生物化学杂志。2007年9月15日；406（第3部分）：407–414。
双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）抑制大鼠肾脏型谷氨酰胺酶的新机制
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玛丽·M·。罗宾逊
*科罗拉多州立大学生物化学和分子生物学系，美国科罗拉多州科林斯堡80523-1870。
史蒂文·J。麦克布莱恩特
*科罗拉多州立大学生物化学和分子生物学系，美国科罗拉多州柯林斯堡80523-1870。
冢本隆
†MGI制药公司，地址：6611 Tributary Street，Baltimore，MD 21224，U.S.A。
卡米洛·罗哈斯
†MGI Pharma Inc.，美国马里兰州巴尔的摩市支流街6611号，邮编21224。
达纳五世。法拉利（Ferraris）
†MGI Pharma Inc.，美国马里兰州巴尔的摩市支流街6611号，邮编21224。
肖恩·K。汉密尔顿
†MGI Pharma Inc.，美国马里兰州巴尔的摩市支流街6611号，邮编21224。
杰弗里·C。汉森
*科罗拉多州立大学生物化学和分子生物学系，美国科罗拉多州柯林斯堡80523-1870。
诺曼·P·。柯特霍斯
*科罗拉多州立大学生物化学和分子生物学系，美国科罗拉多州柯林斯堡80523-1870。
*科罗拉多州立大学生物化学和分子生物学系，美国科罗拉多州柯林斯堡80523-1870。
†MGI Pharma Inc.，美国马里兰州巴尔的摩市支流街6611号，邮编21224。
2007年1月4日收到；2007年6月20日修订；2007年6月21日接受。
摘要
急性缺血或慢性神经退行性疾病期间神经元释放GA（线粒体谷氨酰胺酶）可能有助于谷氨酸兴奋性毒性的传播。因此，选择性地使释放的GA失活的抑制剂可以限制过量谷氨酸的积累，并将伴随脑损伤的神经功能损失降至最低。本研究探讨了小分子抑制剂BPTES[双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫化物]对大鼠KGA（肾GA亚型）失活的机制。BPTES是一种有效的KGA抑制剂，但不是肝脏GA亚型、谷氨酸脱氢酶或γ-谷氨酰转肽酶的抑制剂。动力学研究表明，关于谷氨酰胺，BPTES具有K（K）我约3μM。此外，这些研究表明，BPTES抑制由磷酸结合引起的变构活化，并促进形成非活性复合物。采用凝胶过滤色谱法和沉降速度分析法研究了BPTES对磷酸依赖性KGA齐聚反应的影响。这表明，BPTES可防止形成大的磷酸盐诱导的低聚物，而促进形成具有不同物理性质的单一低聚物物种。沉积平衡研究确定，BPTES产生的低聚物是一种稳定的四聚体。总之，目前的工作表明，BPTES是一种独特而有效的大鼠KGA抑制剂，并阐明了一种新的失活机制。
关键词：双-2-（5-苯基乙酰胺-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）；谷氨酸兴奋毒性；谷氨酰胺酶抑制剂
缩写：BPTES，双-2-（5-苯基乙酰胺-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚；CK公司，L（左）-2-氨基-4-氧代-5-氯戊酸；DON，6-重氮-5-氧代-L（左）-去甲亮氨酸；DTT，二硫苏糖醇；线粒体谷氨酰胺酶；GAC，肾脏谷氨酰胺酶变体；KGA，肾脏GA同种型；LGA、肝GA亚型；rKGA公司Δ1，大鼠KGA的重组N末端截断
简介
GA（线粒体谷氨酰胺酶）催化谷氨酰胺的水解裂解，形成谷氨酸和铵离子。哺乳动物表达三种GA亚型，由两种不同但结构相关的基因编码[1,2]. 在人类中，肝型GA基因在12号染色体上跨越18 kb，由18个外显子组成[三,4]. kidney型GA基因在第2染色体上跨越82 kb，包含19个外显子，并通过选择性剪接产生两种亚型；KGA（肾脏GA亚型）和GAC（肾脏谷氨酰胺酶变体）[4,5]. KGA亚型在肾、脑、肠、免疫系统细胞和许多转化细胞中大量表达，而GAC在心脏、胰腺、胎盘和肺中表达[5]. KGA和GAC亚型共享从外显子1-14转录的相同N端氨基酸序列，但具有不同的C端区域。GAC中的C末端氨基酸序列源自外显子15，而KGA C末端序列源自外显子16-19。KGA和GAC的共同N末端区域与LGA（肝GA亚型）的N末端区域有很大不同，表明催化结构域位于蛋白质的中心区域。KGA特定N端和C端区域的缺失对酶活性没有影响的证明证实了这一假设[6].
