跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
生物化学J。作者手稿；PMC 2010年2月10日提供。
以最终编辑形式发布为：
《生物化学杂志》2008年8月1日；413(3): 467–478.
数字对象标识：10.1042/BJ20071704
预防性维修识别码：项目经理2819661
EMSID:英国MS28634
PMID：18442358

内膜小室参与CD95/Fas介导的信号在II型细胞中的传播

保拉·马塔雷斯,*,1 瓦莱里亚·曼加内利,†,1 蒂娜·加罗法洛,† 安东内拉·蒂纳里,‡ 甘巴德卢克雷齐亚,* 肯尼思·恩德贝尔,§ 罗亚·科斯拉维·法尔,§ 莫里齐奥·索利斯,† 毛罗·德格利·埃斯波斯蒂,∥,2和沃尔特·马洛尼*,2,三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

CD95/Fas受体结扎后，不同细胞器参与细胞内信号传递，包括一系列亚细胞变化，这些变化对凋亡级联反应是强制性的，甚至是支持性的。在本研究中，我们分析了CD95/Fas参与II型细胞（CEM细胞）后，内吞在细胞死亡信号传播中的作用。我们表明，这种受体-配体相互作用独立于任何半胱天冬酶激活触发内吞。这种FasL（Fas配体）诱导的内吞也导致内吞小泡向线粒体室的早期定向“运动”。反过来，在内胚体和线粒体之间的这种相互作用之后，线粒体膜电位的丧失和细胞凋亡的执行。这种细胞重塑在受体诱导的依赖性细胞死亡中不存在，例如由促线粒体药物staurosporine诱导的细胞死亡，在因其多药耐药性而选择的CEM细胞系（CEM VBL100）中也不存在。在这些细胞中，FasL（Fas配体）诱导的内吞作用减少，细胞器串扰减少，与凋亡减少相对应。总之，这些发现表明内吞作用在CD95/Fas激活的信号传导的传播和扩增中起着关键作用，导致II型细胞死亡。

关键词：凋亡、CD95/Fas、内吞、线粒体膜电位（MMP）、多药耐药、II型细胞

简介

一般来说，在配体结合时，表面受体能够通过与细胞内信号分子相互作用来转导信号。对于许多受体来说，与配体的相互作用诱导受体聚集，随后通过内吞作用下调活化的表面受体。此外，受体内化可以将激活的受体靶向内吞室的早期内体，从而促进细胞内信号的传播和调节[1,2]. 受体结合也是一种重要的信号，能够触发复杂的程序，通过细胞凋亡导致细胞死亡。细胞凋亡的诱导主要通过两条途径进行：外源性途径和内源性途径，即线粒体途径。第一条通路在TNF（肿瘤坏死因子）家族成员结扎死亡受体后激活，包括TNF、CD95L[FasL（Fas配体）/Apo-1L]和TRAIL（TNF-相关凋亡诱导配体），并与caspase 8作为顶端caspase的激活有关。第二条途径在细胞应激、生长因子撤除或细胞毒性损伤引起线粒体扰动后激活。然而，这两条路径可以严格地交织在一起。事实上，CD95介导的细胞凋亡是通过两种常见模式转导的[三,4]：I型细胞表现出快速的受体内化并形成大量的DISC（死亡诱导信号复合物），而II型细胞更依赖线粒体扩增途径，并且在数量上表现出较少且较慢的DISC组装。合适的是，I型细胞在不涉及线粒体的情况下发生凋亡，而在II型细胞中，受体介导和线粒体介导的通路之间的相互作用导致了凋亡的执行。沿着这些路线，最近已经证明CD95/Fas诱导I型细胞凋亡需要受体内化[2,5]. 事实上，最近的证据表明，DISC组分向活化的CD95/Fas受体的募集部分发生在内化到内质体室之后[2]. 此外，阻断CD95/Fas内化损害细胞凋亡的观察结果表明，CD95受体内吞在传递死亡信号中起着关键作用，至少在I型细胞中是如此[2,5].

另一方面，在II型细胞中，例如在CD4中+T细胞、线粒体也可能整合死亡受体信号。已经证明截短形式的Bid分子可以连接这两条通路[6]. 然而，现在越来越多的人认识到，在不同形式的细胞死亡中，随着表面受体的激活，空泡变化往往会增强[1,2,7,8]. 在本研究中，分析了影响II型细胞Fas信号早期阶段细胞膜的传播事件及其动态相互作用。我们发现CD95连接除了触发caspase介导的CD95受体内化外[2]也触发了广泛内吞作用的激活，这是半胱天冬酶非依赖性的，是早期和晚期内体向线粒体室的定向“运动”。在II型细胞中，这也可能导致线粒体改变，从而导致细胞死亡。重要的是，我们还评估了以外源性耐药为特征的T细胞系（即多药耐药细胞系）中Fas触发的内吞作用。我们发现这些细胞内吞介导的传播信号有缺陷。因此，我们认为，至于其他细胞器[9-11]内吞途径的广泛“激活”可能在II型细胞的细胞器串扰和死亡信号传播中起关键作用。

实验

试剂

重组超FasLigand（FasL）购自Apotech（瑞士洛桑），而中和抗人Fas IgG1单克隆抗体（克隆ZB4）购自Upstate Biotechnology（美国纽约州普莱西德湖）。荧光探针和分析从Molecular probes/Invitrogen（美国俄勒冈州尤金市）购买。多克隆抗VDAC-1（电压依赖性阴离子通道-1）、抗LAMP-1（溶酶体相关膜蛋白-1）和抗CD95/Fas（C-20）抗体从Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）获得，而多克隆抗Rab-5抗EEA1（早期内体抗原1）从BD/Pharmingen（英国牛津）购买。Z-VAD-FMK[苄氧羰基-Val-Ala-数字图书馆-天冬氨酸氟甲基酮；也称为Z-Val-Ala-数字图书馆-天冬氨酸-CH2F（苄氧羰基-乙酰丙基-数字图书馆-天冬氨酰氟甲烷）]来自Alexis（美国加利福尼亚州圣地亚哥），莫能菌素来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。其他化学品来自Sigma。

