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细胞生物学杂志。2008年6月16日；181(6): 893–901.
数字对象标识：10.1083/jcb.200712028
预防性维修识别码：PMC2426934型
PMID：18541701
报告

Mps1激酶活性在有丝分裂未受干扰期间抑制后期，并将Mad2靶向动粒

安东尼·提格,奥利弗·斯塔普斯、和斯蒂芬-泰勒
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

Mps1是纺锤体组装检查点的上游组件，在人类细胞中，它是激活检查点以响应纺锤体损伤所必需的，但在有丝分裂未受干扰期间并不明显。Mps1还招募Mad1和Mad2加入kinetochores。然而，这些过程是否需要Mps1的酶活性尚不清楚。为了解决这个问题，我们建立了RNA干扰（RNAi）互补分析。Mps1的抑制会导致后期提前，通常伴有未对齐或定向错误的染色体。该表型由抗RNAi野生型Mps1转基因挽救，但不由催化失活突变挽救。一个类似物敏感等位基因，Mps1m602毫米，也可以挽救RNAi诱导的缺陷，但当被三磷酸腺苷类似物1-NM-PP1抑制时，则不能。因此，在有丝分裂未受干扰期间，Mps1活性确实会抑制后期。此外，虽然催化失活的Mps1可以恢复Mad1的动粒定位，但只有活性激酶恢复Mad2的定位。因此，在人类细胞中，Mps1催化活性是纺锤体检查点功能和Mad2招募所必需的。

介绍

动粒附着微管的搜索和捕获过程是随机的；因此，从核膜破裂（NEB）到最后一个动粒排列所花费的时间是高度可变的(Rieder等人，1994年). 然而，后期姊妹分离是一个全球性事件，在后期合成复合物（APC/C）启动安全蛋白和细胞周期蛋白B1的蛋白水解后不久触发(Clute and Pines，1999年;Hagting等人，2002年). 因此，保持精确的染色体分离需要抑制APC/C，直到最后一个动粒稳定地附着微管。这是通过称为主轴装配检查点（SAC；穆萨乔和萨尔蒙，2007年).

SAC由动心电传感器组成，包括Bub1、Mad1和Mps1；信号传感器，称为有丝分裂检查点复合体，包括BubR1、Bub3、Mad2和Cdc20；和一个效应器，即APC/C(穆萨乔和萨尔蒙，2007年). Bub1、BubR1和Mps1是蛋白激酶，尽管磷酸化似乎是SAC的组成部分(Nicklas等人，1995年)这些激酶的具体作用尚不清楚。事实上，激酶活性可能不是检查点功能本身所必需的；含有Bub1等位基因的酵母菌株完全缺乏激酶结构域，具有检查点功能(Warren等人，2002年).

Mps1最初被确定为酿酒酵母(Lauze等人，1995年)也是SAC功能所必需的(Weiss和Winey，1996年). 一些研究探讨了SAC信号中Mps1激酶活性的需求，但出现的情况很复杂。一项使用激酶头和类似物敏感型Mps1等位基因的研究表明，当动粒不能附着微管时，萌发酵母的Mps1活性是SAC功能所必需的(Jones等人，2005年). 然而，第二项使用小分子抑制剂辛crease的研究表明，当附着的动粒细胞没有受到张力时，需要Mps1活性来激活检查点(Dorer等人，2005年).

脊椎动物的情况同样复杂。与监测未附着动粒、重建动粒的作用一致非洲爪蟾带有激酶脱脂蛋白Mps1的鸡蛋提取物无法恢复检查点(Abrieu等人，2001年). 在这个系统中，Mps1是Bub1、Bub3、BubR1、Mad1、Mad2和着丝粒蛋白E（Cenp-E）的动粒募集所必需的，从而为Mps1的功能提供了可能的机制(Abrieu等人，2001年;Wong和Fang，2006年;赵、陈，2006). 然而，这与人类组织培养细胞的实验结果不一致：尽管RNAi介导的Mps1抑制导致无法招募Mad1和Mad2，但其他检查点成分如Bub1、BubR1和Cenp-E似乎未受影响(刘等人，2003).

