方法
SNHL的基本原理
听觉系统不同于其他感觉系统,在皮层下水平具有双侧会聚性。听觉通路的这种特性排除了大脑皮层内单耳和双耳区域的比较,并导致我们对双侧剥夺和非剥夺动物进行比较。
SNHL手术
所有方案均由纽约大学机构动物护理和使用委员会审查和批准。沙土鼠接受双侧耳蜗切除术(长爪沙鼠)P10处的幼崽,刚好在对空气传播的声音产生反应之前。详情如前所述(Sanes等人,1992年;淡水河谷和桑内斯2002). 简言之,沙鼠幼崽被麻醉(甲氧基氟烷),并用镊子迅速取出每个耳蜗。动物与父母在与对照幼崽相同的条件下饲养7天。选择手术年龄的依据是P9后的耳蜗消融对前中央耳蜗核细胞数量没有影响(Tierney等人,1997年)。尸检后,在解剖显微镜下打开每个耳蜗,发现耳蜗组织缺失,但耳蜗处有明胶海绵,从而确认耳蜗切除。
组织准备
三只正常和三只SNHL动物在P17用5%水合氯醛(i.p.)麻醉,并用4%多聚甲醛经心灌注,用0.1 M磷酸盐缓冲液(PB)缓冲至pH 7.4。为了保持抗原性,灌流液中省略了戊二醛。将大脑从颅骨中取出,在相同的固定剂中固定,直到切片。在切片当天,大脑被转移到PB。使用振动器(德国Nussloch Leica Microsystems)从左半球制备80微米厚的水平切片,侧面抬高15°。这些角度是用于生理实验的设置(Kotak等人,2005年,即将推出),并具有保留丘脑皮质束的优势,从而允许对ACx的丘脑受体区进行电生理验证。包含丘脑-皮层束的部分出现在距腹表面约2–3 mm处。这些切片在4°C的PB缓冲液(pH 7.4)中与0.9%氯化钠和0.05%叠氮化钠(PBS-叠氮化钠)自由浮动,直到抗体孵育。
初级抗体的来源和特异性
反GABAA类β2/3购自Chemicon(加利福尼亚州特梅库拉尔;目录号MAB341,原名罗氏1381458)。这是来自克隆BD17的单克隆抗体。该抗体的特异性已被许多组广泛表征。具体来说,抗体免疫沉淀GABAA类/从牛皮层和啮齿动物小脑匀浆中纯化的苯二氮卓受体复合物(哈林等人,1985年)并对转染GABA的HEK细胞表现出免疫反应性A类β2/3亚基,但不包括转染α1-6、β1、γ1、γ2、δ或gly 48k亚基的亚基(Ewert等人,1990年). 电子显微镜免疫细胞化学显示,这种抗体识别由富含GABA的轴突末端以及细胞内膜细胞器形成的对称突触(Richards等人,1987年;Fujiyama等人,2002年;Charara等人,2005年). 在我们手中,光学显微镜显示,这种抗体免疫标记在沙土鼠ACx L2/3的未标记外周体周围的斑点()通过电子显微镜,可以确定为与对称突触相关的免疫反应(详见结果一节)。这些模式与以前的光镜和电镜免疫细胞化学报告一致。
GABA的光镜定位A类ACx中的β2/3亚基和GAD。(A类和B类)针对GABA的抗体A类β2/3亚基识别对照ACx 2/3层中未标记细胞体周围的点状(箭头)(核质中的星号,A类). 相同的抗体标记了年龄匹配的SNHL ACx(核质中的星号,B类). 一些点子串在一起(三个箭头A类和B类). bv=血管管腔。(C类和天)针对GAD65/67的抗体识别围绕对照未标记核体周围(黑色星号)的点(C类)和SNHL(天)动物。此外,一些神经元胞体周围具有强烈的免疫反应性(白色星号)。所有面板的校准棒=50μm。
针对GAD 65/67的抗体购自Chemicon(目录号AB1511)。这种抗体也已被广泛鉴定。具体而言,该抗体识别蛋白质印迹和免疫沉淀GAD中预期分子量(65和67 kDa)的2条蛋白带。在完整的组织内,抗体免疫标记轴突终末,形成对称的突触,大约5%的神经元胞体位于大脑皮层(Mugnaini和Oertel 1985年;Muzio等人,2002年;Meier和Grantyn,2004年;Tongjaronbungam等人,2004年). 这些免疫标记模式与我们通过光学显微镜观察到的结果非常一致()和电子显微镜(详见“结果”一节)。