在大脑中，KGA的表达对于产生和清除兴奋性神经递质谷氨酸的细胞间循环非常重要[7]. 作为对神经冲动的反应，谷氨酸从分泌小泡释放到突触空间。神经刺激是短暂的，因为神经胶质细胞快速有效地吸收谷氨酸，通过谷氨酰胺合成酶将谷氨酸转化为谷氨酰胺。然后，神经胶质细胞释放谷氨酰胺，谷氨酰胺被神经元吸收并运输到线粒体，在线粒体中被KGA重新转化为谷氨酸。谷氨酸到谷氨酰胺的循环对于维持细胞外谷氨酸的极低浓度（μM）至关重要，因为谷氨酸的过度积累会导致神经细胞死亡。大量证据表明，兴奋性毒性有助于缺氧缺血、创伤或慢性神经退行性疾病引起的神经元损伤的病理生理学[8–11]. 神经元损伤后，受损神经元会立即释放谷氨酸。随后细胞外谷氨酸二次增加更为明显[12]. 谷氨酸水平延迟升高会导致渐进性神经元死亡，从而加剧原发性神经元损伤，脑损伤后这种情况可能会持续数小时或数天[13]. 与这一观察结果一致，研究表明，谷氨酸受体拮抗剂具有神经保护作用，即使在局部或全身缺血后的几个小时内施用[14,15].
GA是已知的唯一能将谷氨酰胺水解为谷氨酸的脑酶[16]. 对培养神经元的研究表明，受损神经元线粒体KGA的释放有助于细胞外谷氨酸的延迟增加和兴奋毒性的放大[17]. 其他研究表明，脑损伤后，大脑外周区域保持高水平的KGA活性，可能会导致神经元损伤区域扩大，持续24-48小时[18]. 因此，KGA从被破坏的神经元中逐渐释放可能是谷氨酸延迟增加的潜在原因。这些研究还表明，药物灭活释放的KGA可能会限制与脑损伤相关的渐进性神经元损伤，并防止广泛的残疾和死亡。
KGA的一个独特催化性能是能被磷酸盐和其他多价阴离子有效活化[19]. 这个K（K）米因为谷氨酰胺随着磷酸盐浓度的增加而减少，磷酸盐活化的程度与非活性KGA二聚体与活性四聚体或较大低聚物的结合有关[20,21]. 这表明磷酸或其他二价阴离子的变构调节对KGA活性的调节至关重要。此外，谷氨酸逆转酶的激活，并使KGA四聚体的形成程度成比例地降低。同样，高盐对四聚体结构的破坏与催化活性的降低有关[20]. 此外，已知KGA抑制剂DON（6-重氮-5-氧代）的功效-L（左）-去甲亮氨酸）和CK(L（左）-2-氨基-4-氧代-5-氯戊酸）也依赖于磷酸盐。具体而言，DON在高浓度磷酸盐下更有效地灭活KGA[22]而高磷酸盐浓度会降低CK的失活率[23].
在本研究中，进行了动力学和生物物理分析，以表征BPTES[双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚]对KGA的灭活机制。BPTES是从谷氨酰胺酶有效抑制剂的化合物库中筛选出来的[24]. 与其他已知的KGA抑制剂（亲和标记试剂或底物类似物）相比，BPTES的结构与谷氨酰胺的结构有很大不同(). 结果数据表明，BPTES是一种特异而有效的抑制剂，能够形成稳定但不活泼的四聚体。
材料和方法
材料
Sprague-Dawley大鼠取自Charles River。牛肝谷氨酸脱氢酶和所有其他生化试剂均来自Sigma。使用前，使用0.22μm孔径过滤器过滤色谱和分析超速离心缓冲液。根据上述方法合成BPTES[24].