RNAi研究的另一个令人惊讶的观察结果是，Mps1似乎只在纺锤体损伤后用于SAC功能，而在有丝分裂未受干扰时不需要(Stucke等人，2004年;Schmidt等人，2005年). 类似地，使用非特异性JNK抑制剂SP600125抑制Mps1会导致SAC被覆盖，但仅在存在纺锤体毒物的情况下(Schmidt等人，2005年). 相反，其他脊椎动物SAC成分在没有纺锤体损伤的情况下抑制有丝分裂(Musaccchio和Salmon，2007年). 同样，与RNAi研究相反，SP600125错误定位了BubR1；它对Mad2的影响尚不清楚(Schmidt等人，2005年).

由于Mps1起着多重作用，这些观察结果也变得复杂。除了主轴极体复制之外(Fisk等人，2004年)，动粒-微管相互作用需要Mps1(Dorer等人，2005年;Jones等人，2005年)可能是通过Dam1的磷酸化(Shimogawa等人，2006年). 在酵母中，Mps1通过消除错误定向促进动粒生物定向(Maure等人，2007年). 人类Mps1可能通过染色体乘客Borealin的磷酸化调节极光B激酶发挥类似的功能(Jelluma等人，2008年).

为了调和这些观察结果并剖析Mps1激酶活性在人类细胞中的作用，我们建立了一种互补分析，通过RNAi抑制内源性Mps1，然后诱导抗RNAi的Mps1转基因。通过GFP标记染色体的延时成像，我们发现在有丝分裂未受干扰的情况下，SAC功能需要Mps1激酶活性。此外，我们发现Mad2而非Mad1的动粒定位对Mps1激酶活性的抑制非常敏感。

结果和讨论

shRNA介导的Mps1抑制

为了确定Mps1激酶活性在SAC功能中的作用，我们建立了一种互补分析，通过RNAi抑制内源性Mps1，同时表达抗RNAi转基因。为此，我们产生了一种抗Mps1抗体来监测RNAi效率。该抗体检测到一个约95 kD的单一蛋白，并修饰前中期动粒，这与Mps1的已知特性一致（图S1、a和B；可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712028/DC1). 为了抑制Mps1，我们在瞬时转染HeLa细胞后筛选了一组短发夹RNA（shRNA）载体。免疫印迹和免疫荧光鉴定出一种有效抑制Mps1的载体（图S1、C和D）。

定量免疫印迹显示，Mps1被抑制至其正常水平的20%以下（未公布的数据）。因为转染的效率通常为~75%，所以这种残留的蛋白质主要是由未转染的细胞引起的。事实上，转染细胞中像素强度的定量显示，动粒结合的Mps1降低到<3%（图S1 E）。为了确定这是否足以损害Mps1功能，用微管毒素攻击受抑制的HeLa细胞18小时。当对照细胞在有丝分裂中停滞时，Mps1-RNAi群体中的细胞处于间期，表明SAC被覆盖（图S1 F）。事实上，Mps1的阻遏使有丝分裂指数降低了两倍（图S1 G），这与先前的研究一致，这些研究表明Mps1是SAC功能对纺锤体毒素的反应所必需的(Stucke等人，2002年;刘等人，2003;Schmidt等人，2005年). 时间推移显微镜证实，当Eg5驱动蛋白抑制剂monastrol激发时，缺乏Mps1的细胞未能停止生长（图S1 H）。尽管受到了广泛的抑制，但我们并没有观察到中心体缺陷，这使得我们能够专注于Mps1的检查点功能。