免疫细胞化学程序
采用3,3′-二氨基联苯胺HCl(DAB)和银增敏胶体金(SIG)免疫标记技术标记抗原位点(青木等人,2000年). DAB标签用于优化抗原检测,而SIG标签用于量化免疫反应的质膜和细胞内位点。来自3只SNHL和3只对照动物的切片被严格平行孵育和冲洗,6组切片之间的差异不超过10-s,以最小化免疫细胞化学(ICC)程序引起的动物间差异。
在含有1%牛血清白蛋白(西格玛化学公司,密苏里州圣路易斯)(PBS–牛血清白蛋白[BSA]–叠氮化物,pH 7.4)的PBS叠氮化物中,将6只动物中每只含有ACx的4至6个左半球切片培养30分钟,以阻断任何非特异性免疫标记。然后在室温下将这些切片在摇床上培养3天,其中PBS–BSA–叠氮化物含有2种初级抗体中的1种,即小鼠抗GABAA类β2/3(1:50)或兔抗GAD65/67(1:400)。在该培养步骤和所有后续培养步骤之后,在PBS(pH 7.4)中清洗3次。
对于DAB的免疫标记,切片在抗GABA之后在生物素化的山羊抗小鼠IgG中孵育A类β2/3亚单位抗体孵育或在山羊抗兔IgG中孵育,在抗GAD抗体孵育后(Vector Laboratories,Burlingame,CA),均以1:100(15μg/ml)的稀释液在室温下孵育1小时。然后将切片在ABC溶液中培养30分钟(Elite Kit,Vector Laboratories,Burlingame,CA),并浸入含有0.3%DAB和0.03%过氧化氢(H)的PBS(pH 7.4)中2O(运行)2)作为基底。所有切片的反应时间为6 min±5 s。将切片浸入PBS中,终止过氧化物酶反应。此ICC反应后,通过多个固定步骤保存超微结构:1%戊二醛与PBS(pH 7.4)混合10分钟;1%四氧化锇(0.1 M PB)1小时;和1%乙酸铀酰在70%乙醇中过夜。
对于GABAA类用SIG进行β2/3免疫标记,将切片在超小型(0.8nm)金结合山羊抗鼠IgG(Electron Microscopy Sciences,Washington,PA)中培养4h,PBS–BSA(pH 7.6)中的稀释度为1:100。对于用SIG进行的GAD65/67免疫标记,除了第二抗体是0.8-nm金缀合的抗兔IgG(Electron Microscopy Sciences,Washington,PA)外,切片以相同方式孵育。然后将切片用1%戊二醛和PBS(pH 7.4)固定10分钟,以在银强化之前将抗体交联到抗原位点。为了准备银强化切片,将切片在0.2 M柠檬酸盐缓冲液(pH 7.4)中冲洗1分钟。将这些切片在室温下浸入银强化试剂(英国白金汉郡阿默沙姆的silver IntensEM Kit)中12分钟。样品之间银强化步骤的持续时间差异不超过10秒。通过柠檬酸盐缓冲液中的冲洗段终止银强化。这些部分被存放在PBS中过夜。第二天,切片进行了无锇处理(青木等人,2000年)保护膜和超微结构,防止强氧化剂(如四氧化锇)强化银的损失。对GAD ICC产生的SIG颗粒大小的分析显示,在对照组和SNHL动物的组织中分布几乎相同(直径的平均值:对照组为59±11 nm;SNHL组为60±12 nm),这表明在银强化步骤中引入的动物间变化可以忽略不计。将组织包埋在塑料中的后续步骤如前所述(青木等人,2000年;Aoki等人,2007年).