蛋白质提取和纯化
如前所述溶解大鼠KGA[25]. 简单地说，肾脏线粒体是在10000℃离心制备的克在4°C下保持10分钟，并在添加10 mM硼酸钠、100 mM磷酸钾和100 mM焦磷酸钾缓冲液（pH 8.4）后冷冻干燥。将冻干颗粒重新悬浮在水中，以100000的速度离心克在4°C下透析30分钟，然后在含有300 mM KCl、2 mM DTT（二硫苏糖醇）和10 mM Tris/HCl（pH 8.0）的缓冲液中透析。线粒体后上清液用于测量γ-谷氨酰转肽酶活性[26]. 通过反复超声分离的大鼠肝线粒体溶解大鼠肝型谷氨酰胺酶，并按前述方法进行分析[27]. 通过测定纯化的谷氨酸脱氢酶A类340跟踪α-酮戊二酸还原胺化过程中NADH的消失。
rKGA公司Δ1（大鼠KGA的重组N末端截短），如前所述进行表达和纯化[6]进行了以下修改。为了增加可溶性蛋白的表达，rKGAΔ1以表示大肠杆菌菌株BL-21 DE3 Codon Plus RIPL细胞（Stratagene）。转化细胞的培养物在37°C下培养，直到稀释(D类600)达到0.4–0.6。通过添加2.5 g/升的“诱导剂”（IPTG（异丙基β-D类-硫代半乳糖苷）类似物（分子研究实验室）。诱导培养物在25°C下生长4小时后收获。伊斯6-标记的rKGAΔ1使用AKTA FPLC系统（Amersham Biosciences）通过两个色谱步骤纯化。首先将清除的细胞裂解物装载到含有固定化Ni的HiTrap螯合柱（Amersham Biosciences）上2+在含有10 mM Tris/HCl、pH 8.0、300 mM KCl和10%（v/v）甘油的缓冲液中，使用咪唑线性梯度（20 mM–1 M）洗脱蛋白质。含有rKGA的馏分（0.5ml）Δ1在200至300 mM咪唑洗脱的，在加载到HiTrap Q柱（Amersham Biosciences）之前，在柱洗脱缓冲液中混合并稀释为1:10，该柱在含有10 mM Tris/HCl、pH 8.0、10%（v/v）甘油和2 mM DTT的缓冲液中平衡。使用KCl（30 mM–1 M）的线性梯度洗脱纯化蛋白，并将蛋白样品在4°C下保存在含有10 mM Tris/HCl、pH 8.0、300 mM KCl、10%（v/v）甘油和2 mM DTT的缓冲液中，最长保存3周。
动力学分析
如前所述，使用两步分析法测量KGA活性[6,28]. 为了便于收集多个数据点，通过将试剂体积按比例减少到227μl的最终反应体积，将该分析调整为微量分析格式。通常，5μl rKGAΔ1添加到20μl初始分析混合物中（20 mM谷氨酰胺、150 mM磷酸钾、0.2 mM EDTA和50 mM Tris/醋酸盐，pH 8.6）。样品在37°C下培养10分钟，并通过添加2μl 3 M HCl停止反应。接下来，200μl第二反应混合物（0.4 mg/ml纯化牛肝谷氨酸脱氢酶、80 mM Tris/醋酸盐、pH 9.4、200 mM肼、2.5 mM ADP和0.2 mM NAD+)已添加。将样品混合并在室温（22°C）下培养40分钟。这个A类340用Wallac Victor测量三V板阅读器（PerkinElmer），配备340 nm激发滤波器。在空白样品上测量样品吸光度，在空白样品中，在添加rKGA之前，向第一个反应混合物中添加HClΔ1必要的对照确定，两步分析与时间呈线性关系，谷氨酸在本研究测量的范围内定量转化为等量的NADH。通过测量rKGA的活性进行谷氨酰胺饱和曲线Δ1在0、1和5μM BPTES存在的情况下，谷氨酰胺浓度范围（2-40 mM）。