，我们在慢性大鼠肺模型中进行了无偏见的标记突变（STM）研究和筛选。数据显示，前噬菌体簇中的基因对该慢性感染模型的竞争力产生了强烈影响，表明这些前噬菌器基因的获得有助于LES菌株的成功。

结果和讨论

基因组测序

使用鸟枪法和基因组整理技术对LESB58的基因组进行了全面测序，如图所示图1中提供了统计信息表1。基因组是使用自动方法和手动管理相结合的方式进行注释的（参见方法），可通过假单胞菌属基因组数据库位于网址：www.pseudomonas.com，表示所有已完成的存储库假单胞菌属迄今为止公开发布的基因组序列。

表1。

铜绿假单胞菌LES基因组统计

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一使用倒数最佳BLAST点击数和基因合成酶分析相结合的方法确定正交曲线，并通过Ortholuge进行一些验证。有关详细信息，请参见方法。

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的环形地图铜绿假单胞菌LES基因组。从开始最外面的循环前进向内：基因组的主要（500 kb）和次要蜱虫（100 kb）测量值以及估计的起源位置；原噬菌体（橙色）和基因组岛（绿色）在所有轨道上突出显示；正链（外链）和负链（内链）上的蛋白质编码基因（蓝色）；tRNA（绿色）、rRNA（橙色）和所有其他非编码RNA基因（紫色）；标记突变体（黑色）；GC含量（外部黑线图）和GC含量平均值（灰色线）；使用10-kb非重叠窗口计算GC偏移（内部黑线图）。请注意，在第一个注意到的原噬菌体上游的一个低GC区域，加上其他较小的低GC区域，包含核糖体基因，这些基因通常已知在基因组中具有较低的GC。原噬菌体中两个高度相似的基因组区域（长度分别为7.5 kb和13.5 kb）的位置用环紫色线标记，在它们的位置之间最里面的圆形。已确定的原噬菌体和GI分布在基因组周围，但有一个显著的LESGI-1、LESGI-2和LESGI-3簇，反映了GI插入的非随机性铜绿假单胞菌(Wiehlmann等人，2007年). 通过计算确定了九个区域中七个区域的显著序列组成偏差(表2)图中这些区域的GC含量偏离平均值。

毒力基因

LESB58基因组几乎携带了所有已知的铜绿假单胞菌265个铜绿假单胞菌PAO1菌株毒力因子编码序列（CDS）的描述(Wolfgang等人，2003年)，LESB58基因组中除两个外均存在。PAO1 PA2399的明显同源CDS(pvdD（光伏驱动）)和PA1392不存在。PA2399是一种假定的非核糖体肽合成酶，位于I型吡咯烷合成基因簇内。相反，LESB58基因组携带用于合成III型吡咯烷的基因，其中包括一种类型特异的pvdD（光伏驱动）(Smith等人，2005年). 值得注意的是，在LESB58菌株的基因组中有新的pyoverdine相关基因重复，该菌株携带三个相同的fpvA（英尺/加仑）基因（编码III型吡咯烷受体）和邻近基因聚乙烯吡咯烷酮（编码ABC运输器）。的两个附加但被截断的版本pvdF型也存在。PA1392是一种功能未知的假想蛋白质。一些与毒力相关的LESB58 CDS与菌株PAO1不同，包括与PA1695匹配的菌株(pscP（磅/平方英寸）)和PA2525-7(pilABC公司). LES基因组包含III型分泌基因pscP公司，但与菌株PAO1预测蛋白相比，预测蛋白中存在10个残基缺失（5′-PTPTPTPT-3′；位置108–117）。在下文进一步描述的STM研究中，对毒力进行了进一步分析。

运动细胞器

IV型菌毛的变化桩轨迹并不罕见(Kus等人，2004年). LESB58基因组包含PilB和PilC CDS，与PAO1同源基因的同源性分别为88%和84%，但两者都匹配铜绿假单胞菌2192株同源性为99%。LES推测的PilA与之前报告的异常PilA相同（GenBank登录号：。AAC63060型)(Pasloske等人，1988年)但与PAO1直系同源性仅为32%。然而，在这方面最重要的是，亲本菌株和测试的克隆衍生物完全没有任何形式的运动能力，包括鞭毛依赖的游泳运动能力、菌毛依赖的抽搐运动能力和粘度调节的群集运动能力（补充表1），与观察结果一致，即与菌株PAO1和PA14不同，LES倾向于与大鼠慢性肺模型中使用的琼脂珠保持紧密联系(Kukavica-Ibrulj等人，2008年). 利用电子显微镜，我们在LESB58表面既没有发现鞭毛也没有发现菌毛，这解释了运动能力的丧失。一个整体铜绿假单胞菌PA14基因组突变文库对群集运动缺陷的筛查显示，PA1628突变体的运动能力较低（E.Torfs和R.E.W.Hancock，unpubl.），LESB58中的等效基因是一个假基因（PLES_36981/91）（有关已识别的所有假基因的列表，请参阅补充表S2）。类似地，与其他假基因（PA2023、PA2026、PA2399、PA4688、PA5454、PA5655）同源物相邻的其他基因在铜绿假单胞菌第14页。