进行对照以测试两种主要抗体识别GABA的能力A类沙土鼠的β2/3和GAD。这些切片是通过与实验切片平行的相同步骤处理的,但第一次孵育不包含初级抗体。这些对照切片中没有免疫标记。
为收集数据而分析的区域
安装在格栅上的超薄截面包含ACx的丘脑接收区。分析领域集中于L2/3,正好位于第1层之下。第1层通过背部光滑的胶质样软膜和锥体神经元体细胞的缺失来确定(Kotak等人,2005年). 我们分析了组织的最表层部分,确定为神经膜和塑料包埋材料之间的界面,在那里,免疫物质的暴露是最大的。
所有图像均使用CCD摄像机(AMT,MA)以30000倍的放大倍数进行数字拍摄。放大后,每个显微照片覆盖的神经膜面积约为19μm2从每只动物的ACx中,大约20张显微照片(约380μm2)进行超微结构分析。软件ImageJ,Bethesda,MD(1.36b NIH)用于测量捕获图像中突触神经膜外的区域(即仅由核质、血管或嵌入基质占据的区域)。年报告的“神经总面积”和反映了突触神经膜面积的校正值。
表1
GABA的亚细胞定位A类β2/3,表示为总免疫反应的百分比
| | 细胞内 | 等离子体膜 |
组 | 总神经膜(μm2) | 阿克森 | 枝晶岩 | 索玛 | 突触前的 | 突触后:树突/胞体 | 非突触性或不确定 |
A.β2/3 DAB免疫标记 |
SNHL公司 | 1032.06 | 13.24 ± 1.97 | 32.1 ± 1.15 | 8.81 ± 0.70 | 9.50 ± 1.81 | 8.62 ± 0.97 | 27.72 ± 1.03 |
控制 | 1050.49 | 8.11 ± 0.52 | 22.21 ± 1.7 | 3.36 ± 0.38 | 9.77 ± 1.44 | 15.33 ± 1.13 | 41.21 ± 2.22 |
P(P)-价值 | | P(P)> 0.1 | P(P)< 0.009* | P(P)< 0.007* | P(P)> 0.9 | P(P)< 0.02* | P(P)< 0.02* |
B.β2/3 SIG免疫标记:颗粒计数 |
SNHL公司 | 1062.64 | 11.4 ± 1.88 | 51.04 ± 1.38 | 7.1 ± 1.93 | 4.32 ± 1.58 | 22.46 ± 2.46 | 3.63 ± 0.21 |
控制 | 1039.13 | 6.57 ± 2.2 | 27.32 ± 5.22 | 3.31 ± 0.23 | 2.41 ± 1.23 | 59.20 ± 2.35 | 1.35 ± 0.4 |
P(P)-价值 | | P(P)> 0.1 | P(P)< 0.02* | P(P)> 0.08 | P(P)> 0.3 | P(P)< 0.0005* | P(P)< 0.008* |
C.β2/3免疫标记SIG:聚类计数 |
SNHL公司 | 1062.64 | 12.06 ± 1.66 | 38.0 ± 7.37 | 19.73 ± 10.8 | 7.72 ± 3.06 | 11.51 ± 1.55 | 10.98 ± 1.68 |
控制 | 1039.13 | 7.50 ± 2.64 | 21.61 ± 2.8 | 9.53 ± 0.72 | 8.93 ± 0.25 | 28.53 ± 1.97 | 23.88 ± 0.13 |
P(P)-价值 | | P(P)> 0.2 | P(P)> 0.1 | P(P)> 0.4 | P(P)> 0.7 | P(P)< 0.003* | P(P)< 0.003* |
D.β2/3免疫标记SIG:聚集区 |
SNHL公司 | 1062.64 | 9.18 ± 0.57 | 44.63 ± 2.14 | 9.47 ± 1.17 | 5.23±1.1 | 21.77 ± 2.16 | 9.79 ± 1.90 |
控制 | 1039.13 | 5.54 ± 1.43 | 29.06 ± 5.39 | 4.74 ± 0.94 | 1.58 ± 1.34 | 57.33 ± 2.83 | 1.66 ± 0.14 |
P(P)-价值 | | P(P)> 0.07 | P(P)> 0.05 | P(P)< 0.05* | P(P)> 0.1 | P(P)< 0.0006* | P(P)< 0.02* |
表2
每种感觉状态下GAD65/67免疫标记轴突末端的测量
组 | 总神经膜(μm2) | #Synaptic终端 | #突触终端/μm2 | 终端面积(μm2) | 密度(#SIG颗粒/μm2) | 密度(#SIG簇/μm2) | 密度(SIG面积/终端面积,%) |
SNHL公司 | 1009.9 | 86 | 0.09 ± 0.002 | 0.44 ± 0.06 | 99.94 ± 4.02 | 24.53 ± 1.78 | 8.72 ± 0.10 |
控制 | 1105.4 | 123 | 0.10 ± 0.01 | 0.36 ± 0.02 | 67.79 ± 10.60 | 18.46 ± 1.35 | 5.83 ± 0.78 |