对于在存在BPTES的情况下进行的分析，将适当体积的溶于DMSO中的10 mM BPTES储备添加到谷氨酰胺反应混合物中。含有等量二甲基亚砜的对照样品证实二甲基亚磺酸对酶活性没有影响。在每个谷氨酰胺浓度下，对样品进行一式四份的活性分析。动力学常数K（K）米和V（V）最大值使用KaleidaGraph软件（Synergy software）确定适用于Michaelis–Menten方程所有数据点的非线性最小二乘法。这个K（K）我使用GraphPad Prism软件（E.M.Shepard博士和D.M.Dooley博士，蒙大拿州立大学化学和生物化学系，Bozeman，MT，U.S.A.）确定BPTES，以对非竞争性抑制的方程进行数据的全局非线性最小二乘拟合：
式中，[Gln]是底物浓度，[I]是抑制剂浓度，以及K（K）我是抑制剂与酶和酶-底物复合物结合的离解常数。通过测量rKGA的活性来进行磷酸盐活化曲线Δ1在存在0、1和3μM BPTES的情况下，超过磷酸盐浓度范围（0-200 mM）。在每种磷酸盐浓度下对样品进行三次分析。动力学常数，K（K）0.5和V（V）最大值和Hill系数是通过使用KaleidaGraph软件对Hill方程的所有数据点进行非线性最小二乘拟合来确定的：
哪里v（v）0/V（V）米是酶与磷酸盐的分数饱和度；[A] 是磷酸盐的浓度；小时是希尔系数K（K）一是半饱和时的离解常数。
凝胶过滤
使用14-ml Bio-Silect®SEC 250-5色谱柱（Bio-Rad实验室）在AKTA FPLC设备上进行凝胶过滤色谱。在含有10 mM Tris/HCl、pH 8.0、100 mM KCl和10%（v/v）甘油的低（10 mM）或高（200 mM）磷酸钾缓冲液中平衡柱。平衡后，20μl 5μM rKGAΔ1在色谱缓冲液中透析后的样品应用于色谱柱，并在4°C下以0.5 ml/min的速度洗脱。使用凝胶过滤校准试剂盒（Amersham Biosciences）校准洗脱样品的保留体积。K（K）av（平均值）测定标准值，并根据分子质量的对数绘制。使用数据线性拟合方程来确定rKGA的表观分子质量Δ1.
分析超速离心
实验在Beckman XL-I型分析超离心机上使用吸光度光学进行。使用两扇形炭填充Epon中心片、石英窗、400μl样品和420μl参考缓冲液收集沉降速度测量值。使用Beckman An60Ti四孔转子在22°C下离心所有样品。使用Demeler、van Holder和Weischet的边界分析方法编辑和分析速度数据[29]生成Ultrascan 7.1版中实现的G（s）图。由于最高和最低吸光度下的实验噪声，顶部和底部5%的数据被排除在分析之外。所有沉降系数(秒20，宽)校正为20°C下的水。使用Ultrascan程序对流体动力学参数进行建模（f）/（f）0用于计算感兴趣粒子的摩擦系数与完美球体的摩擦系数之比。沉积平衡实验在5°C下使用四孔转子和六扇形碳填充Epon中心件进行。为了跨越广泛的加载浓度范围（0.87–10.3μM），同时保持在检测器的线性范围内，在A类228=0.21、0.46和0.63以及A类280=0.25和0.42。含有100μl rKGA的样品Δ1以三种不同的速度（11000、14000和19000rev/min）离心110μl参考缓冲液。测量值收集于A类228和A类280以0.001cm的增量采集，在每个径向位置平均15个测量值。以每种速度间隔4小时进行的连续扫描重叠证实样品已达到平衡。在Ultrascan程序中对沉积平衡数据集进行了全局拟合。编辑后，将数据集应用于单理想物种模型、双组分非相互作用模型和单体-二聚体平衡模型。直接比较每个模型的方差可以确认拟合的质量。部分比容(v（v），20°C时为0.7458），并使用Ultrascan程序计算溶剂密度（ρ）。