细胞培养

在补充有10%（v/v）FCS（胎牛血清）、50单位/ml青霉素和50单位/ml青霉素的RPMI 1640培养基中培养人淋巴母细胞样T细胞系CEM及其耐多药对应物VBL100细胞μg/ml链霉素，在含5%（v/v）CO的湿润大气中237°C时。对于所有实验，5×105每毫升细胞接种并按规定处理（见下文）。

治疗

100 ng/ml重组FasL或2μM STS（staurosporine；Sigma）用于不同时间（分别为20分钟和30分钟以及1小时和3小时）。对于抑制剂实验，用Z-VAD-FMK（50μM） 或莫能菌素（10μM） ●●●●。单独使用每种药物（Z-VAD-FMK或莫能菌素）处理的细胞被视为对照。通过用250 ng/ml中和抗人Fas IgG1单克隆抗体（克隆ZB4）孵育细胞来进行内吞试验的阴性对照。

TEM（透射电子显微镜）研究

人淋巴母细胞T细胞在室温（25°C）下于2.5%己二醛缓冲液（0.2 M，pH 7.2）戊二醛中固定20分钟，然后在1%OsO中固定4在室温下，在碳酸缓冲液中放置1小时，并按照其他说明进行处理[12]. 在200米网格上收集系列超薄切片，然后用醋酸铀酰和柠檬酸铅进行复染。样品用飞利浦208电子显微镜在80 kV下观察。

形态分析

在相同放大倍数（×4000）下，通过TEM分析至少200个细胞进行定量评估。

细胞死亡分析

使用FITC-结合的膜联蛋白V/碘化丙啶凋亡检测试剂盒（意大利米兰埃彭多夫）进行双重染色后，通过流式细胞仪对凋亡进行定量评估，从而区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞。

活细胞中的线粒体膜电位

用JC-1（5,5′，6,6′-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑-碳菁碘化物；分子探针）探针研究对照组和处理组细胞的基质金属蛋白酶。按照这种方法，活细胞用10μM JC-1，如前所述[13]. TMRM（四甲基罗丹明酯；1μM；分子探针；红色荧光）也用于确认使用JC-1获得的数据。

内吞试验

用FasL处理30分钟后，将细胞清洗三次，再悬浮在RPMI 1640培养基（有或没有FCS）中，然后在37°C下用右旋糖酐-FITC（1 mg/ml，Sigma）再培养30分钟。三次洗涤后，细胞重新悬浮在PBS中，并立即使用细胞仪进行分析。为了区分摄入的右旋糖酐颗粒和附着在细胞表面的颗粒，我们使用了前面描述的台盼蓝荧光猝灭法[14]. 随着苯乙烯基荧光染料FM1-43的荧光增强，也测量了细胞内吞[8,15,16]. 在荧光分光光度计（PerkinElmer LC50）中记录荧光变化，激发波长为470 nm（5 nm带宽），发射波长为565–580 nm（10 nm带宽）5改良林格溶液中的细胞/ml[15]和2-4μM格式1-43。在平板读取器中进行补充测量，发射滤光片中心位于538 nm（Fluoroskan Ascent；Thermo，Basingstoke，U.K.）。或者，用FasL处理30分钟后，将细胞与BSA-FITC（Sigma）或BSA-金（40 nm，Fitzgerald Industries International，Concord，MA，U.S.A.）在37°C下再孵育30分钟。清洗后，分别制备细胞进行免疫荧光和透射电镜观察。

蔗糖颗粒分级

EEA1、Rab5、LAMP-1、VDAC-1和CD95/Fas的分布分析通过在连续密度梯度上的等密度离心进行，如前所述[17]. 简言之，约1.5×108未经处理或经FasL处理的CEM细胞或VBL100细胞（37°C下100 ng/ml，30分钟）在PBS中收集，并重新悬浮在0.3 ml缓冲液A[3 mM咪唑，pH 7,4，1 mM EDTA，50μM Z-VAD-FMK和含8.5%蔗糖的1:100（v/v）蛋白酶抑制剂鸡尾酒。或者，用50μM Z-VAD-FMK或莫能菌素，然后用上述FasL治疗。细胞悬浮液被Dounce均质化（20冲程）机械破坏。在1000℃下通过10分钟离心去除细胞核克将上清液装载在4 ml 10–40%连续蔗糖梯度的顶部，并在Beckman TL-70超速离心机（摆动桶转子，SW60 Ti）中以40 000转/分钟的速度旋转16小时。离心后，从试管底部收集20个组分。在用Bio-Rad分析评估蛋白质浓度后，对组分进行电泳。蛋白质通过Western blotting进行定位。

免疫荧光

与BSA-FITC孵育结束时，在室温下用3.7%（w/v）多聚甲醛在PBS中固定对照细胞和FasL处理细胞30分钟，在同一缓冲液中洗涤，并用0.5%Triton X-100（Sigma）在PBS内渗透5分钟。洗涤后，样品在4°C下与抗线粒体单克隆抗体（Chemicon International，Temecula，CA，U.S.A.）孵育1小时。然后，用Alexa Fluor®594-共轭抗鼠IgG（分子探针，荷兰莱顿）在37°C的黑暗中标记细胞30分钟。清洗后，用甘油/PBS（2:1）固定所有样品，并用尼康显微镜观察。图像由一台彩色冷却3CCD相机（滨松光电，日本滨松）拍摄，并由OPTILAB（Graftek）软件进行分析。

免疫印迹法

如前所述，用SDS/聚丙烯酰胺凝胶分离细胞裂解物和亚细胞样品并进行免疫印迹[18].