P(P)-价值 | | | P(P)< 0.001* | P(P)< 0.05* | P(P)< 0.05* | P(P)< 0.008* | P(P)< 0.003* |
超微结构特征识别
因为分析的重点是抑制性突触的变化,所以有必要区分对称性(抑制性)突触和非对称性(兴奋性)突触子。根据细胞质中存在多个小而透明的小泡,一个轮廓被确定为轴突。轴突部分被确定为突触,轴突质膜平行于另一个既不是星形细胞也不是轴突的剖面的质膜。如果与电子密度、突触后密度(PSD)相关,则突触后侧为兴奋性不对称侧。没有可观察到的PSD的突触被鉴定为抑制性突触。
GABA的分类A类SNHL和对照动物组织ACx中β2/3的标记
进行定量电子显微镜分析以确定新生儿SNHL是否影响GABA的亚细胞定位A类β2/3亚基标记。对以下两种感官饲养条件进行了比较:SNHL饲养7天与完整(对照)饲养7天,均在P17。DAB和SIG标记均用于表征亚细胞定位。实验人员对感官饲养条件一无所知。
GABA公司A类计算了两大类β2/3免疫反应,即细胞膜和质膜。细胞内位点进一步分为3组:轴突、树突或体细胞。质膜部位也被进一步分类为突触前、突触后或突触外。如果标记出现在质膜上,但位于不邻接轴突末端的部分,或从突触前膜和突触后膜的平行排列中去除100 nm以上,则标记被确定为突触外。在SNHL和对照组织中,SIG颗粒簇的大小差异很大(). 然而,如上所述,在感官饲养条件下,SIG簇的平均大小几乎相同。SIG团簇的直径通常为60 nm。因此,发生在离质膜60 nm范围内的SIG颗粒簇被归类为质膜。
GABA的量化A类SNHL和对照动物组织ACx中β2/3的标记
对于上述6种相互排斥的亚细胞类别中的每一种,使用Adobe Photoshop软件(6.0版;加州圣何塞)和ImageJ软件(1.36b NIH)计算SIG粒子聚集簇所占的面积。我们还统计了6个亚细胞结构域中出现的SIG簇的数量。最后,通过描绘形成簇外轮廓的凸起来估计簇内可分解粒子的数量。这三种计数方法是为了避免在识别SIG免疫标记水平时的主观性。我们在量化中接受了所有尺寸的SIG粒子。通过将SIG水平(粒子数、SIG簇数或SIG面积)的值除以每只动物遇到的总SIG水平,对SIG量化的3个程序中的每一个进行归一化。因此,中显示的值和以“百分比”为单位表示
与SIG颗粒相比,DAB标签更加分散。在极少数情况下,当DAB的免疫标记在质膜和细胞内位点之间连续出现时,两类都加1。对于每只动物,我们确定了总标签在上述6个亚细胞区域中出现的比例。此外,还对细胞内与质膜上发现的免疫标记的相对分布进行了比较。
使用这些程序,SIG颗粒计数高于DAB标记获得的计数。这种差异源于SIG标签的离散性,它允许我们计算每个簇中包含的粒子数。相反,DAB标记是弥散的,导致我们将免疫反应计数为沿着质膜的电子致密斑块和细胞内团块。
为了比较感官条件,我们进行了双尾学生t吨-检验,假设方差不相等。显著性水平设置为P(P)< 0.05.
SNHL和完整Acx中GAD标记的量化和比较
GAD发生于轴突、树突和躯体。因为我们对比较突触前GAD水平感兴趣,所以在定量分析中只包括突触前末端谱。突触前终末可通过细胞质中存在多个小泡来识别。DAB免疫标记主要用于在SIG定量GAD水平之前评估抗体的特异性。对感觉饲养条件下的以下参数进行了比较:所调查的每个突触神经膜区域中GAD免疫反应终末的数量;突触前终末面积的平均值和SEM;突触前终末GAD免疫反应。GAD轴突终末的这些分析是在二维图像而非三维重建上进行的,因为免疫标记仅限于振动切片的最表面部分。使用ImageJ(1.36b NIH)和鼠标垫(Wacom,Pearl模型)测量突触前细胞质剖面的面积。如GABA所述,轴突末端轮廓内的GAD免疫反应可通过3种方式定量A类β2/3标记:通过计算轴突末端内SIG颗粒的数量,计算SIG颗粒簇的数量,并使用图像J测量SIG簇在轴突末端所占的面积。将这些值中的每一个标准化为轴突末端的面积。Mann–Whitney非参数统计测试中感官条件的比较U型以及Kolmogorov–Smirnov,显著性水平设置为P(P)< 0.05. 软件Statistica 6.1(StatSoft,Tulsa,OK,1984-2003)用于执行上述统计测试。实验人员并非对这些条件视而不见。
结果
GABA的亚细胞分布A类β2/3免疫标记
DAB和SIG标记都被用作免疫标记来表征GABA的亚细胞分布A类β2/3亚基。DAB标记的β2/3簇被鉴定为电子密度聚集体,其至少高于质膜的光学密度200%,且>质膜厚度的2倍(). SIG免疫反应的特征是电子密度最大的粒子聚集,形成较大的粒子簇(). GABA的特异性A类β2/3抗体是通过在没有一级抗体的培养切片中没有标签来确认的(). 此外,在具有厚PSD的突触处缺乏免疫标记证实了抗体没有与兴奋性突触的抗原发生交叉反应。沿着组织也没有标签-嵌入812个表面().