结果
动力学研究
表征BPTES抑制特异性的初步实验()使用大鼠肾线粒体和肝线粒体的可溶性提取物进行。添加10μM BPTES导致KGA活性抑制80%，但LGA活性仅降低15%(). 此外，BPTES对谷氨酸脱氢酶活性没有影响，只对γ-谷氨酰转肽酶活性产生极轻微的抑制。截断GA导数rKGAΔ1缺少第一外显子编码的序列，作为KGA的来源，以研究BPTES抑制机制。纯化rKGA的动力学性质Δ1含有N-末端His的蛋白质6标签与天然全长酶的标签非常相似[6]. 为了确定BPTES引起的抑制类型，使用抑制剂的1和5μM浓度测定谷氨酰胺饱和曲线。得到的谷氨酰胺饱和度曲线为双曲线(A） ●●●●。根据之前的研究[6]，的K（K）米在没有BPTES的情况下，谷氨酰胺的含量为15 mM。添加BPTES后，表观V（V）最大值但对K（K）米，表示非竞争性抑制。存在BPTES时谷氨酰胺饱和度数据的线性双倒数图清楚地表明，BPTES相对于谷氨酰胺而言不是一种竞争性抑制剂(B） ●●●●。当抑制剂与不同于底物结合位点的位点结合并导致催化活性降低时，就会发生非竞争性抑制。对于经典的非竞争性抑制剂，双倒数图上的线将在1/[S]轴上截取。BPTES数据双倒数图上的线截距略低于此轴。因此，目前的数据无法区分经典的非竞争抑制和混合的非竞争性抑制。然而，要估计K（K）我对于BPTES抑制，使用GraphPad非线性最小二乘分析对非竞争性抑制方程的所有数据进行全局拟合。该分析产生了一个K（K）我2.9±0.3μM。
BPTES抑制的特异性在存在和不存在10μM BPTES的情况下，测定KGA、LGA、谷氨酰脱氢酶（GDH）和γ-谷氨酰转肽酶（gGTP）的活性。分析一式三份，结果表示剩余活性百分比±S的平均值。D。
关于谷氨酰胺的BPTES抑制(A类)rKGA的谷氨酰胺饱和度曲线Δ1在没有（●）或存在1μM（■）或5μM（▲）BPTES的情况下。酶活性根据谷氨酰胺浓度绘制为μmol/min/ml。饱和度剖面表示拟合Michaelis–Menten方程的非线性最小二乘。误差条表示每种谷氨酰胺浓度下四次活性测量的标准误差。(B类)rKGA谷氨酰胺饱和度曲线的Lineweaver–Burk双倒易表示Δ1在没有（●）或存在1μM（■）或5μM（▲）BPTES的情况下。线表示在每个谷氨酰胺浓度下测得的平均活性的线性最小二乘拟合。
一种潜在的抑制机制是磷酸阻止变构活化。这可能通过与磷酸结合位点的直接竞争或通过阻止磷酸活化的构象变化来介导。为了评估BPTES的效果，测定了在没有和存在1或3μM BPTES时的磷酸盐活化曲线。所有的磷酸盐活化曲线都是S形的，表明BPTES不能阻止磷酸盐诱导的合作性(). 然而，活化曲线表明，BPTES的加入降低了V（V）最大值在没有BPTES的情况下，磷酸盐活化的希尔系数为1.8(). 在3μM抑制剂的存在下，希尔系数略有增加。动力学常数的推导值证实了V（V）最大值，并表示BPTES可能会增加K（K）0.5对于磷酸盐。综上所述，数据表明BPTES不与磷酸盐竞争，而是通过促进形成对磷酸盐亲和力降低的非活性复合物来干扰磷酸盐的变构活化。因此，BPTES对磷酸盐也起非竞争性抑制剂的作用。
BPTES对磷酸盐的抑制作用rKGA的磷酸盐活化曲线Δ1在不存在（●）或存在1μM（■）和3μM（▲）BPTES的情况下。插入图是在低磷酸盐浓度下获得的数据的放大。酶活性根据磷酸盐浓度绘制为μmol/min/ml。激活曲线表示数据与希尔方程的非线性最小二乘拟合。误差条代表每种磷酸盐浓度下三次活性测量的S.E.M。
表1