吩嗪生物合成

荧光法生产吩嗪类化合物假单胞菌属物种是在微生物竞争中发挥作用的代谢物，似乎在铜绿假单胞菌.与其他铜绿假单胞菌基因组，LESB58的基因组包含两簇编码假定的吩嗪生物合成途径的基因。一个簇与PAO1菌株的簇相匹配电话A2-电话G2（PA1899–1905）但包含phzB型与PAO1具有更大同源性的基因phzB1型（PA4211）。第二个簇从PAO1菌株的直系同源基因开始电话A1-phzB1型（PA4210-4211），但下游基因与PAO1的同源性更高phzC2-phzG2型。

脂多糖

LESB58的基因组携带一簇脂多糖（LPS）O抗原血清型O6基因(Raymond等人，2002年). O6是一种常见的血清型(Pirnay等人，2002年)与英国CF种群中第二流行的克隆，Midlands 1株共享(Smart等人，2006年a). 然而，对于许多成熟的CF菌株(Hancock等人1983)，LES菌株不分型，因此可能含有缺乏O抗原的粗糙LPS。一个可能的原因是GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因的假基因突变(人民币元，PA5453的同源物），位于LPS生物合成基因簇内。已经证明人民币元敲除突变体缺乏A带LPS生物合成(Rocchetta等人，1998年).

抗生素耐药性

最初的LESB58菌株没有表现出显著的抗生素耐药性，尽管与其他菌株一样铜绿假单胞菌感染CF个人肺部的分离物，一旦建立，几乎不可能根除(汉考克和斯佩特2000). 在这种情况下，抗生素治疗可以抑制最初的感染，但随着时间的推移，抗生素的疗效越来越差，对一种抗生素又一种抗生素产生了耐药性。虽然许多CF分离物获得了超突变能力，例如通过其多吨或静音系统基因，LESB58不是超突变的，尽管该流行株的后续分离株已经获得了这种状态(Fothergill等人，2007年). 然而，在随后的分离物中观察到的抗性发展种子确实存在于染色体中。β-内酰胺耐药性的主要原因是C类染色体β-内酰酶（PA4110）及其同源物的去表达，所有辅助调节基因的去表达都存在于基因组中。多药耐药性的另一个主要原因是特定外排泵的表达降低，其中铜绿假单胞菌品种繁多。观察到某些外排泵基因突变。例如，MexEFOprN的正调控因子，墨西哥湾（PA2492同源），是LESB58中的一个假基因，而墨西哥法郎（PA2494）基因存在但发生了突变，这让我们怀疑MexEFOprN外排系统的操作性最低，可能在LES中无法去抑制。同样，MexZ（PA2020）也是一个假基因。然而，导致固有和突变抗性的主要外排泵MexABOprM和辅助系统MexCDOprJ完好无损。在其他表现出更大抗菌耐药性的LES菌株中，AmpC的抑制和墨西哥卢比和墨西哥分别与MexAB-OprM和MexXY外排泵的上调有关(Salunkhe等人，2005年). 在被标注为功能类别“抗生素耐药性和敏感性”的31个PAO1 CDS中假单胞菌属基因组数据库，仅PA2818(阿珥)LES的基因组中不存在假定的氨基糖苷反应调节剂。

LES噬菌体基因簇

分离物LESB58包含六个前噬菌体基因簇，这里称为前噬菌器1-6(表2;图2; 补充表3），其中四个不在菌株PAO1中。LES原噬菌体1基因簇是一个有缺陷的原噬菌器，预计编码pyocin R2。在PAO1菌株中，两个串联的基因簇编码pyocin R2和F2，预计这两个基因簇都是从噬菌体尾部基因进化而来的。已经证明，在铜绿假单胞菌(Nakayama等人，2000年;Ernst等人，2003年). LES基因组携带pyocin R2（P2噬菌体同源）簇（PLES06091–PLES06271），但不携带pyocinF2（噬菌体λ同源）簇。它还携带了pyocin S2（PLES41691）。

表2。

已确定的基因组岛和原噬菌体区域

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一除了前噬菌体2和3以及LESGI-5外，未进行PCR分析的区域给出了近似的起始和终止位置。

b条如果alien_hunter发现大部分区域存在序列偏差，则表示序列组成偏差(Vernikos和Parkhill 2006)或IslandPath:DIMOB(Xiao等人，2005年)方法。

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LESB58中发现的噬菌体簇与体内筛选后的STM突变体具有显著相似性和定位。

LES原噬菌体2基因簇长42.1kb，包含44个CDS，其中32个与已测序的噬菌体F10同源(Kwan等人，2006年)，是的成员长尾病毒科家庭。在检测到同源基因的地方，两个噬菌体基因组之间保持了同步性，但匹配区域散布着不匹配的CDS（表S3）。通过设计从原噬菌体2和3的每个末端区域读出的PCR引物，并对产生的扩增物进行测序，我们能够确定这些原噬菌素序列的确切起点和终点(表2).