数据分析和统计

所有样本均使用配备488nm氩激光的FACScan细胞仪（BD Biosciences）进行分析。至少采集了20000个事件。数据由Macintosh电脑使用CellQuest软件进行记录和统计分析（Becton–Dickinson）。使用Student’st吨使用Macintosh的StatView程序测试或单向方差分析。所有报告的数据均在至少三个不同的实验中进行了验证，并且仅以平均值±S.D.的形式报告P（P）小于0.01的值被认为具有统计学意义。

结果

CD95/Fas结扎和内吞

与先前的研究假设的CD95/Fas内吞在I型细胞凋亡触发中的作用一致[2]，我们首先在我们的实验环境中，即在II型T细胞系CEM中评估了这一现象。生物化学分析首先通过监测FM1-43的荧光变化进行，FM1-43是一种在内吞作用增强后可逆分布到细胞膜的膜探针[15,16]. 用FasL处理后，FM1-43荧光迅速升高，表明细胞内摄取，在添加后1小时内随着FasL浓度的增加而增强，然后逐渐衰减(图1A). 这一时间进程分析表明，Fas触发导致内吞活性早期增加。相反，将CEM细胞与抗人Fas IgG1中和抗体（克隆ZB4）孵育，已知该抗体能结合CD95/Fas，但不激活CD95/Fass并触发细胞凋亡[2]未诱导任何内吞增加，FM1-43的摄取与未经处理的对照细胞没有显著差异(图1A). 事实上，FasL诱导的FM1-43荧光变化的方向与离子霉素相同，离子霉素是一种已建立的快速内吞诱导剂(图1B) [8,15]. 流式细胞术也进行了补充研究，以定量评估Fas-L在该T细胞系中诱导的内吞作用。FasL给药后分析了两个不同的点：（i）CD95/Fas表面表达和（ii）内吞作用。对活细胞进行的这些对照分析表明，FasL处理30分钟并没有导致CD95表面表达的任何显著降低(图1C，黑线），但相对于未经处理的细胞，CD95表面表达水平略有下降(图1C，浅灰色阴影区域）仅在FasL给药后1小时开始检测到(图1C，中灰线）。关于第二点，使用葡聚糖示踪剂摄取的定量评估来评估内吞活性[19]. 我们的结果总结如下图1（D），显示了从四个不同实验中获得的平均值±S.D。可以观察到：（i）CD95/Fas的触发在FasL给药30分钟内显著刺激FITC-右旋糖酐珠的内吞作用(图1D，左侧面板）；（ii）血清剥夺后，FasL触发细胞对FITC-右旋糖酐珠的摄取显著增加(图1D，右侧面板）。此外，我们还发现FasL诱导的内吞是caspase非依赖性的，不受泛酶抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞的影响(图1D)FCS存在（白色条）或不存在（黑色条）时。此外，我们还使用了莫能菌素（一种溶酶体促生长剂）和钠+离子载体，通过抑制液泡质子泵改变内体pH值，从而抑制细胞表面的细胞内交通和受体再循环[20]. 正如所料，莫能新(图1D)预处理显著抑制了FCS存在（白色条）和不存在（黑色条）时FasL诱导的FITC-右旋糖酐珠的摄取。重要的是，我们还观察到用（i）抗人Fas IgG1中和抗体（克隆ZB4）进行细胞治疗，该抗体结合Fas受体而不触发凋亡（结果未显示），以及（ii）STS，一种通过受体依赖机制，即通过线粒体途径诱导凋亡的药物(图1D)右旋糖酐珠内化法评价，不影响内吞率。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0001.jpg
CD95/Fas结扎和内吞

(A类)荧光光谱法测量悬浮在林格氏缓冲液中的CEM细胞在无（对照）和有FasL的情况下摄取FM1-43后的内吞作用。其最终浓度(μg/ml）和预培养时间。作为额外的对照，我们使用中和抗人Fas IgG1单克隆抗体，克隆ZB4（黑线）。(B类)在与(A类). 用FasL（0.5）孵育20分钟后，获得五个重复孔的平均值μg/ml）或1μM离子霉素（快速内吞的诱导剂）。(C)流式细胞术分析经FasL处理30分钟或1小时的活细胞（通过碘化丙啶排除试验选择）中CD95表面表达与未处理细胞的比较。数字代表荧光中值。注意，CD95表达仅在FasL治疗1小时后才出现轻微下降。(D类,F类)FasL诱导的内吞作用的调节。(D类)在FCS存在（白色条）或不存在（黑色条）时对内吞作用进行流式细胞术分析。报告的数值代表从四个不同实验中获得的摄入右旋糖酐–FITC的细胞百分比的平均值±S.D。注意：（i）在存在或不存在FCS的情况下，可以检测到相同的趋势；（ii）在FCS停药后的细胞中检测到右旋糖酐摄取显著增加（注意所用的不同尺度）；（iii）单独给予的Z-VAD-FMK或莫能菌素对其自身的葡聚糖摄取没有改变；（iv）虽然Z-VAD-FMK预处理并没有改变FasL诱导的右旋糖酐摄取，但莫能菌素预处理显著削弱了这一过程。(E类,F类)通过右旋糖酐-FITC摄取评估对内吞作用进行定量流式细胞术分析，该评估在有代表性的实验中获得(E类)或缺席(F类)未来作战系统。数字表示摄入右旋糖酐–FITC的细胞百分比。阴性对照（自体荧光）报告于(E1级)和(一层楼). 添加台盼蓝抑制荧光葡聚糖的表面吸收对细胞荧光几乎没有影响(E2级–电子5与E6公司–第9版和地上二层–五楼与六楼–九楼)这表明大多数珠子在细胞内被内吞。请注意，Z-VAD-FMK在补充FCS的细胞或在FCS饥饿状态下的细胞中无效(E3公司与第4页和第三层与四层)而莫能菌素显著降低了右旋糖酐负载细胞的百分比(E3公司与电子5和第三层与五楼).