Mps1在有丝分裂未受干扰期间抑制后期

为了研究Mps1在无扰动有丝分裂过程中的作用，将HeLa细胞与shRNA载体和编码GFP组蛋白H2B的构建物共转染。通过延时显微镜分析转染的细胞，以确定（1）从NEB到最后一条染色体排列的时间（即，NEB到中期），（2）从最后一条染色体排列到姐妹分离的时间（即，中期到后期），以及（3）分离过程的质量（即对异常有丝分裂的迹象进行评分，例如染色体未对齐的后期或后期桥）。在对照组中，中期染色体比对耗时约22分钟，延迟约18分钟后，后期开始(图1、A和B). 92%的对照组正常完成有丝分裂，染色体比对后出现明显延迟（>10分钟）(图1C). 相反，Mps1阻遏影响染色体分离的时间和质量。现在，后期开始得更快，平均发生在中期后约9分钟(图1、A和B). 事实上，约23%的Mps1缺陷细胞在中期10分钟内进入后期，而只有5%的对照组这样做(图1 C). 此外，虽然没有一个控制细胞在进入后期时带有未对齐的染色体，但约15%的Mps1缺陷细胞在进入晚期时带有一个或多个未对齐的染色。此外，～9%表现为后期桥，～8%表现为其他有丝分裂缺陷。事实上，只有～45%的细胞正常完成有丝分裂(图1 C). 因此，Mps1的阻遏加速了后期的开始，通常在所有染色体在中期对齐之前，这表明在有丝分裂未受干扰的情况下，需要Mps1才能发挥SAC的功能。Mps1 RNAi对有丝分裂时间的总体影响不大，将NEB到后期的平均时间从～41分钟减少到～36分钟。相比之下，抑制有丝分裂检查点复合物组分显著加速了有丝分裂，NEB后期需要<15分钟(Meraldi等人，2004年). 这表明Mps1不是APC抑制剂的成分，而是一种基于动粒细胞的传感器，负责生成后期抑制剂。

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在有丝分裂未受干扰期间，纺锤体检查点功能需要Mps1。通过延时显微镜分析与对照或Mps1 shRNA和GFP组蛋白H2B构建物共同转染的HeLa细胞。（A） 显示从最后一条染色体对齐（箭头）到后期开始的时间（以分钟为单位）的图像序列。（B） 条形图量化了对照细胞和Mps1缺陷细胞从NEB到中期以及从中期到后期所用的时间。值表示从至少62个单元格得出的平均值和SEM（误差条）。（C） 条形图量化了在对照细胞或Mps1缺陷细胞中观察到的有丝分裂异常。棒材，5μm。

Mps1靶向运动粒的Mad1/Mad2

人类细胞实验表明，Mps1将Mad1/Mad2靶向动粒(Martin-Lluesma等人，2002年;刘等人，2003)，而爪蟾鸡蛋提取物数据表明，Mps1还招募了Bub1、BubR1和Cenp-E(Abrieu等人，2001年;Wong和Fang，2006年;赵、陈，2006). 在我们手中，在动粒中几乎检测不到Mps1水平的细胞中，极光B、Bub1、BubR1、Cenp-E和Cenp-F的定位基本上未受影响（图S2 A，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712028/DC1; 且未描述）。相反，动粒结合的Mad1显著减少，而Mad2基本上不存在（图S2 A）。为了量化这些影响，将像素强度归一化为抗着丝粒抗体（ACA）信号，并绘制为未表达细胞值的百分比（图S2 B）。与我们的定性评估一致，Mps1 RNAi对极光B、Bub1、BubR1、Cenp-E和Cenp-F具有边际影响（图S2 B）。相反，Mps1缺陷的动粒细胞中Mad1和Mad2的数量分别减少了～74%和～95%（图S2 B）。因此，我们基于shRNA的观察结果与之前的siRNA观察结果完全一致，并共同表明，Mps1将Mad1和Mad2靶向动粒(Martin Lluesma等人，2002年;刘等人，2003).

shRNA介导的抑制后Mps1功能的重建

接下来，我们询问抗RNAi的Mps1转基因是否可以修复shRNA载体转染后观察到的检查点缺陷。这不仅可以证实SAC缺陷是由Mps1阻遏引起的，而不是离靶效应，而且还可以促进结构-功能分析。Mps1 cDNA对shRNA序列产生抗性，并克隆到N末端GFP标记的表达结构中。转染HeLa细胞在细胞质和动粒中显示GFP信号(图2 A)这与Mps1已知的本地化一致。在四环素对照下产生稳定转染的HeLa系，表达转基因(图2 B). shRNA载体的转染显著降低了内源性Mps1水平，但外源性GFP标记蛋白仍然丰富(图2 B). 然后，我们使用延时显微镜来确定用野生型转基因重建的Mps1-RAi细胞中的SAC状态。如上所述(图1)，我们将其作为中期延迟至少10分钟，然后成功完成染色体分离的正常细胞进行评分。后期启动速度较快或染色体未对齐、后期染色体滞后或其他有丝分裂缺陷的细胞被视为异常细胞。尽管～90%的对照组正常完成有丝分裂，但只有37%的Mps1缺陷细胞完成了有丝分裂(图2 C，左）。值得注意的是，GFP-Mps1转基因的诱导挽救了检查点缺陷，74%的细胞现在完成了正常的有丝分裂。事实上，27%的Mps1缺陷细胞进入后期时带有一条或多条未对齐的染色体(图2 C，红盒），没有一个重组细胞以未对齐的染色体进入后期。这表明SAC缺陷确实是由Mps1的抑制而非离靶效应引起的。