从BPTES对磷酸盐活化的抑制特性得出的动力学常数
| BPTES（μM） | K（K）0.5（百万分之一） | V（V）最大值（μmol/min/ml） | 希尔系数 |
|---|
| 0 | 58±2.3 | 40±0.7 | 1.8±0.1 |
| 1 | 93±9.9 | 30±1.7 | 1.5±0.2 |
| 三 | 88±5.6 | 14±0.5 | 2.5±0.5 |
凝胶过滤色谱法
凝胶过滤实验是表征rKGA低聚物状态的初步方法Δ1.含有5μM rKGA的样品Δ1应用于Bio-Silect SEC凝胶过滤柱。在10 mM磷酸盐存在下，纯化rKGAΔ1主要以单一不对称峰的形式从Bio-Silect SEC中洗脱(A） 相反，在含有200 mM磷酸盐的样品中观察到两个不对称峰(B） 表明高磷酸盐浓度导致rKGA齐聚Δ1当相对于标准蛋白质的洗脱体积进行校准时，这两个峰对应于表观分子量为155和315 kDa的蛋白质，与磷酸盐诱导的二聚反应一致。然而，在含有10μM BPTES的10和200 mM磷酸盐缓冲液中，rKGAΔ1以表观分子量分别为337和315kDa的单一不对称峰洗脱。结果表明，BPTES可以稳定rKGA的一种独特寡聚形式Δ1这与存在的磷酸盐浓度无关。先前的数据表明，天然谷氨酰胺酶是不对称的，因此从凝胶过滤数据中得出分子量的异常估计[20]. 因此，对rKGA的低聚状态进行了更准确的评估Δ1采用分析超速离心法测定。
rKGA凝胶过滤剖面Δ1无论是否有BPTES如图所示，25μl rKGA样品Δ1在没有（折线）或存在10μM BPTES（连续线）的情况下，将其注射到与含有10 mM缓冲液平衡的Bio-Silect柱上(A类)或200 mM磷酸盐(B类). 蛋白质洗脱在A类230.
分析超速离心
rKGA的内在自联想性质Δ1最初通过在含有10 mM磷酸盐的缓冲液中进行沉降速度分析进行表征。rKGA的三种浓度Δ1，范围为0.8至15μM。使用Demeler、van Holder和Weischet的边界分析方法分析边界[29]以获得扩散校正的沉积效率分布。0.8μM rKGA时Δ1，大于rKGA的80%Δ1沉积为均匀的6S物种(A） ●●●●。在2.5μM rKGA下Δ1沉降系数分布范围为6～7.5S，具有自结合体系的形状特征[30]. 在15μM rKGA下Δ1，大多数样品沉积为均匀的7.7S物种。这些结果表明，在低磷酸盐缓冲液中，在没有抑制剂的情况下，rKGAΔ1存在于6S和7.7S低聚物状态之间的浓度依赖平衡中。使用Lamm方程的有限解来获得6个和7.7个S物种的分子质量的尝试是没有结果的。rKGA的沉积平衡Δ1也被证明是不确定的，这是由于随着实验的进行样品造粒（结果未显示）。沉积数据与广泛的非对称凝胶过滤剖面一致，并确定内在rKGAΔ1自结合途径最少涉及6和7.7S结构状态，可能还涉及高阶低聚物。
rKGA的沉降速度分析Δ1数据以积分分布的G（s）图表示秒20，宽相对于边界分数（%）。(A类)使用0.8、2.5和15μM rKGA进行浓度依赖性分析Δ1在10 mM磷酸盐存在下。(B类)使用2.5μM rKGA进行磷依赖性分析Δ1样品放在含有0、50或200 mM磷酸盐的缓冲液中。
测定磷酸盐对rKGA的影响Δ1自缔合，含有2.5μM酶和0、50或200 mM磷酸盐的样品通过沉降速度分析进行分析(B） ●●●●。0 mM磷酸盐样品的主要分布为6 S。在50和200 mM磷酸盐缓冲液存在下获得的沉积效率分布转移到更高秒20，周值和为双相，在～8S处出现明显断裂。在50 mM磷酸盐中，约30%的酶在8-14 S之间沉淀，而剩余的酶在6.0-7.7 S之间沉淀。在200 mM磷酸盐缓冲液中，约40%的样品在8–17 S之间沉淀，而其余样品在6.0–7.7 S之间沉淀。对0、50和200 mM磷酸盐沉淀速度实验中6.0–7.7 S物质的比较表明，随着磷酸盐浓度的增加，分布略微向7.7 S物种转移。因此（B） 表明磷酸盐的存在改变了固有的6.0–7.7 S结合途径，并诱导高阶rKGA的形成Δ1低聚物。