显示GABA示例的电子显微照片A类在ACx 2/3层的质膜和细胞内部位进行β2/3免疫标记。GABA公司A类图中显示了DAB程序中的β2/3免疫标记(A类)至(天)以及SIG程序的数字(E类)至(H(H)). (A类)对照动物ACx周核的质膜标记(箭头)。免疫反应性位于对称突触(箭头),并向内质网细胞内延伸(箭头)。这种连续标记被记录为标记在“细胞内”和“质膜”类别下。粗短箭头显示不对称突触的突触后密度缺乏免疫反应。此处和其他面板中,At=轴突终端。(B类)浆细胞标记的另一个例子,以更高的放大率拍摄。在这个对称的突触(箭头),DAB标记在细胞内延伸(箭头)。同一树突与另一轴突并列(右上角),因此可以通过其他部位存在的小泡来识别。面向轴突的树突质膜显示出较少的DAB标记。(C类)SNHL动物ACx树突内的细胞内标记斑块(箭头)。这些斑块位于一个明显未标记的对称(可能是抑制性)突触附近。轴突末端(白色箭头)内存在致密囊泡,进一步证实了这一点。箭头指向非突触的质膜免疫标记。(天)在对称突触部位和突触后树突内孵育的对照组切片中缺乏DAB免疫反应。(E类)SIG粒子簇(此处和内部为白色星号F类和G公司)在2个质膜之间的连接处,在胞体(S)上形成对称突触。附近的不对称(可能是兴奋性)突触(箭头)未标记。注意组织:Embed812接口,用黑色十字(+)标记。取样组织与组织的接近性–Embed812界面是有意的,以确保从最大程度暴露于免疫反应物的区域进行取样。(F类)SIG颗粒在树突(D)上形成的对称突触上的类似聚集。(G公司)SIG颗粒位于体细胞内,靠近轴突末端At形成的对称突触(H(H))在未经初级抗体孵育的对照组织中,远端树突上的对称突触以及树突的细胞内部分缺乏SIG免疫反应性。(我)GABA定量分析A类β2/3–3只SNHL动物的ACx中出现DAB免疫反应。对照动物的大脑皮层显示GABA占总GABA的比例明显较高A类血浆β2/3免疫标记(白条)。相反,SNHL动物的皮层显示GABA的比例明显较高A类β2/3免疫标记细胞内(黑条),远离质膜。(J型)SIG粒子团分布模式的定量分析。对照动物的大脑皮层显示GABA占总GABA的比例明显较高A类SIG在质膜(白条)上进行β2/3免疫标记,而SNHL动物的皮层显示GABA的比例明显较高A类β2/3免疫标记细胞内(黑条),远离质膜。星号(我)和(J型)标记的重要性P(P)<0.002,由双尾学生确定t吨-测试。At,轴突末端;S、 躯体;D、 枝晶。比例尺=500 nm。
我们首先确认,对于对照组和SNHL组织,GABAA类β2/3免疫标记出现在对称突触的突触后膜上,如沙鼠脑干所示(Korada和Schwartz 1999)以及其他哺乳动物大脑中的其他部位(Richards等人,1987年;Fujiyama等人,2002年;Charara等人,2005年). 对称突触的特点是缺乏突触后密度(PSD),但突触前膜和突触后膜明显平行排列。这些对称的突触有时被发现,免疫标记更集中在突触间隙的侧面(). 因为这种抗体是针对亚单位的胞外结构域的,所以我们预计免疫反应会沿着质膜的胞外表面以及膜细胞内细胞器的内腔发生。正如预期的那样,DAB标记发生在突触间隙内或覆盖在细胞内膜细胞器上(). SIG标记通常集中在突触间隙和细胞内,而膜细胞器无法被检测到,可能是因为它们被SIG颗粒遮住了().