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主轴检查点功能需要Mps1激酶活性。用shRNA载体转染表达tet-inducible RNAi-resistance GFP-tagged Mps1融合物的HeLa细胞，并通过免疫荧光显微镜、免疫印迹和延时显微镜进行分析。（A） 免疫荧光图像显示野生型Mps1（WT）的动粒定位R（右）)和催化失活的D664A突变体（KDR（右）). （B） 免疫印迹显示内源性Mps1的抑制和RNAi抗性GFP标记蛋白的诱导。（C） 量化内源性Mps1抑制后观察到的有丝分裂表型的条形图；而Mps1 WTR（右）挽救RNAi缺陷，Mps1 KDR（右）使表型恶化。每个类别中至少有132个细胞被评分。棒材，5μm。

检查点功能需要Mps1激酶活性

为了确定人类细胞中SAC功能是否需要Mps1活性，我们询问一个催化失活的突变是否可以挽救RNAi缺陷。我们将催化结构域的亚结构域VII中的天冬氨酸突变为精氨酸（Mps1 D664A；汉克斯和亨特，1995年)，一种已知可使Mps1失活的突变(Lauze等人，1995年;Abrieu等人，2001年). 当表达为GFP标记的融合时，该突变定位于细胞质和动粒(图2 A). 如前一节所述，我们生成了稳定的HeLa细胞，其中激酶突变由四环素诱导(图2 B). 如前所述，将这些细胞转染shRNA构建物，诱导转基因，并通过延时显微镜对细胞进行分析。重要的是，诱导催化突变未能修复SAC缺陷(图2 C，右侧）。相反，催化突变加剧了缺陷，使异常有丝分裂的数量从63%增加到80%。因此，内源性Mps1被非催化活性突变体取代的细胞缺乏检查点，这表明人类细胞中的SAC信号需要Mps1激酶活性。

Mps1激酶活性是Mad2动粒定位所必需的

为了进一步探讨Mps1的作用，我们询问激酶突变是否可以恢复Mad1/Mad2定位。如上所述（见Mps1靶向Mad1/Mad2到动粒），Mps1的抑制将动粒结合的Mad1降低到～30%（未公布的数据）。野生型Mps1和催化突变的诱导使Mad1定位分别恢复到～90%和～65%(图3，A和B). 因此，具有催化活性不活跃的Mps1突变的细胞的重建导致Mad1大量募集到动粒，这表明Mps1在Mad1定位中的作用仅部分依赖于激酶活性。相反，Mad2的动粒靶向在很大程度上依赖于Mps1的催化活性；虽然野生型转基因将与动粒结合的Mad2恢复到～80%，但表达催化突变的细胞中与动粒连接的Mad1的数量仅为～19%(图3，A和B). 为了强调这种差异效应，我们绘制了催化突变体恢复的动粒结合蛋白的数量与野生型Mps1恢复的数量的百分比(图3 C). 尽管激酶突变体将Mad1水平恢复至～75%，但Mad2水平仅恢复至～25%。因此，Mps1激酶活性似乎在将Mad2靶向动粒方面起着关键作用。

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Mps1激酶活性是Mad2动粒定位所必需的。用shRNA载体转染表达tet-inducible RNAi-resistance GFP-tagged Mps1融合物的HeLa细胞，用诺卡唑处理2 h，并分析以检测着丝粒（ACA；红色）和Mad1或Mad2（绿色）。（A） 去卷积图像堆栈显示，尽管Mps1 WTR（右）恢复Mad2本地化，Mps1 KDR（右）没有。突出显示的（方框中的）动粒的放大显示Mad1或Mad2的存在或不存在。（B） 根据ACA信号标准化的动粒量化Mad1和Mad2像素强度的条形图。值表示源自至少九个细胞的至少106个动粒的平均值和SEM（误差条）。（C） 绘制用Mps1 KD重组细胞动粒中Mad1和Mad2数量的条形图R（右）用Mps1 WT重组的百分比表示R（右）巴，5μm。