在图1（E）和1（F），在FCS存在下进行的典型流式细胞术实验中获得的结果(图1E)或在没有FCS的情况下（撤回生长因子，图1F)如图所示。添加台盼蓝抑制荧光葡聚糖的表面吸收对细胞荧光几乎没有影响(图1; 面板E2–E5与E6–E9以及F2–F5与F6–F9），表明大多数珠子在细胞内被内吞。

总之，这些结果似乎表明，在II型细胞中，CD95/Fas连接整体上刺激了内吞途径，与激活的CD95/Fas受体的caspase依赖性内化和再循环无关。这与最近的研究一致，这些研究表明，快速CD95/Fas内化以及随后的DISC形成和caspase 8激活仅限于I型细胞[2].

莫能新抑制FasL诱导而非STS诱导的细胞凋亡

基于上述结果，我们通过流式细胞仪分析评估了在我们的实验条件下CEM细胞凋亡的发生。特别是，我们发现，正如预期的那样，在II型细胞中，泛酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK能有效阻止FasL和STS（均称为caspase-dependent cell death inducers）诱导的凋亡。此外，根据图1，我们还发现莫能菌素仅能抑制FasL处理细胞的凋亡(图2A和2B). 尤其是，对膜联蛋白V阳性细胞和碘化丙啶阳性细胞的分析清楚表明，莫能菌素对STS诱导的凋亡无效。代表性实验如所示图2（A）.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0002.jpg
细胞凋亡分析

膜联蛋白V/碘化丙啶双重染色后的流式细胞术分析。未经处理的对照细胞（左侧面板）、单独暴露于FasL（中间面板）或STS（右侧面板）的细胞（上部面板）或经过Z-VAD-FMK（中间）或莫能菌素（底部）预处理的细胞显示为(A类). 数字表示膜联蛋白V单阳性（早期凋亡，右上象限）或膜联蛋白V/碘化丙啶双阳性（晚期凋亡，右下象限）细胞的百分比。(B类)四个独立实验的结果以平均值±S.D.的形式报告。注意：（i）Z-VAD-FMK显著阻止STS-和FasL诱导的细胞凋亡，而（ii）莫能菌素仅阻止FasL引起的细胞死亡。

CD95/Fas结扎后胞内蛋白的再分布

在上述结果的基础上，通过TEM分析了CD95连接对II型细胞内吞区室的影响。正如预期的那样，相对于对照细胞，我们观察到FasL处理细胞的细胞质中膜内吞结构增加(图3A). 然而，更重要的是，在线粒体附近检测到了一些内吞小泡(图3B和3C). 通过形态计量分析对这一现象进行的定量评估（见“实验”部分）表明，FasL处理的细胞中靠近线粒体的空泡频率显著高于对照未处理的细胞(图3D). 此外，值得注意的是，这些细胞质变化发生在FasL诱导的CD95触发后的早期（30分钟），这些细胞尚未表现出凋亡的超微结构迹象，并随着时间的推移（长达1小时）而增加。在此之后，即3小时后，可检测到典型的凋亡迹象（结果未显示）。为了进一步研究这一现象，我们决定评估凋亡刺激下的BSA内吞作用。IEM（免疫电子显微镜）获得的结果(图4A–4D)和荧光分析(图4E–4F)明确表明，与CD95/Fas触发相关的BSA内吞作用最终可导致线粒体中存在BSA。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0003.jpg
内吞作用的形态学证据

(A类–C)FasL处理CEM细胞30分钟后的透射电镜照片(A类)并持续1小时(B类). 注意内吞小泡(A类)（箭头）和线粒体附近存在的小泡(B类). (C)放大装箱区域(B类). 注意膜泡与线粒体紧密接触。(D类)通过透射电镜观察，对FasL给药30分钟和1小时后，线粒体附近出现一个或多个小泡的细胞百分比进行形态计量和统计分析*P（P）与未处理细胞相比<0.01。放大倍数：(A类,C）×28000.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0004.jpg
CD95/Fas结扎后BSA内吞

FasL处理30 min后CEM细胞BSA免疫金标记（预包埋技术）。注意内膜小泡中存在金颗粒(A类)，位于线粒体附近的小泡中(B类)，在线粒体膜上(C箭头）和线粒体中(D类，箭头）。荧光显微镜分析也表明，与对照细胞相比(E类)，黄色染色表明CD95/Fas结扎后BSA（红色）-线粒体（绿色）覆盖层明显(F类). 箭头表示插图中包含的单元格。

根据这些形态学观察，可能暗示一些内吞小泡向线粒体的定向运动，我们决定详细分析我们系统中内吞小体的亚细胞分布，即CD95/Fas触发后。因此，进行了一系列实验，通过蛋白质印迹分析内吞途径的三种不同膜标记物：EEA1、Rab5和LAMP-1。我们最初关注的是EEA1，这是一种通常存在于细胞质中的膜系留蛋白，通过与早期内体的独特磷脂磷酸肌醇3-磷酸相互作用而被募集到内体膜上[21,22]，如其他地方所述，通过连续10-40%蔗糖密度梯度后的细胞亚组分[17]. EEA1在未处理细胞的低密度组分中呈正常分布(图5A)但当细胞被FasL处理时，该分子向富含VDAC-1的组分（对应于富含线粒体的组分(图5D)，已检测到。有趣的是，EEA1的这种再分配是非caspase-independent的，因为用Z-VAD-FMK治疗后仍然很明显(图5A). 更有趣的是，莫能菌素预处理(图5A)阻止Fas介导的EEA1向富含线粒体部分的再分配。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0005.jpg
CD95/Fas结扎后胞内蛋白的再分布