LES原噬菌体3基因簇为42.8kb，包括53个CDS。该原噬菌体的13.6-kb区域包含16个CDS，与原噬菌器2的一个区域具有82.2%的同源性，与噬菌体F10同源。LES原噬菌体3的其余大部分类似于铜绿假单胞菌2192株基因组。然而，LES原噬菌体3也包含7.5-kb区域（11CDS），与LES原噬菌体5的区域具有99.8%的同一性。LES原噬菌体4与转座噬菌体D3112具有高度相似性(Wang等人，2004年)但有一些变化，特别是在一个终点。LES前噬菌体5与噬菌体D3有相当大的相似性(Kropinski 2000年)尽管有证据表明存在大量的基因重排(图2). 尽管它们与已知噬菌体相似，但LES前噬菌体4和5携带假定的计算机接口这些基因分别与相关噬菌体D3和D3112的基因差异很大（补充图1）。

LES原噬菌体6基因簇与噬菌体Pf1的基因组相似(Hill等人，1991年). 有人认为Pf1基因在CF感染中可能很重要，因为Pf1在氧气供应减少的情况下上调(Platt等人，2008年)与抗生素抗菌效果的增强有关(Hagens等人，2006年)，并在铜绿假单胞菌人群生物膜(Webb等人，2003年,2004;Sauer等人，2004年;Mooij等人，2007年). 然而，由于大多数临床分离株携带Pf1类噬菌体，这些活性并不局限于成功的CF菌株，如LES(Finnan等人，2004年).

四种前噬菌体基因簇产生功能性噬菌体颗粒的能力

为了测定LES原噬菌体2-5基因簇的活性，我们设计了PCR检测方法，以检测培养上清液中用亚抑制浓度诺氟沙星诱导后的噬菌体DNA。这些PCR检测只有在存在噬菌体颗粒的情况下才是阳性的，因为它们需要存在一种循环形式的基因组来观察产品。同样，我们进行PCR分析以确定煮沸细胞中是否存在这些序列。在26株LES临床分离株中测定了LES前噬菌体2-5的噬菌体序列分布(表3). 在所有26个测试菌株中都发现了前噬菌体3和4，而在测试的26个菌株中有23个发现了前吞噬物2。虽然在一些临床分离物中观察到这些分离物中的每一个都产生了噬菌体颗粒，但在测试的分离物中，分别有12、18和25个分离物产生前噬菌体3、2和4颗粒，存在着显著差异。相反，D3样前噬菌体5基因簇仅由少数（26个分离株中的8个）LES携带，尽管每个分离株都能产生噬菌体颗粒。我们能够通过菌斑试验分离LES前噬菌体2和3铜绿假单胞菌PAO1菌株草坪，并通过对菌斑悬浮液和培养上清液的电子显微镜分析观察到噬菌体颗粒（J.L.Fothergill和C.Winstanley，未解释）

表3。

噬菌体基因序列在LES分离物中的分布

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一还通过筛选具有相同菌株的循环噬菌体基因组来测试PCR产物，结果显示阳性。

LES全球信息系统

许多地理信息已在铜绿假单胞菌以前研究中的菌株，包括PAGI-1(Liang等人，2001年)、PAGI-2和PAGI-3(Larbig等人，2002年)，第4页(Klockgether等人，2004年)PAPI-1和PAPI-2(He等人，2004年)和pKLC102(Klockgether等人，2004年). 其他几个未发表的GI序列已存入GenBank，扩展了PAGI-5的PAGI命名法(EF611301型)至PAGI-11(EF611307型). 观察到的LESB58大型GI总结如下表2并在补充表3中进行了详细说明。先前使用消减杂交的研究确定了这些岛屿的代表性序列，并报告了它们在LES和非LES CF分离株中的流行情况(Smart等人，2006b). 基本上，这些GI普遍存在于所有LES菌株中（LESGI-5是LES菌株唯一的岛屿，其最低频率为86%）。在LES菌株中鉴定的五种GI中，只有两种与之前鉴定的任何GI相似铜绿假单胞菌该岛，110-kb LESGI-3岛的最后67 kb与PAGI-2、PAGI-3、PAGI-5和PAPI-1相似(图3)而LESGI-4与PAGI-1在整个长度上有46%的一致性。这与先前的证据一致，即GIs是基因组新基因的主要来源(Xiao等人，2005年;Tettelin等人，2005年). 如前所述，在LES菌株中未发现pKLC102和相关PAPI-1(Wurdemann和Tummler，2007年). 此外，PAGI-4和PAGI-6到PAGI-11在LESB58基因组中没有明显的同源性。