化学遗传介导的对Mps1激酶活性的抑制

尽管上述数据与Mad2募集所需的Mps1激酶活性一致，但我们不能排除D664A突变诱导阻止Mad2募集的结构效应的可能性，而不依赖于对Mps1催化活性的任何影响。因此，我们转向化学遗传学，使用ATP竞争性抑制剂选择性地阻断Mps1活性。如前所述，芽殖酵母Mps1(Jones等人，2005年)，我们突变了门卫残基，用丙氨酸（Mps1）取代蛋氨酸602M602A型)从而使Mps1对ATP模拟物1-NM-PP1敏感。我们生成了一个稳定的表达GFP标记的Mps1的细胞系M602A型四环素对照；然后用编码Mps1 shRNA和GFP-组蛋白H2B的载体共同转染细胞，并通过延时显微镜分析以确定检查点状态。与上述数据一致，Mps1阻遏抑制SAC，只有～30%的细胞表现出正常的有丝分裂(图4 A). Mps1导入M602A型修复了这个缺陷，约70%的细胞正常完成有丝分裂，表明Mps1M602A型具有足够的催化活性以维持检查点。值得注意的是，1-NM-PP1完全逆转了Mps1的能力M602A型挽救检查站缺陷(图4 A). 此外，尽管Mps1M602A型恢复了Mad2的动粒定位，这被1-NM-PP1的添加所逆转(图4、B和C). 因此，因为Mps1M602A型恢复检查点功能和Mad2定位，M602A突变似乎不会诱发结构缺陷。然而，由于1-NM-PP1抑制用Mps1重建的细胞中的SAC功能和Mad2募集M602A型数据表明，Mps1的激酶活性确实对SAC信号和Mad2定位至关重要。注意，在用Mps1重组的细胞中，Mad1的动粒定位恢复m602毫米尽管暴露于1-NM-PP1（图S3、A和B；可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712028/DC1)再次证实了Mad1募集对Mps1激酶活性的依赖性较小。

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Mps1激酶活性的化学遗传抑制抑制检查点和Mad2定位。用shRNA载体转染表达tet-inducible RNAi-resistance GFP-tagged Mps1融合物的HeLa细胞，并通过延时显微镜和免疫荧光分析。（A） 量化内源性Mps1抑制后观察到的有丝分裂表型的条形图；Mps1的能力M602A型1-NM-PP1可逆转RNAi缺陷。（B） 染色细胞的去卷积图像堆栈的投影用于检测着丝粒（ACA；红色）和Mad2（绿色），表明Mps1的能力M602A型1-NM-PP1逆转了Mad2的动粒定位。（C） 根据ACA信号标准化的动粒量化Mad2像素强度的条形图。数值表示从至少四个细胞的至少64个动粒中得出的平均值和SEM（误差条）。棒材，5μm。

Mps1激酶活性的药理抑制

JNK抑制剂SP600125覆盖人类细胞中的SAC。SP600125在体外抑制Mps1，增加了检查点被Mps1抑制所诱导的可能性(Schmidt等人，2005年). 然而，SP600125抑制BubR1的动粒定位，这是一种Mps1 RNAi没有复制的现象（图S2；Martin-Lluesma等人，2002年;刘等人，2003). 如果SP600125确实抑制了细胞中的Mps1活性，我们前面的观察预测SP600125应该会使Mad2定位错误。然而，在SP600125覆盖SAC的浓度下（图S3 C），我们观察到对Mad2的动粒募集没有明显影响（图S3D）。澄清这种差异需要进一步分析，但我们的数据表明，SP600125诱导的SAC覆盖可能不是Mps1抑制的结果。

Mps1激酶活性的生理作用

利用RNAi互补和化学遗传学，我们表明，在未受干扰的有丝分裂过程中，Mps1激酶活性是SAC功能所必需的，它与Mad1和Mad2的动粒募集有差异。因为Mad1是Mad2的动粒受体(穆萨乔和萨尔蒙，2007年)，Mad1–Mad2交互可能需要Mps1活动。然而，这一概念与实验相矛盾，实验表明，Mad1–Mad2相互作用可以用重组蛋白（即，在完全没有Mps1活性的情况下）在体外重现Mad2的体内动力学(Vink等人，2006年).