未经处理或用FasL处理的CEM细胞（37°C下100 ng/ml，30 min）在裂解缓冲液中进行裂解，制备核后上清液，并将其装载在连续的10–40%（w/v）蔗糖梯度上。或者，用Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理细胞，然后如上所述用Fas-L处理细胞。离心后，收集组分，用SDS/PAGE分离每个组分的样品，并用Western blotting进行分析。蔗糖密度梯度离心后获得的组分，未经处理或用FasL处理，或用50μM Z-VAD-FMK或10μ使用针对EEA1的多克隆抗体对上述莫能菌素进行分析(A类)，拉布5(B类)或LAMP-1(C). 作为对照，用多克隆抗VDAC-1抗体对未经处理和FasL处理的细胞进行蔗糖密度梯度离心后获得的组分进行分析(D类)或多克隆抗CD95/Fas(E类). 注意，在CD95/Fas结扎后，LAMP-1和早期内体标记（在较小程度上）（而非CD95/Fas-）重新分布到富含VDAC-1的组分。这种再分配在用泛酶抑制剂Z-VAD-FMK预处理的细胞中几乎无法检测到，但用莫能菌素预处理可以阻止这种再分配。

接下来，我们研究了膜标记物Rab5的分布，该标记物针对早期/再循环内体[22,23]. Rab5再分配部分匹配EEA1分馏曲线的变化(图5B). 事实上，在没有FasL处理的情况下，Rab5蛋白呈现双峰分布。在低密度和高密度组分中均检测到显著水平的蛋白质。这与Rab5通常定位于早期和再循环内体的概念一致[24]. 相反，FasL细胞处理缩小了Rab5在密度梯度上的双峰分布，并增加了其在富含线粒体部分的水平(图5B). 同样，FasL诱导的Rab5分布变化几乎不受泛酶抑制剂Z-VAD-FMK治疗的影响，但可通过莫能菌素预处理来阻止(图5B).

在与上述相同的实验条件下，还对LAMP-1等晚成体蛋白标记物进行了分析。LAMP-1通常集中在未处理细胞的高密度部分，在FasL处理30分钟后转移到低密度部分(图5C). 在Z-VAD-FMK存在的情况下，LAMP-1分布的这种改变仍然很明显，但在用莫能菌素预处理后没有发生(图5C).

作为对照，在存在或不存在FasL诱导的内吞作用的情况下，分析CD95/Fas在相同组分中的分布模式(图5E). 正如预期的那样，在未经处理的细胞中，在低密度组分中检测到CD95/Fas。CD95/Fas触发内吞后[2]，该受体仍在低密度组分中检测到，早期内体也定位于低密度组份，但该分子未向富含线粒体的组分进行明显的再分配。

总之，这些发现似乎表明，CD95连接后II型细胞内吞作用增加(图1)与之平行的是早期和晚期内胚体向富含线粒体的隔室的定向运动。

莫能菌素阻碍MMP的损失

考虑到线粒体在II型细胞凋亡执行中的关键作用，还进行了进一步分析以评估MMP，已知MMP在凋亡细胞中减少，并与凋亡因子的释放有关[4-6] (图6). 在FasL和STS处理的细胞中都可以检测到MMP的典型丢失(图6A). 在这两种情况下，Z-VAD-FMK显著阻碍了MMP的损失，但莫能菌素仅阻断FasL引起的MMP损失。事实上，在FasL和STS处理后，莫能菌素引起的内体室扰动对MMP的影响不同：它能有效保护FasL处理的细胞线粒体免受MMP丢失，但在STS处理的细胞中无效（在图6A给出了一个具有代表性的实验）。使用替代探针（TMRM）发现了相同的结果，如图6（B）事实上，仅在FasL处理的细胞中，莫能菌素预处理显著降低了线粒体去极化细胞的百分比(图6C). 总之，这些发现表明，莫能菌素干扰了内吞途径，也干扰了细胞凋亡的执行，减少了基质金属蛋白酶的丢失。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0006.jpg
基质金属蛋白酶分析

(A类)对未经处理的对照细胞和单独或Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理后暴露于FasL或STS的细胞进行JC-1染色后的定量和定性双参数流式细胞术分析。(A类)显示了典型实验的点图。在折线下的区域，数字表示线粒体去极化的细胞百分比(B类)使用TMRM探针对MMP进行半定量流式细胞术分析。数字表示荧光强度直方图的中值。(C)使用JC-1探针进行的四项独立实验的结果被报告为平均值±标准偏差。注意，Z-VAD-FMK预处理可阻止FasL-和STS诱导的MMP丢失，而莫能菌素仅显著降低FasL线粒体效应。

Fas介导的细胞凋亡抵抗与内吞减少相关

为了进一步分析内吞作用在FasL介导信号传导中的作用机制，我们决定评估FasL在CEM细胞的多药耐药对应物VBL100细胞中触发的内吞过程[25]. 诱导MDR（多药耐药）表型是指能够通过细胞表面ATP依赖性泵（例如P-糖蛋白）挤出无关药物的细胞。人们普遍认为，多药耐药通常与对抗癌药物引起的损伤和死亡的抵抗有关，这主要取决于这种获得的挤出药物的能力。研究还表明，与野生型细胞系相比，MDR培养细胞系对受体介导和线粒体介导的凋亡表现出不同的敏感性[25,26]. 有鉴于此，我们研究了FasL诱导的VBL100多药耐药CEM细胞内吞活性的特征。

最初，我们分析了VBL100细胞（i）CD95表达模式，以评估模型系统的适用性，以及（ii）与未经处理的对照细胞相比，经FasL或STS处理的细胞内吞现象。我们发现（i）野生型和VBL CEM细胞中CD95在细胞表面的表达具有可比性(图7A); 与野生型CEM细胞相比，VBL100细胞内吞的基础水平显著降低（与图7C黑条在里面图7B). 无论是否存在FCS，都会出现这种情况（请注意，为了显示同一单元系统内的差异，使用了不同的尺度）。更重要的是，（iii）与野生型CEM细胞相比，FasL处理诱导VBL100细胞的内吞作用显著降低（与图7C带有白色条图7B); （iv）Z-VAD-FMK在预防FasL诱导的内吞作用方面无效；（v） 尽管FasL触发的内吞作用与野生型细胞相比非常低，但莫能菌素也能显著阻止VBL100细胞的内吞现象。最后，根据在野生型CEM细胞中获得的结果，（v）STS不影响VBL100耐药CEM细胞变体的内吞活性(图7C). 这些结果与细胞凋亡相一致(图7D)和MMP(图7E)数据。事实上，与野生型CEM细胞相比，VBL100细胞对FasL诱导的凋亡的敏感性显著降低，而对STS诱导的凋亡敏感性显著升高(图7D). 因此，在VBL100细胞中，FasL诱导MMP丢失的效果不如STS(图7E).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0007.jpg
Fas介导的凋亡抵抗与VBL100细胞内吞减少相关