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LESB58中发现的基因组岛与体内筛选后的STM突变体具有显著相似性和定位。

LESGI-1插入tRNA位点，包含噬菌体和转座相关CDS，并包含LESF9 PCR诊断标记(Smart等人，2006b;Fothergill等人2008). 然而，它也包含一些CDS，与非假单胞菌（如嗜热厌氧菌）预测的蛋白质相似热梭菌和海洋细菌海杆菌尽管该岛主要匹配没有已知功能的假设蛋白质，但包括调节蛋白、限制修饰蛋白、ATP酶和传感器激酶的同源物。该岛包括含有LES-F9标记的PALES23591，尽管它并非LES分离物所独有(Smart等人，2006b).

LESGI-2含有溶菌素生物合成基因簇(pltMRLABCDEFGZHIJKNO公司)与一个来自假单胞菌属特殊M18(AY394844年)但其中含有移码突变pltB中。幽门螺旋菌素具有抗真菌活性(Bender等人，1999年)并且可能在植物相关假单胞菌的能力中发挥重要作用，例如P.荧光，抑制多种植物病害(Nowak-Thompson等人，1999年). 有趣的是，在LESB58中，正如之前在假单胞菌属该岛毗邻一个类似PA2593的CDS。

LESGI-3与克隆C的PAGI-2 GI相关(Larbig等人，2002年;Klockgether等人，2004年)含有多个假定转运蛋白的替代货运区域。它包括PCR诊断标记PS21(Parsons等人，2002年)该基因与一个假定的汞还原酶基因（PLES26321）具有同源性，尽管在一些非LES菌株中已鉴定出该岛(Lewis等人，2005年). LESGI-4与GI PAGI-1相关(Liang等人，2001年).

LES GI-5是一个新的岛，包含与其他生物的基因基本匹配的基因铜绿假单胞菌并且包括推定的噬菌体整合酶和质粒复制基因（补充表S1）。除了那些与流动元素相关的蛋白质外，大多数预测的蛋白质BLASTP匹配的相同性小于50%。例外是两种假设的蛋白质，一种来自芳香双氯单胞菌与水生和沉积物栖息地有关丁香树光伏。番茄。

LESB58的特征标记突变

特征标记突变（STM）是一种定义明确的方法，可通过突变体在感染动物模型中存活的相对能力，以相对公正的方式确定特定基因在体内生长中的重要性。由于LES在CF中是一种非常强健的流行病隔离物，并且它以前证明了与其他分离物相比的竞争优势铜绿假单胞菌相关感染动物模型中的菌株(Kukavica-Ibrulj等人，2008年)，我们在这里调查了STM成功的基础。基于PCR的STM铜绿假单胞菌如补充图S2和S3所示，菌株LESB58既涉及体外特征标记突变体库的构建，也涉及体内选择步骤。体外构建含有特定DNA标签的突变株平板文库，用于PCR筛选。铜绿假单胞菌LESB58突变体产生96个深well微滴定板，每个微滴定板包含96个STM突变体（共9216个STM突变）。通过Southern印迹对50个随机选择的LESB58 STM外偶联菌株的分析显示出独特的插入；插入物附近连接DNA的测序泰特该基因证实了散布在LESB58染色体周围的基因中的随机、独特插入。随后，进行体内筛选以确定铜绿假单胞菌LESB58菌株基因与肺部感染有关，使用每只动物48个突变株和慢性肺部感染的大鼠琼脂珠模型，该模型被认为是CF肺部感染的最相关模型。感染后第7天通过PCR分析输出池中每个突变的保留或丢失情况。为了确认每个STM突变体的身份，进行了24个特征标记PCR扩增，以获得特定长度为820 bp和980 bp的Tn DNA产物5Tc和Tn5Tc-GFP，在琼脂糖凝胶中可见。每个被选为体内生长缺陷的STM突变体都通过PCR再次确认。保留体外可见阳性PCR产物且体内传代后无PCR产物的LESB58 STM突变体以供进一步分析（例如。，表4).

表4。

47的生物信息学分析铜绿假单胞菌通过PCR-9216 STM突变株在大鼠慢性肺琼脂珠感染模型传代后的PCR-筛选，确定肺部感染必需的LESB58基因

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一先前通过STM筛选鉴定的基因铜绿假单胞菌菌株PAO1（或与先前确定的基因位于同一操纵子中）以粗体显示。

b条该位置被初步确定为位于LES前噬菌体5共享的重复区域内。

c（c）由于基因PLES25621很可能不会在溶原中表达，因此基因PLES25621的插入可能对下游基因产生极性影响，影响PLES25631、PLES2641和PLES25651的表达，这些基因是已知的LES原噬菌体5的一部分。

d日由于亲本菌株LES5B的游泳运动能力相对不足，这取决于鞭毛功能（补充表S1），我们假设在特征STM突变体中观察到的这种突变反映了剩余运动功能的重要性，FlhB的替代功能（例如，在III型分泌事件或粘附中），或对一个下游基因的极性效应。