在感觉条件之内或之间,与GABA接触频率的比较A类单位面积β2/3免疫反应性显示,无论是使用DAB计数、SIG颗粒计数、SIG-簇计数还是SIG簇面积测量,均无显著差异(t吨-测试,P(P)>对于所有比较为0.5)。
然后我们比较了GABA的分布A类β2/3免疫反应在细胞内与质膜室之间。该分析表明,对照动物的ACx在质膜上的免疫标记比例明显高于SNHL动物的ACx(). 具体来说,对照组织的GABA平均为66±2%A类β2/3–DAB免疫标记与质膜相关,尽管SNHL组织在质膜上仅显示46±2%的免疫标记(P(P)< 0.002,t吨-测试)(). 同样,SIG聚类计数分析显示,对照组GABA平均为61±5%A类β2/3免疫标记物与质膜相关,而SNHL组织在质膜上仅显示29±4%的SIG标记物(P(P)< 0.005,t吨-测试)(). 同样,对SIG聚类区域的分析显示,GABA的60.57±4%A类β2/3免疫标记物与对照组织的质膜相关,而只有39.34±3.5%出现在SNHL组织的质膜上(P(P)< 0.05). 突触后树突和体细胞质膜上的标记物与对照之间的SNHL差异最为显著().
Axon末端的GAD免疫反应性
接下来,我们试图确定SNHL后ACx的超兴奋性(Kotak等人,2005年也可能通过GABA能突触的突触前终末内的变化发生。
我们首次证实沙土鼠ACx内的GAD65/67免疫标记仅发生在与对称突触相关的突触前终末,表明该抗体不会与兴奋性轴突终末抗原发生交叉反应(). 再次,使用SIG作为免疫标记物,用3种方法测量轴突末端内的GAD水平。SNHL动物轴突末端每个细胞质区域的SIG颗粒和簇密度似乎高于对照动物(例如。,). 事实上,对ACx中200多个轴突终末的分析表明,无论是使用SIG颗粒计数、SIG簇计数还是SIG面积计数来量化GAD水平,SNHL组织的GAD免疫反应水平更高(,). 此外,标记的轴突末端显示高水平的GAD(>100 SIG颗粒/μm2)在SNHL动物的ACx中数量更多(SNHL的动物大脑中20%的轴突终末,而对照动物的大脑中只有7%,). 尽管存在这些差异数在SIG颗粒和团簇中,SIG团簇根据大小在两种感官条件下的分布非常相似(,下部),表明银强化程序的效率在整个组织组中得到了充分控制。
电子显微镜显示抑制性轴突末端的高度特异性GAD65/67免疫标记。(A类,B类)抑制性轴突轮廓内的SIG免疫标记(白色星号)形成对称(可能是抑制性)突触到邻近的躯体(S)。白色箭头表示突触的活动区。对照组组织中轴突轮廓内SIG颗粒的密度明显较低(A类)与SNHL相比(B类)动物。(C类)形成对称突触的轴突末端(白星)强烈标记为DAB。相反,形成不对称突触的轴突终末(可能是兴奋性的,黑色箭头指向突触前膜)显然没有标记。比例尺:500 nm。
(A类)GABA能抑制性轴突终末内GAD的平均密度。SNHL动物的皮质中的该值显著高于对照组。这些值代表突触前终末内GAD65/67–SIG粒子数密度的组平均值。星号代表P(P)<0.005,由独立组的Kolmogorov–Smirnov检验确定。(B类)直方图比较了两组之间轴突轮廓内GAD密度的分布。成比例地,轴突轮廓更多,显示出更高的GAD密度水平(在SNHL动物中>150 SIG粒子/μm2)与对照组动物相比。
GABA的比较A类感官饲养条件下的β2/3和GAD SIG簇大小。上图显示了GABA面积的大小分布A类在对照和SNHL动物的ACx内,沿着树突的突触后质膜出现β2/3 SIG簇。下图显示了发生在对照组和SNHL动物轴突末端的GAD SIG簇面积的大小分布。每个SIG簇是使用Adobe Photoshop(6.0版)测量的,并从像素转换为纳米单位2箭头表示每个感官饲养条件的平均值。
与轴突终末内GAD水平不同,对照组ACx单位面积突触神经膜中遇到的GAD免疫反应性轴突终末期的平均值显著高于对照组(). 遇到特定配置文件的速度取决于该配置文件的大小(Mouton 2002)。因此,我们想知道在对照组中遇到的更多终末是否是因为该组具有更大的轴突轮廓。事实并非如此。相反,SNHL动物的ACx在二维图像中轴突末端轮廓所占的面积比对照组大(). 这表明,我们检测到的与GAD终端接触频率的差异不可能是由于大小差异。
GABA的突触水平A类β2/3
GABA的亚细胞分布分析A类β2/3免疫标记显示,SNHL ACx动物在突触后树突和体细胞内的胞膜免疫反应斑的频率降低最为显著(). 对于6个样本中的每一个(3个SNHL和3个对照),我们还测量了SIG簇在突触后膜上占据的总面积。该值的比较显示了不同感官饲养条件下的显著差异().