(A类)流式细胞术分析经FasL处理30分钟或1小时的活细胞（通过碘化丙啶排除试验选择）中CD95表面表达与未处理细胞的比较。数字代表荧光中值。注意，CD95表达仅在FasL治疗1小时后才出现轻微下降。(B类)流式细胞术分析未经处理或FasL处理30分钟的野生型CEM细胞在有无FCS的情况下的内吞作用(C)不同实验条件下的VBL100细胞。结果表示摄入右旋糖酐–FITC的细胞百分比，报告为在使用FasL或STS治疗之前，在没有或存在Z-VAD-FMK或莫能菌素的情况下进行的四个不同实验所得数据的平均值±S.D。(D类)VBL100细胞凋亡分析。未经处理的对照细胞、单独给予FasL或STS的细胞或Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理后的细胞经膜联蛋白V/碘化丙啶双重染色后进行FACS分析。结果报告为四个独立实验的平均值±S.D。(E类)VBL100细胞MMP分析。对未经处理的对照细胞和单独或Z-VAD-FMK或莫能菌素预处理后暴露于FasL或STS的细胞进行JC-1染色后进行双参数流式细胞术分析。线粒体去极化的细胞百分比报告为四个独立实验所得数据的平均值±S.D。

根据这些结果，在VBL100细胞中连续10–40%蔗糖浓度后，必须评估细胞亚分馏中可能存在的内吞成分，即EEA1、Rab5和LAMP-1。西部片分析(图8)明确表明，在FasL处理的VBL100细胞的线粒体富集组分中，可能未检测到早期和晚期内体标记物的重新分布。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ukmss-28634-f0008.jpg
CD95/Fas结扎后内胚体蛋白在VBL100细胞中的再分布

未经处理或经FasL处理的细胞在裂解缓冲液中进行裂解，制备核后上清液，并将其装载在10–40%连续蔗糖梯度上，如“实验”部分所述。离心后，收集组分，用SDS/PAGE分离每个组分的样品，并使用单克隆抗EEA1、单克隆抗Rab-5、单克隆抗体LAMP-1和多克隆抗VDAC-1进行Western blotting分析。注意，在CD95/Fas结扎后，EEA1、Rab5和LAMP-1实际上并没有改变它们的分布。

总之，这些结果表明，在FasL给药后，VBL100细胞没有表现出活性增加和内体室重塑（在野生型CEM细胞中观察到），同时，它们也不太容易受到FasL诱导的凋亡的影响。

讨论

在本研究中，我们表明，在II型CEM细胞中，死亡受体CD95/Fas与其生理配体FasL的相互作用在发生凋亡之前触发并增强内吞作用，且与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活无关。特别是，FasL给药似乎触发了一些早期和晚期内体向线粒体的定向“运动”，线粒体是II型细胞凋亡执行的主要激活物。因此，本研究的主要观点涉及内体室对线粒体介导的凋亡执行的贡献，正如先前对其他亚细胞细胞器的建议一样[9-11]. 事实也表明，在耐多药耐药的CEM细胞变体中，即VBL100细胞，其对Fas诱导的凋亡的敏感性显著降低，在FasL激活CD95后，内吞室不参与凋亡执行。事实上，在这些细胞中观察到的对FasL的有限敏感性既不能归因于CD95表达的减少，也不能归因于凋亡机制的缺陷，VBL100细胞对STS诱导的细胞死亡敏感。

总之，这些结果与其他作者在I型细胞中观察到的内吞活性增加相一致。然而，这些发现集中于CD95受体的内化，即CD95与其配体在I型细胞中的相互作用，而I型细胞的凋亡取决于活化受体的有效内吞作用[2]. 在I型细胞中，CD95触发诱导典型的受体内化，导致大量DISC的形成，并在没有任何线粒体参与的情况下导致胱天蛋白酶激活和凋亡。在我们的实验模型，即II型CEM细胞中，这里提供了FasL诱导的内吞作用的令人惊讶的证据。FM1-43（一种通常用于评价内吞作用的染料）的摄取量急剧增加就很好地证明了这一点[8,15]，以及右旋糖酐珠的摄取。考虑到葡聚糖珠的摄取与（宏观）胞饮作用之间的密切关系[27]，我们的结果还表明，FasL对CD95的触发刺激了一种胞饮型的内吞作用，这与之前EGF（表皮生长因子）与其受体连接后检测到的胞饮型内吞作用类似[28]. 此外，无论受体内化和半胱天冬酶激活如何，内体区室活性的增加都与这些内体向富含线粒体的细胞亚组分的定向运动有关（见下文）[8]. 内体和线粒体之间的这种相互作用如何促进细胞凋亡的执行？各种亚细胞器可以相互作用并改变细胞命运的想法最近得到了假设[2,29,30]. 一些研究指出，为了确保细胞在经历一系列细胞器变化的情况下发生凋亡，分子会发生定向混乱，从而导致甚至触发细胞凋亡的执行。例如，最近研究了内质网在凋亡级联反应中的重要性[9,31]. 在内质网应激下，内质网跨膜受体启动未折叠蛋白反应[32]. 如果适应性反应失败，就会导致凋亡细胞死亡。这种反应与细胞器重塑和混合有关，并与几种神经退行性疾病和心血管疾病的病理生理学有关[10]. 在同一静脉中，溶酶体细胞器在不同的实验环境中进行了分析，精确地致力于理解某些溶酶体半胱氨酸蛋白酶，例如组织蛋白酶，如何在细胞凋亡期间促进溶酶体和线粒体之间的相互作用[33]. 最近，已经详细分析了高尔基体重塑在细胞凋亡过程中的可能意义。研究发现，这种细胞器也参与了导致CD95/Fas触发的凋亡的亚细胞混合活动的复杂框架[11]. 这里报告的结果似乎表明，另一个因素可能参与了这种复杂的情况：内体室。事实上，内体重塑似乎是FasL介导信号传播的一个非常早期的事件。