在肺部感染中减弱的>60个LESB58 STM突变体中，47个提供了明确的序列位置(表4)通过映射转座子的插入点。在之前使用PAO1菌株进行的STM筛查中也发现了其中六个基因(表4). DNA测序显示在大多数已知的功能基因类别中插入。这些包括插入编码以前与疾病发病机制有关的产品或过程的基因铜绿假单胞菌例如III型分泌蛋白PscH、血红素铁摄取受体PhuR、TolA、伞诱导因子CupA3、褐藻酸生物合成蛋白MucD以及两个转录调节因子PA2583和PA2020。III型吡咯烷生物合成相关基因的插入(聚乙烯吡咯烷酮)和脓螯素（PA4226），强调了这两种铁载体的重要性。

在原噬菌体基因簇中插入STM突变体的体内分析

为了帮助理解LES在CF患者中成功定植的基础，对插入LES原噬菌体2、3和5中的三个STM突变体以及唯一的LES GI、LESGI-5中的一个STM突变进行了体内衰减水平测定(表2). 在与野生型（体外竞争指数[CI]）的混合培养物中评估每个STM突变体的体外生长，以确认这些突变体不影响体外生长，并且在体外未被野生型LESB58菌株竞争，在BHI肉汤中培养18小时后，体外CI为～1.0。这与体内竞争评估的结果形成对比，其中突变体与野生型菌株LESB58混合，并在大鼠肺部感染模型中生长7天图4，在原噬菌体2和5中都插入的突变体导致体内生长和维持的严重缺陷，这使大鼠肺组织中的CFU显著减少了16至58倍，CI值分别为0.061和0.017。前噬菌体3和LESGI-5中的突变可以部分保留在肺组织中，体内生长减少约7倍。

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体内竞争指数（CI）铜绿假单胞菌STM PALES_45041（在LESGI-5内）、PALES_25621（在LES原噬菌体5内），PALES_13261（在LES-原噬菌物3内）和PALES_08021（在LES/原噬菌体2内）在大鼠肺中生长7天，与野生型LESB58菌株竞争。每个圆圈代表每组中单个动物的CI。CI小于1表示毒力减弱。所有大鼠CI的几何平均值显示为实线，具有统计学意义P（P）-值用星号表示(*P（P）<0.001，使用Mann-Whitney和检验）。

CF患者LES的殖民性基础。

基因组铜绿假单胞菌菌株PAO1(Stover等人，2000年)和PA14(He等人，2004年)和另外两个CF分离株(Mathee等人，2008年)已完成并注释。除了这里介绍的LES，还有其他几个铜绿假单胞菌目前正在对菌株进行测序（pacs416[早期分离]、pacs416[晚期分离]、pacs5296、PA7、PACS2和PK6）(http://www.genomesonline.org). 基因组铜绿假单胞菌展示了马赛克结构(Ernst等人，2003年)它由一个“核心基因组”（～90%）和一个“附属基因组”（约10%）组成。后者包括参与确定O血清型的基因簇(Raymond等人，2002年)，鞭毛蛋白型(Arora等人，2001年)，IV型菌毛(Kus等人，2004年)，铁载体生产(Spencer等人，2003年)以及基因组/致病性岛(Liang等人2001;Larbig等人，2002年;He等人，2004年;Klockgether等人，2004年;Gal-Mor和Finlay 2006年)和原噬菌体。虽然许多已知的毒力基因都携带在铜绿假单胞菌(Wolfgang等人，2003年)，副基因组中的基因可能与致病性有关。与之前测序的基因组一样，LESB58的基因组携带核心基因组，包括大多数已知的铜绿假单胞菌基因组变异主要存在于5个原噬菌体、1个缺陷原噬菌器和5个大GI中，其中一些与其他菌株中发现的相关铜绿假单胞菌。

据报道，广泛的基因组可塑性铜绿假单胞菌噬菌体序列对水平基因转移有重要贡献的临床分离株，导致序列多样性(Shen等人2006). 事实上，有人认为整合酶驱动的不稳定性在细菌基因组进化中起着重要作用(曼森和吉尔摩2006). 此外，已经证明噬菌体可以推动铜绿假单胞菌(Brockhurst等人，2005年). 已经从中分离出60多种温和噬菌体铜绿假单胞菌(Akhverdian等人，1984年;Wang等人，2004年)，其中许多已经进行了基因组测序。