虽然Mad1–Mad2结合在体外不需要Mps1，但可以想象，在细胞中，依赖Mps1的磷酸化事件可能会增强Mad2依赖Mad1的募集，可能会放大检查点信号。事实上，Mps1可以在体外磷酸化Mad1(Hardwick等人，1996年). Mad2已被证明被磷酸化(Wassmann等人，2003年)，增加了它是Mps1底物的可能性。我们不赞成这种可能性，因为磷酸化-Mad2不与Mad1相互作用，并且检查点功能不全，这表明Mad2磷酸化可能参与检查点失活(Wassmann等人，2003年)这与Mps1活动刺激SAC的概念不一致。Mps1活动的作用可能是间接的。最近发现的两个检查点成分，即Plk相互作用的检查点解旋酶和Tao1（一种蛋白激酶）的抑制，也会将Mad2从动粒中移除，尽管Mad1的招募效率很高(Baumann等人，2007年;Draviam等人，2007年). Tao1似乎位于Mps1下游，因为Mps1的动粒定位不需要Tao1(Draviam等人，2007年)因此，Mps1可能会通过Tao1影响Mad2的招募。

另一种解释可能来自这样一个事实，即我们的观察结果是使用抗Mad2抗体得出的。因此，可以想象，在Mps1缺陷细胞中观察到的效果并不是由于无法招募Mad2，而是由于无法检测到Mad2。事实上，Mad2要么采用开放构象，要么采用封闭构象，即O-Mad2和C-Mad2；这两种构象在结构上有很大不同(穆萨乔和萨尔蒙，2007年). 当与Mad1结合时，Mad2采用闭合构象并作为模板，招募O-Mad2首先形成二聚体。然后将O-Mad2移交给Cdc20并转换为闭合构象。因此，一个关键问题是任何给定的抗Mad2抗体能否识别这两种Mad2构象。有趣的是，在间期，Mad1和Mad2定位于核孔(Campbell等人，2001年)，Mps1也是如此(刘等人，2003)和Mad2抑制剂p31彗星（未发布的数据）。因为p31彗星绑定Mad1–C-Mad2核心复合体，从而阻止O-Mad2招募(Mapelli等人，2006年)，这表明存在于核孔中的物种是Mad1–C-Mad2/p31彗星复杂。重要的是，尽管我们可以检测到Mad1和p31彗星在核孔处，我们无法检测到Mad2（未发表的数据），这表明抗Mad2抗体不识别C-Mad2。因此，在缺乏Mps1激酶活性的细胞中，C-Mad2很可能与动粒结合，但无法被抗体检测到。或者，因为Mad2寡聚物在细菌中表达(Fang等人，1998年)，针对细菌表达的Mad2产生的抗体可能只识别Mad2二聚体。如果抗Mad2抗体只识别O-Mad2或Mad2二聚体，这反过来又提出了一种有趣的可能性：也许Mps1激酶活性将O-Mad2募集到Mad1–C-Mad2核心复合物中，可能是通过作用于p31彗星与Mad1和/或Mad2相反。虽然我们目前正在测试这一假设，但这一问题突出表明需要工具来区分基于细胞的分析中Mad2的各种异构体。

材料和方法

细胞系和药物

从表达的序列标签（图像编号0511705）中PCR扩增hMps1，将其克隆到经修饰以含有N-末端GFP标签的pcDNA5/FRT/TO载体（Invitrogen）中，并进行诱变（QuikChange；Stratagene）以产生D664A-、M602A-和RNAi抗性等位基因（表S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712028/DC1). 然后将载体与Flp重组酶编码质粒pOG44共同转染到TRex四环素反式激活因子HeLa细胞中(Tighe等人，2004年). 合并并扩大Hygromycin耐药菌落，用100 ng/ml四环素（Sigma-Aldrich）诱导转基因表达。诺卡唑和紫杉醇（均来自Sigma-Aldrich）的最终浓度分别为0.2μg/ml和10μM。1NM-PP1和SP600125（均购自EMD）在10μM下使用。在20μM下使用MG132（EMD）。

shRNA

转染前24小时，4×104将细胞接种到24孔板中。编码靶向Mps1的shRNA序列的载体（OriGene；表S2，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712028/DC1)和编码GFP–组蛋白H2B融合的质粒(Morrow等人，2005年)按照制造商的说明，以9:1的比例与Lipofectamine Plus（Invitrogen）混合。然后将DNA/脂质复合物添加到细胞中7小时24小时后，将细胞重新放置在盖玻片、六孔板或室玻片上，24小时后进行分析。