树突突触
我们扩展了SIG分析,以确定SNHL是否影响单个GABA的大小和频率A类树突突触后质膜上的β2/3–SIG簇。反映GABA的SIG簇的相对大小A类使用ImageJ软件分析树突质膜上的β2/3–SIG免疫反应性。该分析表明,SNHL也显著降低了SIG簇的大小(P(P)< 0.05). 具体来说,尽管SNHL和对照ACx的SIG簇大小重叠,但SNHL ACx的平均SIG簇尺寸小于对照ACx(,上部),很少是控制ACx中发现的最大尺寸。SIG簇大小分布的差异不太可能是由ICC程序的差异引起的,例如银强化步骤的持续时间,因为GAD的SIG簇尺寸分布在两种感官饲养条件下非常相似(,下方),尽管国际商会的程序对所有人来说都是相同的。GABA的缩小A类β2/3–SNHL ACx内的SIG簇可能反映GABA程度的降低A类β2/3蛋白沿树突质膜聚集。
轴突-体细胞突触
GABA的减少表达A类β2/3可增强皮层兴奋性,但前提是突触后神经元具有兴奋性。虽然单凭超微结构特征很难确定突触后树突的身份,但体细胞的身份是可能的,因为锥体神经元的核膜是光滑的,而抑制性中间神经的核膜内陷(费尔德曼1984;彼得斯和圣玛丽1984). 我们利用这种超微结构特征来区分GABA能轴突轴-体靶向的两种潜在神经元类型。使用来自2只SNHL和2只对照动物的SIG免疫标记组织,平均分析每只动物10个锥体细胞和5个中间神经元。该分析表明,GABA的75±1%A类β2/3–SNHL ACx锥体细胞的SIG颗粒计数位于细胞内。相反,对照ACx的锥体细胞表现出GABAA类β2/3–细胞内部位的SIG颗粒计数为29±2%(). 这种差异是显著的(P(P)<0.05,学生的t吨-测试)。
GABA的体细胞分布A类β2/3,如SIG标签所示。SNHL动物皮层中抑制性轴突终末靶向的锥体神经元体细胞显示,细胞内(黑条)总β2/3免疫标记的比例显著高于对照动物的ACx。相反,对照组的ACx在总GABA中所占比例明显较高A类β2/3免疫标记在锥体神经元(白条)质膜上。相比之下,GABA的分布A类中间神经元胞体内β2/3免疫标记在感觉培养条件下无显著差异。星号标志意义(P(P)<0.05),由双尾学生确定t吨-测试。
尽管锥体细胞在GABA的亚细胞分布中表现出这种感觉上的依赖性差异A类β2/3–SIG免疫标记,抑制性中间神经元在两种感官条件下的亚细胞分布模式没有差异(,P(P)>0.05,学生的t吨-测试)。
轴体突触的GAD水平
GABA能轴突终末内的GAD水平也显示出差异,这取决于感觉培养条件和靶细胞类型:那些靶向锥体神经元胞体的轴突在SNHL动物ACx内平均含有比对照组更高密度的GAD-SIG颗粒(P(P)<0.05,学生的t吨-测试,). 相反,针对抑制性中间神经元的轴突终末在不同的感觉培养条件下的GAD没有差异(> 0.05).
靶向躯体的轴突内GAD–SIG密度。SNHL动物ACx中靶向锥体神经元躯体的GABA能轴突终末内GAD颗粒的平均密度显著高于对照组ACx中针对锥体神经元的GAD水平。然而,在两种感觉培养条件下,以中间神经元躯体为靶点的GABA能轴突终末内GAD的平均密度没有显著差异。星号表示P(P)< 0.05.