我们发现，通过莫能菌素（一种单价离子选择性离子载体）抑制内胚体酸化，CD95/Fas触发的凋亡被显著阻止[20]. 重要的是，该化合物还抑制EEA1、Rab5和LAMP-1内体标记向密度较低的亚细胞组分的转移，对应于线粒体富集组分。此外，FasL刺激的内吞活性独立于caspase级联的任何激活，如使用泛酶抑制剂Z-VAD-FMK和抗Fas中和抗体（结合受体而不触发细胞死亡）所示。因此，FasL治疗似乎诱导了两种不同的亚细胞过程：（i）如之前其他地方所建议的，连接受体的caspase依赖性内化[34]（ii）非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖性的内吞活性增加。

在这方面，还应考虑其他一些问题。其中一个涉及的事实是，仅在受体介导的细胞死亡中发现了内吞室活性的增加。事实上，莫能菌素抑制内吞作用并不影响促线粒体药物STS诱导的细胞凋亡的执行。因此，Fas结扎通过刺激内吞作用，可以影响膜交通，并产生一个“受控”的内吞小泡波，诱导细胞器串扰，可能有助于引入那些有利于执行凋亡的线粒体条件（例如，膜电位的改变和凋亡因子的释放）.

使用CEM细胞（VBL100细胞）的MDR对应物作为模型系统获得的数据也支持这些假设[25,35]. 这种CEM细胞亚克隆诱导获得耐药表型，即在细胞表面表达所谓的P-糖蛋白，对Fas介导的细胞死亡表现出有限的敏感性[25]与之平行的是内吞活性降低，即Fas诱导的细胞器串扰减少。事实上，与野生型细胞相比，CEM VBL100细胞系中从内吞室到线粒体的定向蛋白质运输显著减少。

与最近的论文表明内质网应激和细胞器紊乱在诱导凋亡中的关键作用一致[11,36]，我们可以假设，在II型细胞中受体介导的凋亡的早期阶段可能会发生一种内体应激。这可能导致复杂的细胞器串扰，其目的是将信号传播到适当的下游效应器（例如线粒体），最终导致细胞死亡。

致谢

我们感谢Roberta Terlizzi女士和Zaira Maroccia博士（均在意大利罗马高级卫生研究所）提供的宝贵技术援助。这项工作得到了NIH（国立卫生研究院（R.K.-F.的拨款编号为HL0808192）、Ministro della Sanitáand Telethon（W.M.的拨款）和BBSRC（生物技术和生物科学研究委员会；M.D.E.的拨款BB/C508469）的支持。R.K.-F.由美国癌症学会奖学金资助。

使用的缩写

磁盘死亡诱导信号复合体
电子工程师1早期内体抗原1
急诊室内质网
FasL公司Fas配体
未来作战系统胎牛血清
灯-1溶酶体相关膜蛋白-1
单克隆抗体单克隆抗体
MDR公司多药耐药性
基质金属蛋白酶线粒体膜电位
STS公司葡萄孢菌素
透射电镜透射电子显微镜
TMRM公司四甲基罗丹明酯
TNF公司肿瘤坏死因子
VDAC-1型依赖电压的阴离子通道-1
Z-VAD-FMK型苄氧羰基-Val-Ala-数字图书馆-天冬氨酸氟甲基酮