沉积速度也用于表征BPTES对rKGA的影响Δ1自结合(A） ●●●●。rKGA公司Δ1在10或200 mM磷酸盐存在下用10μM BPTES培养。沉积效率分布表明，BPTES在10 mM磷酸盐中诱导形成单一9.2±0.3 S物种，在200 mM磷酸盐上诱导形成单一8.5±0.2 S物种。8.5S和9.2S物种是同一低聚物的两种构象，仅在摩擦系数上有所不同。添加实验的顺序，其中将BPTES添加到rKGA中Δ1在添加200 mM磷酸盐之前或之后，产生相同的均匀8.5 S物种（结果未显示）。数据还表明，BPTES抑制高阶rKGA的形成Δ1磷酸低聚物。在BPTES在场的情况下，rKGAΔ1形成单一的非相互作用的流体动力学结构。
rKGA的解析超速离心分析Δ1存在10μM BPTES(A类)2.5μM rKGA的沉降速度分析Δ1在含有10或200 mM磷酸盐的缓冲液中存在10μM BPTES。(B类)在三种加载浓度和多种速度下对12次扫描进行沉积平衡分析，并将其拟合到单组分非相互作用理想模型中。左侧面板包含从rKGA分析中获得的数据Δ1在10 mM磷酸盐中，右侧面板是在200 mM磷酸盐缓冲液中获得的数据。覆盖显示在每个面板的底部，拟合的剩余图显示在每个板的顶部。单组分非相互作用理想物种模型的拟合方差为3.6×10−5和6.5×10−5分别是。光密度等于衰减(D类).
为了测定8.5和9.2 S物种的分子质量，五种不同浓度的rKGAΔ1，在存在10 mM磷酸盐和BPTES以及四种不同浓度的rKGA的情况下Δ1在200 mM磷酸盐和BPTES存在下，以三种不同速度离心至平衡。在沉积速度实验的基础上，将所得数据集全局拟合到单个理想组分的模型中。拟合质量由方差和残差随机性的组合来判断(B） ●●●●。根据单一理想组分模型进行拟合，得出10和200 mM磷酸盐中的分子量分别为239和241 kDa。在这两种情况下，残差都是随机的，方差很低（3.6×10−5和6.5×10−5分别）。相互作用系统与其他模型的拟合并没有降低方差；因此，数据最准确地描述为单一理想成分模型。rKGA的单体分子质量Δ1为60.5kDa。因此，在BPTES存在的情况下观察到的8.5和9.2 S物种为rKGAΔ1四聚体（242 kDa）。
讨论
这些结果为rKGA的齐聚反应提供了新的见解Δ1及其与BPTES作用机制的关系。动力学抑制数据分析表明，BPTES是一种非竞争性抑制剂。非竞争性抑制表明，抑制剂与游离酶和酶-底物复合物结合。在没有谷氨酰胺的情况下进行的生物物理研究证实，BPTES在没有底物的情况下结合。这个K（K）我从抑制数据与非竞争性抑制模型的全局拟合中获得的3μM值表明，BPTES对游离酶和酶-底物复合物都具有很高的亲和力。
在没有磷酸盐和抑制剂的情况下，rKGAΔ1存在于6.0和7.7S状态之间的平衡状态。即使是60.5kDa单体最紧密的构象也不会在6.0S下沉淀。因此，6.0S物种要么是二聚体（f）/（f）01.5或三聚体（f）/（f）0第1.9页。考虑到6.0S物种自缔合形成7.7S物种，并且没有rKGAΔ1存在单体(A） ，对数据的最简单解释是6.0S物种是rKGAΔ1二聚体和7.7S物种是四聚体。中的数据（B） 证明在低蛋白浓度下，磷酸盐的添加将平衡转移到7.7S四聚体，并诱导随后形成更高阶（>15S）低聚物。重组rKGA的磷酸活化谱Δ1是S形的，带有K（K）0.558 mM，希尔系数为1.8。这些性质与从大鼠肾脏纯化的KGA的磷酸化活化特性非常相似[31]. 因此，rKGA的协同磷酸盐结合和活化Δ1还与7.7S四聚体的形成和高阶（>15S）低聚物的组装有关。