分子细胞生物学

使用前面描述的方法，提高羊多克隆抗体SMP1.1，并针对编码Mps1氨基酸18–260的GST融合蛋白进行亲和力纯化(Taylor等人，2001年). 如前所述进行免疫印迹(Taylor等人，2001年;Tighe等人，2004年)使用表S3中所示的抗体（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712028/DC1). 对于免疫荧光，在盖玻片上生长的细胞在PBS中清洗，在1%甲醛中固定5分钟，在pH 8.5的甘氨酸中淬火，然后用PBS加0.1%Triton X-100（PBST）渗透。在室温下用一级抗体（表S3）培养30分钟，然后用PBST洗涤。在室温下，用二级抗体培养30分钟后，再进一步洗涤，用Hoechst 33358（PBST中1μg/ml）进行复染，并装入90%甘油和20 mM Tris-HCl中，pH 8.0。使用InStat 3.0版（GraphPad Software，Inc.）进行统计分析。对于延时成像，将细胞培养在多孔室载玻片中（Laboratory Tek；Thermo Fisher Scientific），并按照前面所述进行分析(Morrow等人，2005年).

细胞周期分析

如前所述测定有丝分裂指数(Tighe等人，2004年). 简而言之，收集松散附着的细胞并离心到显微镜载玻片上，用PBS中3%的甲醛固定，用Hoechst染色，然后按照前一节所述进行安装。用染色体凝聚状态对细胞进行有丝分裂或间期评分。

图像采集和操作

使用100×NA 1.40 Plan Apo物镜和Sedat Quad滤波器组（Chroma Technology Corp.），在室温下在修复显微镜（DeltaVision RT；Applied Precision）上采集免疫荧光图像。使用Z光间距为0.2μm的CCD相机（CoolSNAP HQ；光度计）收集图像。然后使用Softworx软件（Applied Precision）对原始图像进行去卷积，结果中显示了这些去卷积图像的最大强度投影。在手动显微镜（Axiover 200；Carl Zeiss，Inc.）上进行时间推移显微镜检查，该显微镜配备有自动工作台（PZ-2000；Applied Scientific Instrumentation）和环境控制室（Solent Scientistic），可在5%CO的湿化流中将细胞保持在37°C2使用32×NA 0.40 LD a-Plan物镜进行成像。百叶窗、过滤轮和点访问由MetaMorph软件（MDS Analytical Technologies）驱动。图像是使用CoolSNAP HQ相机拍摄的，而单个TIFF文件则导入Photoshop（Adobe）进行打印，或导入QuickTime（Apple）进行视频。

在线补充材料

图S1记录了本研究中使用的Mps1试剂，包括抗体、GFP标记的cDNA和shRNA结构。图S2显示了Mps1阻遏对各种SAC成分定位的影响。图S3显示了1-NM-PP1对用Mps1重组的细胞中Mad1定位的影响M602A型等位基因。表S1、S2和S3分别列出了本研究中使用的PCR引物、shRNA序列和抗体。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712028/DC1.

补充材料

【补充材料索引】

致谢

我们感谢Pat Eyers纠正了Mps1 ORF的5′端，感谢Bill Earnshaw纠正了ACA抗体，感谢Andrea Musacchio进行了有益的讨论。

A.Tighe由阿斯利康和Wellcome Trust Value in People奖资助，S.Taylor是英国癌症研究高级研究员。

笔记

O.Staples目前的地址是英国苏格兰邓迪DD1 9SY邓迪大学尼尼韦尔斯医院外科和分子肿瘤学系。

本文中使用的缩写：ACA，抗着丝粒抗体；APC/C，指代复合体；着丝粒蛋白；NEB，核膜破裂；SAC，主轴装配检查点；短发夹RNA。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社