众所周知铜绿假单胞菌发病机制涉及多种众所周知的核心基因组功能（如II型和III型分泌、铁转运等），以及决定O血清型、鞭毛蛋白型、IV型菌毛、，和铁载体的产生（尽管这些只是因为序列差异而被命名为辅助基因，而且这些确实是核心功能，这是有争议的）。这里我们展示了少数几个特征鲜明的“流行”毒株之一铜绿假单胞菌这种生物体的成功，使其能够保留在与CF相关的感染模型中，需要编码在三个原噬菌体和一个GI上的遗传信息。然后，这就揭示了遗传信息通过辅助基因组流动的关键性质，如生物体在具有多种阻碍细菌生存机制的宿主中成功生长的能力。

在许多方面，LES作为一种病原体的成功可能归功于它能够定植CF患者的肺部。最初在处理宿主时采取过于激进的立场对生物体毫无益处，因为这将不可避免地导致排斥病原体或杀死宿主，基本上是咬住喂食它的手。因此，LES菌株失去了鞭毛，鞭毛蛋白是主要的Toll受体（TLR）激动剂假单胞菌属用于诱导上皮细胞的炎症反应(Blohmke等人，2008年); 这也解释了LES保持局限于此处使用的大鼠肺部慢性感染模型中使用的琼脂珠的趋势，不同于倾向于传播的菌株PAO1和PA14。这种不具攻击性的行为可能反过来解释了这种菌株如何避免过度刺激反应性炎症反应，以及LES菌株因此而战胜PAO1和PA14菌株的能力(Kukavica-Ibrulj等人，2008年). 其他似乎有利于肺部定植的特征包括LES形成生物膜的倾向，以及MucB在大鼠肺模型中成功定植的作用(表4)也会支持这个结论。在没有明显诱导炎症的情况下成功定植将提供一个平台，从中可以启动其他对抗措施，包括诱导突变状态，以允许更快速地适应抗生素耐药性，也可能是其他有利的适应。它在肺部定植方面的初步成功以及在较低细胞密度下诱导群体调节的能力使其能够诱导一些酶，这些酶将重塑其局部环境，这是该菌株攻击性总体增强的原因。因此，这种有机体的战略方法可以被描述为“被动侵略”

已经证明铜绿假单胞菌毒力是组合的(Lee等人，2006年). 这里描述的研究表明，有能力在通常受保护的生态位肺部成功建立定殖，这表明这也涉及一个组合过程，涉及核心基因组和来自“附属”基因组的关键原噬菌体和胃肠道基因，以提高竞争力。

方法

细菌菌株、质粒、培养基和生长条件

铜绿假单胞菌LESB58代表上述LES流行株的最早存档分离物。pUTmini-Tn5Tc和pUTmini-Tn5TcGFP用于插入突变(de Lorenzo等人，1990年)和pTZ18R用于克隆染色体DNA（GE Healthcare）。除非另有说明，大肠杆菌和衍生物生长在色氨酸大豆肉汤（TSB）、脑心灌注（BHI）肉汤中铜绿假单胞菌LESB58菌株或Mueller Hinton琼脂（MHA）（Difco）。必要时，这些培养基补充1.5%的Bacto琼脂（Difco）、氨苄西林（Ap，100μg/mL大肠杆菌)，哌拉西林（Pip，100μg/mL铜绿假单胞菌LESB58）或四环素（Tc；20μg/mL大肠杆菌或25μg/mL铜绿假单胞菌小于58；Sigma-Aldrich）。限制性内切酶、T4-DNA连接酶、T4-DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶购自新英格兰生物实验室（米西索加），用于标准程序(Sambrook和Russell 2001). HotStart TAQ DNA聚合酶来自Qiagen。

基因组DNA的制备

使用简单的裂解程序从LESB58菌株中提取DNA，然后进行氯化铯-溴化锂梯度超速离心(温斯坦利和哈特2000). 使用注射器去除染色体DNA带后，使用异丙醇提取溴化乙锭，并用10 mM Tris-HCl（pH 8.0）透析DNA以去除氯化铯。

DNA测序

DNA通过超声波破碎，生成了几个文库。利用ABI3730毛细管测序仪上的染料终止化学，从pOTW12（插入大小2–3 kb）和pMAQSac（插入大小3–12 kb）小插入文库中对整个基因组进行9倍覆盖率的测序。使用较大插入质粒（pBACehr，5-18kb插入大小）文库的末端序列作为支架。序列按照前面所述进行组装和完成(Young等人，2006年). 这个铜绿假单胞菌LESB58基因组序列以登录号提交给EMBLFM209186型。