重要的是，发现BPTES抑制高阶低聚物的磷酸依赖性组装。此外(B） 和BPTES-bound rKGAΔ1四聚体(A） 在200mM磷酸盐存在下，分别为7.7S和8.5S，表明天然rKGAΔ1四聚体比BPTES结合的四聚体更致密。因此，动力学和生物物理数据都认为BPTES结合改变了rKGA的构象Δ1使BPTES-结合四聚体不能组装活性高阶rKGA的亚单位Δ1磷酸盐存在下的低聚物。
BPTES失活的主要作用是形成无活性的四聚体，其形成与磷酸盐浓度无关。在低磷酸盐浓度下，BPTES促进二聚体与非活性四聚体的结合。同样，在高磷酸盐浓度下，活性四聚体和rKGA的较大低聚物Δ1都转化为非活性四聚体形式秒20，宽存在10或200 mM磷酸盐浓度时四聚体的值太小，无法反映寡聚状态的差异，这可能是由于计算的（f）/（f）0值分别为1.4和1.5。因此，在BPTES结合的四聚体中添加磷酸盐可能会产生轻微的构象变化。此外，我们的结果表明，一旦形成无活性的四聚体，该配合物就非常稳定。添加顺序实验表明，BPTES比磷酸盐占主导地位，因为磷酸盐的添加不会导致无活性的四聚体恢复为活性酶。此外，BPTES-失活rKGA的沉降特性Δ1当在4°C下储存96小时（进行沉积平衡实验所需的时间）时，不会发生变化。
这表明BPTES具有独特的生化特性，有利于治疗应用。首先，BPTES在抑制KGA方面非常有效K（K）我3μM。该有效抑制剂浓度显著低于其他KGA抑制剂的抑制常数，其在mM范围内[22,23]. 其次，与之前描述的抑制剂相比，BPTES与谷氨酰胺或谷氨酸都没有结构上的相似性，因此不太可能与转运体、受体或其他识别谷氨酸或谷氨酸为底物的酶相互作用。这一结论得到了先前研究的支持，这些研究测试了添加BPTES对培养的肠上皮细胞和神经元细胞的影响[24]. 添加300 nM BPTES可选择性降低细胞内谷氨酸，而添加高达10μM的BPTES对其他氨基酸或核苷酸的细胞含量没有影响。第三，本研究表明，BPTES与酶和酶-底物复合物的结合具有高度的特异性，需要确定的相互作用表面或构象。LGA观察到的部分抑制表明，该结合位点可能至少在肝脏亚型中部分保守，该亚型包含123个氨基酸，与KGA中相应片段的同源性为80%[32]. 此外，BPTES的有效抑制不需要高浓度磷酸盐。本研究的结果表明，BPTES相互作用表面与底物和磷酸盐结合位点都不同。此外，观察到的BPTES对KGA自结合的影响表明，BPTES与二聚体和四聚体形式均可获得的酶的溶剂暴露表面相互作用。总之，BPTES是一种新型且有效的KGA抑制剂，因此是一种设计有效治疗剂的诱人原型，该治疗剂可有效限制与中风或各种脑损伤相关的渐进性神经元损伤。
致谢
我们感谢本部门的Olve Peersen博士和本部门的Robert Woody博士在执行和分析动力学数据方面提供的帮助，以及他们在编写本手稿时提出的有益建议。这项研究的部分支持来自向N.P.C.颁发的NIDDK（国家糖尿病、消化和肾病研究所）拨款（DK-37124）和向T.T.颁发的NINDS（国家神经疾病和中风研究所）SBIR（小企业创新研究）拨款（R43 NS49669）。
工具书类
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