参考文献

1Di Fiore PP，De Camilli P.细胞内吞和信号传递，不可分割的伙伴关系。单元格。2001;106:1–4.[公共医学][谷歌学者]
2Lee KH、Feig C、Tchikov V、Schickel R、Hallas C、Schutze S、Peter ME、Chan AC。受体内化在CD95信号传导中的作用。EMBO J。2006;25:1009–1023. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Algeciras-Schimnich A、Pietras EM、Barnhart BC、Legenbre P、Vijayan S、Holbeck SL、Peter ME。两种CD95肿瘤类别对抗肿瘤药物的敏感性不同。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2003;100:11445–11450. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4.Barnhart BC、Alappat EC、Peter ME。CD95 I型/II型模型。塞明。免疫学。2003;15:185–193.[公共医学][谷歌学者]
5Austin CD、Lawrence DA、Peden AA、Varfolomeev EE、Totpal K、De Maziere AM、Klumperman J、Arnott D、Pham V、Scheller RH、Ashkenazi A.死亡受体激活阻止氯氰菊酯依赖性内吞作用。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006;103:10283–10288. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6尹XM。Bid是一种仅含BH3的多功能分子，正处于生死关头。基因。2006;369:7–19.[公共医学][谷歌学者]
7Jaattela M，Tschopp J.T淋巴细胞中Caspase非依赖性细胞死亡。自然免疫学。2003;4:416–423.[公共医学][谷歌学者]
8Fomina AF、Deerinck TJ、Ellisman MH、Cahalan MD。FM1-43在静止和激活的人类T细胞中揭示了膜运输和内吞室亚细胞组织的调节。实验细胞研究。2003;291:150–166. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Faitova J、Krekac D、Hrstka R、Vojtesek B。内质网应激与凋亡。单元格。分子生物学。莱特。2006;11:488–505. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Szegezdi E，Logue SE，Gorman AM，Samali A.内质网应激诱导凋亡的介体。EMBO代表。2006;7:880–885. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Ouasti S、Matarrese P、Paddon R、Khosravi-Far R、Sorice M、Tinari A、Malorni W、Degli Esposti M。死亡受体结扎触发高尔基体和线粒体之间的膜争斗。细胞死亡不同。2007;14:453–461. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Matarrese P、Tinari A、Mormone E、Bianco GA、Toscano MA、Ascione B、Rabinovich GA、Malorni W.Galectin-1通过线粒体超极化、出芽和分裂使静止的人类T淋巴细胞对Fas（CD95）介导的细胞死亡增敏。生物学杂志。化学。2005;280:6969–6985.[公共医学][谷歌学者]
13.Cossarizza A、Franceschi C、Monti D、Salvioli S、Bellesia E、Rivabene R、Biondo L、Rainaldi G、Tinari A、Malorni WN个-乙酰半胱氨酸在肿瘤坏死因子α诱导U937细胞凋亡中的作用：线粒体的作用。实验细胞研究。1995;220:232–240.[公共医学][谷歌学者]
14Hed J、Hallden G、Johansson SG、Larsson P。在未进行细胞分离的情况下，在流式细胞荧光法中使用荧光猝灭来测量外周血吞噬作用中的附着和摄入阶段。免疫学杂志。方法。1987;101:119–125.[公共医学][谷歌学者]
15Zweifach A.FM1-43报告T淋巴细胞中的质膜磷脂紊乱。生物化学。J。2000;349:255–260. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16川崎Y、斋藤T、Shirota-Someya Y、Ikegami Y、Komano H、Lee MH、Froelich CJ、Shinohara N、Takayama H。CTL诱导的细胞死亡相关质膜成分移位。免疫学杂志。2000;64:4641–4648.[公共医学][谷歌学者]
17Stockinger W、Sailer B、Strasser V、Recheis B、Fasching D、Kahr L、Schneider WJ、Nimpf J。PX-域蛋白SNX17与LDL受体家族成员相互作用并调节LDL受体的内吞作用。EMBO J。2002;21:4259–4267. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Degli Esposti M，Cristea IM，Gaskell SJ，Nakao Y，Dive C。促凋亡Bid与单糖脂结合，这是线粒体膜与细胞死亡之间的一种新的分子联系。细胞死亡不同。2003;10:300–1309.[公共医学][谷歌学者]
19.Nilsson C，Kagedal K，Johansson U，Ollinger K。通过流式细胞术分析凋亡细胞中的细胞溶质和溶酶体pH值。方法细胞科学。2003;25:185–194.[公共医学][谷歌学者]
20Simonsen A、Wurmser AE、Emr SD、Stenmark H。磷脂酰肌醇在膜转运中的作用。货币。操作。细胞生物学。2001;13:485–492.[公共医学][谷歌学者]
21Rink J、Ghigo E、Kalaidzidis Y、Zerial M.Rab转化是内胚体从早期向晚期进展的机制。单元格。2005;122:735–749.[公共医学][谷歌学者]
22Schnatwinkel C、Christoporidis S、Lindsay MR、Uttenweiler-Joseph S、Wilm M、Parton RG、Zerial M。Rab5效应器Rabankyrin-5调节和协调不同的内吞机制。《公共科学图书馆·生物》。2004;2：E261。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Gorvel JP、Chavrier P、Zerial M、Gruenberg J.Rab5控制早期内体融合在体外.单元格。1991;64:915–925.[公共医学][谷歌学者]
24Dinter A、Berger EG、Golgi保湿剂。组织化学。细胞生物学。1998;109:571–590.[公共医学][谷歌学者]
25Matarrese P、Testa U、Cauda R、Vella S、Gambardella L、Malorni W。P-170糖蛋白的表达使淋巴母细胞样CEM细胞对线粒体介导的凋亡敏感。生物化学。J。2001;355:587–595. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Calcabrini A、Arancia G、Marra M、Crateri P、Befani O、Martone A、Agostinelli E。精胺的酶促氧化产物对人类多药耐药结肠癌细胞（LoVo）的细胞毒性作用大于其野生型结肠癌细胞。国际癌症杂志。2002;99:43–52.[公共医学][谷歌学者]
27Conner SD、Schmid SL.监管进入牢房的入口。自然。2003;422:37–44.[公共医学][谷歌学者]
28Hamasaki M，Araki N，Hatae T.早期内胚体自身抗原1与EGF刺激的A431细胞中大胞吞作用的相关性。阿纳特。记录A.发现。分子细胞。进化。生物。2004;277:298–306.[公共医学][谷歌学者]
29Goldenthal MJ，Marin-Garcia J.线粒体信号通路：受体/整合细胞器。分子细胞。生物化学。2004;262:1–16.[公共医学][谷歌学者]
30Le Bras M，Rouy I，Brenner C.调节组织间串扰以控制细胞凋亡。医药化学。2006;2:1–12.[公共医学][谷歌学者]
31Csordas G、Renken C、Varnai P、Walter L、Weaver D、Buttle KF、Balla T、Mannella CA、Hajnoczky G.内质网和线粒体之间物理联系的结构和功能特征及其意义。《细胞生物学杂志》。2006;174:915–21. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Lai E，Teodro T，Volchuk A.内质网应激：传递未折叠蛋白反应的信号。生理学。2007;22:193–201.[公共医学][谷歌学者]
33.Ferri KF，Kroemer G.细胞死亡途径的器官特异性启动。自然细胞生物学。2001;三：E255–E263。[公共医学][谷歌学者]
34Algeciras-Schimnich A，Shen L，Barnhart BC，Murmann AE，Burkhardt JK，Peter ME。CD95初始信号事件的分子排序。分子细胞。生物。2002;22:207–220. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Malorni W、Rainaldi G、Tritarelli E、Rivabene R、Cianfriglia M、Lehnert M、Donelli G、Peschle C、Testa U。肿瘤坏死因子α是表达P-170糖蛋白的淋巴白血病细胞中一种强大的凋亡诱导剂。国际癌症杂志。1996;67:238–247.[公共医学][谷歌学者]
36Shiraishi H、Okamoto H、Yoshimura A和Yoshida H。内质网应激诱导的凋亡和caspase-12激活发生在涉及Apaf-1的线粒体凋亡下游。细胞科学杂志。2006;119:3958–3966.[公共医学][谷歌学者]