基因组注释

使用Glimmer3预测编码序列（CDS）(Delcher等人，2007年)和被分配的LES位点标识符由“PLES_”前缀和五个数字组成，五个数字以10的倍数递增，以允许额外的CDS或非编码RNA。使用互惠最佳BLAST方法，结合synteny和Ortholuge分析，为每个LES CDS或非编码RNA识别PA14和PAO1中的同源序列：特别是，每个LES CDMS用作FASTA搜索PA14或PAO1的查询输入，使用30%的身份截止值，覆盖至少80%的查询和点击。放宽30%的临界值用于捕获可能存在的实质性基因差异，并使用以下方法消除非同源同源物。如果使用与PA14或PAO1热门搜索相同的搜索方法将原始LES CDS确定为热门搜索，则热门搜索被视为可能的正交搜索。在通过Mauve程序获得的全基因组比对发现多个得分相同的热门结果的情况下，即基因同步(Darling等人，2004年)，用于识别最可能的正交。使用Ortholuge对Ortholog进行了额外表征(Fulton等人，2006年). 在PAO1或PA14中具有确定的同源序列的LES基因，以及来自网址：www.pseudomonas.com(Winsor等人，2005年)，已自动传输。如果LES基因在两者中都有同源基因，则选择来自PAO1的基因注释在PA14上进行转移，因为PAO1基因组的更新手动管理水平较高。根据NCBI nr数据库中的重要BLAST匹配，手动注释PA14或PAO1中没有确定正交的LES CDS。使用PSORTb 2.0预测每个LES CDS的蛋白质亚细胞定位和COG(Gardy等人，2005年)和RPS-BLAST(Marchler-Bauer等人，2002年)分别是。

GI标识

通过在LES菌株中搜索其他菌株中没有同源物的基因簇（超过8个CDS），确定了GIs和原噬菌体区域，或者对于那些之前注释过的区域，进一步细化铜绿假单胞菌使用IslandPick完成基因组测序(Langille等人，2008年). 使用alien_hunter/IVOM计算异常序列组成(Vernikos和Parkhill 2006)、IslandPath/DINUC和IslandPath/DIMOB(Xiao等人，2005年)为了提供支持性证据，因为alienhunter是召回率最高的孤岛预测因子，而其他方法具有更高的总体准确性(Langille等人，2008年). 此外，通过手动检查基因注释来确定与DNA动员相关的基因（转座酶、整合酶等）的存在。

噬菌体PCR检测

为了诱导溶原的噬菌体裂解活性，LES菌株在诺氟沙星的亚抑制浓度（根据最小抑制浓度测定）下生长。对培养上清液进行过滤（0.2μm）以去除细菌，并对DNase I进行处理以去除污染DNA。然后用PCR分析鉴定煮沸的细菌悬浮液（鉴定基因组内的原噬菌体）和煮沸的培养上清液（鉴定噬菌体颗粒中的DNA）中的每个原噬菌素基因。对于LES，设计了从末端区域读出的前噬菌体2和前噬菌器3引物，以便只有循环DNA才能产生扩增物。所使用的引物和PCR扩增条件可以根据要求从第一作者处获得。

LESB58菌株STM突变文库的构建

用于构建标记标签的24个寡核苷酸的核苷酸序列和基于PCR的STM通用引物的序列已在前面描述过(Sanschagrin等人，2008年). 构建的两组质粒转化为大肠杆菌S17-1（λ个人识别码)(Simon等人，1983年)通过电穿孔和在补充了Ap（100μg mL）和Tc（20μg/mL）的MHA上选择的转化子。通过PCR对单菌落进行纯化和筛选。将细菌细胞煮沸5分钟，并将裂解物转移到含有PCR缓冲液、200μM dNTP和每个带有2.5 U HotStart TAQ DNA聚合酶引物的10 pmol的试管中。在65°C至55°C的温度范围内，使用特定的21个单体与来自泰特基因。大肠杆菌S17-1λ个人识别码含有pUTmini-Tn5Tc标记的质粒被用作供体，用于偶联转移到受体中铜绿假单胞菌菌株LESB58。在BHI和Tc上选择了交换结合物。对Tc耐药的菌落（反映了mini-Tn的存在5在…的染色体上铜绿假单胞菌)用Pip在BHI琼脂平板上刷牙（以排除含有自杀供体质粒pGP704的协整细菌）。在96周的Tc微量滴定板中培养出外接子菌落；从每个库中挑选一个突变体，形成96个独特的标记突变体库（形成体外输入库）。

筛选铜绿假单胞菌大鼠肺中的STM突变体

先前描述的慢性大鼠肺部感染模型(Cash等人，1979年)用于制备珠子和筛选96个体内突变株。将野生型LESB58和每株STM突变菌株（Tc，45μg/mL）的细菌培养物在37°C的深96-well板中培养至2mL BHI中过夜，600 nm处的光密度为1，相当于2×109菌落形成单位（CFU）/mL，并合并。用相同体积的磷酸盐缓冲盐（PBS）（137 mM NaCl，3 mM KCl，10 mM Na）以7200 rpm离心2 min，将每个混合培养物的0.5 mL等分试样冲洗两次2高性能操作4，1.3 mM千赫2人事军官4pH值为7.4）。所有其他程序如前所述(Sanschagrin等人2008). 含有混合细菌的琼脂珠在4°C下保存，根据以往的经验，可使用最多1个月。