讨论
本研究的主要结果是,发育中沙鼠的SNHL导致GABA的减少A类β2/3定位于突触后质膜,ACx轴突终末内GAD免疫反应密度增加。此外,突触前和突触后的变化都发生在靶向兴奋性锥体细胞的突触上。尽管GABA的存在A类质膜上的受体本身不能证明这些受体的功能,受体亚单位从质膜上移位清楚地表明这些受体亚单位不能起作用。我们的发现得到了电生理学的证实,即SNHL ACx神经元显示出明显较小的自发和诱发GABA振幅A类R–抑制突触后电流和增强兴奋性(Kotak等人,2005年,即将推出)。
突触前GAD水平的增加也得到了电生理学的证实,因为这种变化可能是SNHL ACx中GABA释放概率增加的基础(Kotak等人即将发表)。这些突触的GAD升高可能反映了单个突触水平上的稳态机制,需要逆行信号将突触后效能降低与突触前效能增加联系起来(Petersen等人,1997年;Davis等人,1998年;Frank等人,2006年). 体外操作表明,根据发育阶段的不同,变化的位点可以是突触前或突触后(Wierenga等人,2006年). 然而,目前的数据表明,体内的变化轨迹是突触前和突触后的。
与GABA早期研究结果的比较A类受体亚单位表达
我们观察到的SNHL的影响并非都与其他报告一致。至少一些分歧可能是由于方法上的差异造成的。例如,共焦显微镜显示成年期双侧耳蜗消融导致GABA特异性mRNA表达增加A类下丘细胞体内的受体亚单位β2、β3和γ2以及β3亚单位免疫反应性升高(霍尔特等人,2005年). 除了年龄、大脑区域和物种的明显差异外,他们使用共焦显微镜无法评估突触后质膜的特定变化。相反,尽管他们报告的mRNA表达升高可以预测蛋白质水平的升高,但我们的方法无法确定β2/3蛋白的水平。
黑暗饲养造成的新生儿视觉剥夺不会导致总的[三H] 与猫视觉皮层受体结合的麝香酚(Mower等人,1986年,1988). β2/3免疫反应位点总数(即我们观察到的细胞质和质膜位点之和)缺乏差异,这与视觉皮层中麝香醇结合位点的稳定性一致。然而,尽管[三H] muscimol结合有助于确定组织内GABA结合位点的摩尔浓度,它不能区分特异发生在质膜和细胞内的配体结合位点,因为这两个位点都可以参与放射配体结合。
除了组织学技术产生的差异外,所采用的剥夺形式也可能产生差异。Fuchs和Salazar(1998)显示下降[三H] 麝香酚与GABA的结合A类出生后第6周修剪胡须后桶皮层内的受体。与紧邻的未分离柱相比,变化很小(<10%)但很显著。也许一旦我们将感官剥夺限制在特定频率范围内,我们的结果就会趋同。
我们对质膜部位和细胞内部位SIG免疫反应性的量化测量在三种分析模式中显著一致。然而,未确定免疫反应性类别的轻微不一致可能是由于SIG的超微结构保存不如DAB的最佳保存;也就是说,在固定方案中省略了四氧化锇。这可能导致与未知亚细胞结构相关的免疫反应位点,包括周围的胶质细胞(Bureau等人,1995年;Bekar等人,1999年). 尽管如此,可以注意到,无法识别的免疫反应类别小于其他两类的总和。
GAD端子的形态变化
我们的形态学分析显示,失聪动物ACx第2/3层的GAD阳性末端分布较少,但较大。这表明正常发育过程中的活动可能会引导较大的前体轴突终末分裂成多个独立的活动区。SNHL ACx中发现的末端数量减少可能反映了GABA能轴突末端发育迟缓。我们的调查结果与以前的报告一致。新生儿胡须修剪导致抑制性突触减少(Jiao等人,2006年)和GABA能轴突末端(Micheva和Beaulieu 1995)在桶皮层。此外,大脑皮层失神经导致大脑皮层上层对称突触的波顿区增加(拉特利奇1978). 显然,即使SNHL脑内GABA能轴突终末的形态成熟较慢,它们仍然能够通过上调每个终末的GAD含量来对抗皮质兴奋性增强。
与其他模型的比较
在视觉和体感系统中,新生儿感觉剥夺会引起皮质内连接的强烈改变(Trachtenberg和Stryker 2001)和感受野特性(Shepherd等人,2003年). 听力开始前的耳蜗摘除与睁眼前的眼球摘除和眼睑缝合最为相似。新生儿单眼眼睑缝合导致剥夺视觉皮层半球单眼区4层锥体神经元的自发活动增加。据推测,这是由于第4层抑制驱动力降低所致(Maffei等人,2004年). 我们的研究结果支持这一观点。
本研究结果也与有关孤立皮层神经元GABA能传递减少的报道相一致。例如,在培养的视皮层神经元中,河豚毒素诱导的活动阻断触发了小型IPSC振幅的下降,即表达GABAβ亚单位的突触后位点的数量A类受体和开放氯离子通道的数量(Kilman等人,2002年). 在年龄相关性听力损失的成人模型中,抑制减弱与GABA受体功能、亚单位组成以及突触前GAD和GABA水平的变化有关(Caspary等人,1990年,1995,1999). 因此,所有这些研究,包括我们的研究,都表明GABA突触的变化涉及跨突触前和突触后位点的协同变化。
未来发展方向
我们在SNHL ACx突触前和突触后位点发现的差异可能会持续到成年,也可能反映出听觉开始前ACx内出现的GABA能突触的不成熟特征。未来研究跨多个年龄段的GABA能突触的化学和超微结构特征应该能够解决这些问题。