琼脂微球中CFU的测定及体内筛选

为了测定琼脂珠的细菌含量，将1 mL等分试样添加到9 mL PBS中，并用Polytron（Kinematica AG）以最大速度均质30秒。将100微升连续稀释至10微升−4并将其置于BHI琼脂上，然后在37°C下过夜培养48小时，以测定CFU。

根据拉瓦尔大学伦理委员会批准的动物治疗方案使用动物。利用一组雄性Sprague-Dawley大鼠（500 g；加拿大查尔斯河）进行筛选，每只大鼠注射48个来自铜绿假单胞菌LESB58 STM库。使用异氟醚对动物进行麻醉，并通过插管接种，总剂量为7.2×105用含有120μL珠浆的1mL结核菌素注射器将琼脂珠中的混合突变体CFU注入大鼠肺部。感染后7天，处死动物，收集肺部，用Polytron进行均质，并通过在BHI琼脂和选择性培养基（BHI，Tc 25μg/mL）上进行连续稀释，测定CFU总量，如上所述。总共在192只动物中筛选出9216个LESB58 STM突变体。

比较PCR筛选STM突变体

将每个输入池的等分样品煮沸10分钟，旋转，并回收10μL上清液用于PCR分析。体内传代后，通过解剖回收肺组织，并用Polytron匀浆器在50mL Falcon管中的10mL无菌1×PBS中匀浆。将100微升均质组织置于含有25μg/mL Tc的BHI琼脂平板上；生长后，104从一个平板上回收的菌落集中在5 mL PBS中；将其中1mL离心并重新悬浮在1mL PCR缓冲液（体内输出池）中。随后将体内输出池煮沸10分钟，通过离心去除剩余细胞，并将10μL上清液用于PCR分析，如前所述。保留存在于体外输入池中而不存在于体内输出池中的LESB58 STM突变体，以通过带有特定引物的独立PCR进行进一步分析。

LESB58 STM突变体中断基因的克隆与分析

mini-Tn的插入点5通过克隆转座子抗性标记Tc和对侧面LESB58染色体DNA进行测序，鉴定出感兴趣的突变体。每个样本的染色体DNA（5μg）铜绿假单胞菌使用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒分离LESB58减毒突变体，并按照前面所述进行测序(Sanschagrin等人，2008年). 使用Silicon Graphics Origin2000计算机，通过GCG Wisconsin软件包中的BLAST，以及GeneFinder和GeneMark，组装获得的DNA序列并进行数据库搜索铜绿假单胞菌基因组是使用铜绿假单胞菌PAO1、PA14和LESB58数据库(http://www.pseudomonas.com网站). 使用BLASTN和E类-值截止值为0.001。短的虚假匹配被手动删除，而重要的匹配被映射到重叠的基因。

竞争指数分析

对于体内CI分析，将细菌浸入琼脂珠中，并如上所述使用慢性肺部感染大鼠模型(Cash等人，1979年;Sanschagrin等人，2008年). 突变株和野生型LESB58菌株CFU的总CFU在37°C下48小时后在BHI平板上测定，而LESB58 STM突变株CFU在BHI上用Tc进行区分，这些值用于计算LESB58突变株与野生型LESB58菌株的输入比。在同一大鼠肺内通过野生型与每个STM突变体的混合物体内传代后，通过BHI琼脂和选择性培养基（BHI，Tc 25μg/mL）上的差异计数计算输出比率。CI定义为突变株与野生型菌株相比的CFU输出比率除以突变株与野型菌株的CFU输入比率。计算同一组动物的几何平均CI，并在至少三只动物中进行实验。每个体内竞争实验都由学生的双尾t吨-测试。

致谢

本研究由Wellcome信托基金会支持，用于桑格研究所的基因组测序，由加拿大囊性纤维化基金会分别向R.C.L.和R.E.W.H.提供CIHR资助，并由美国囊性纤维化协会（F.S.L.B，R.E.W.H）资助假单胞菌基因组数据库。R.E.W.H.是加拿大研究主席的接受者。M.G.I.L.获得了MSFHR/CIHR生物信息学培训奖和MSFHR奖学金的支持。F.S.L.B.获得CIHR新研究员奖和MSFHR高级学者奖。C.W.和J.L.F.感谢大彩票基金和囊性纤维化信托基金的支持。我们感谢桑格研究所的病原体生产团队提供的霰弹枪和完成的测序。我们还感谢Tony Hart教授的宝贵贡献，他在发现LES和制定本项目中发挥了重要作用。不幸的是，哈特教授于2007年9月去世。我们把这篇文章献给他。

脚注

[补充材料可在线获取，网址为网址：www.genome.org. The铜绿假单胞菌本研究的LESB58序列数据已提交给EMBL(http://www.ebi.ac.uk/embl/)根据加入编号。FM209186型.]

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.086082.108。

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文章来自基因组研究由提供冷泉港实验室出版社