组蛋白的共价修饰在基因表达的表观遗传控制中起着关键作用(1). 组蛋白甲基化发生在赖氨酸和精氨酸的侧链上，在组蛋白H3和H4中最为显著，与转录激活、分化、印迹和X失活有关(2–4). 一般来说，H3-K4、H3-K36和H3-K79的组蛋白甲基化与常染色质和基因激活有关，而H3-K9、H3-K27和H4-K20的组蛋白的甲基化与异染色质和抑制基因有关。赖氨酸可能是单甲基、二甲基或三甲基化的，其修饰程度可能与不同的生物事件有关。在发芽酵母中酿酒酵母组蛋白H3赖氨酸Lys-4、Lys-36和Lys-79分别被组蛋白甲基转移酶Set1、Set2和Dot1甲基化到不同程度(5–8). 虽然这些位点的甲基化被认为是活性转录的标记(9)，它也可能在沉默和DNA损伤反应中发挥关键作用(6,7,10,11).
上述组蛋白甲基转移酶的位点特异性研究已有多年。人们认为组蛋白甲基化是稳定和不可逆的。然而，新的证据表明组蛋白甲基化是动态的(12,13)这表明存在组蛋白去甲基化酶。2004年石的里程碑式发现等. (14)人类胺氧化酶LSD1，第一个明确的组蛋白去甲基化酶，证明组蛋白甲基化确实是可逆的。LSD1脱甲基单甲基化和二甲基化H3-K4或H3-K9(14–16)，其同源物在以下生物体中发现葡萄裂殖酵母哺乳动物。然而，由于氨基氧化脱甲基机制的性质（这需要赖氨酸上的自由孤对电子ε-氮），LSD1不能去甲基化三甲基赖氨酸。因此，很明显，需要另一类组蛋白赖氨酸脱甲基酶。如下文所述，我们假设JmjC结构域蛋白可能是新的组蛋白去甲基化酶。最近，随着新发现的含有人类JmjC的组蛋白去甲基化酶，这一假说得到了实证验证，显然其他研究小组也认同这一假说(17–22).
尽管如此，组蛋白在芽殖酵母中的去甲基化仍知之甚少。特别是，三甲基赖氨酸脱甲基酶仍有待测定。组蛋白赖氨酸甲基化在酿酒酵母并且它不编码LSD1同源物(14)提示必须鉴定酵母组蛋白去甲基化酶。在寻找新的酵母脱甲基酶时，我们假设候选组蛋白脱甲基酶将满足四个特定标准；如下文所述，含有JmjC结构域的蛋白质满足上述每一个要求。（i） 候选人必须能够劈开稳定的N–CH三债券。我们推测Fe2+/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶可能通过氧自由基机制催化组蛋白去甲基化，其中产生不稳定的甲醇胺中间体，然后自发消除甲醛；几个小组独立提出了类似的机制(12,23,24). 重要的是，铁2+/α-酮戊二酸家族蛋白AlkB最近被证明能催化DNA损伤的羟基化和随后的去甲基化1-甲基腺嘌呤和3-甲基胞嘧啶(25,26). 事实上，JmjC畴显示出与Fe的结构相似性2+/α-酮戊二酸酶表明它可能能够催化去甲基化(27,28). （ii）候选基因必须影响组蛋白修饰。为了满足这一标准庞贝乳杆菌据报道，JmjC蛋白Msc1和Epe1与组蛋白修饰有关(29,30). （iii）候选人必须参与转录调控，例如基因沉默。与此一致的是，一些含JmjC的蛋白质与肿瘤抑制因子Rb或组蛋白脱乙酰化酶相互作用并调节转录。例如，RBP2、RBP1和Jumonji与Rb相互作用(31,32)和JMJD2A与组蛋白脱乙酰化酶和Rb形成复合物(33). 已知JmjC蛋白SMCX和SMCY参与X失活。此外，JmjC结构域与锌指、PHD、，5ARID或TUDOR结构域，都是参与转录的蛋白质相互作用或DNA结合结构域。此外，PHD和Tudor结构域被证明是甲基化组蛋白结合结构域(34–36). （iv）考虑到组蛋白甲基化的保守性，候选组蛋白去甲基化酶应在所有真核生物中保存，从酿酒酵母JmjC结构域蛋白也是如此。
在此，我们通过证明五种含有JmjC的蛋白质中的四种由酿酒酵母影响组蛋白甲基化水平体内五种酵母蛋白分别为：Ecm5（YMR176W）、Gis1（YDR096W）、Rph1（YER169W）、Jhd1（YER 051W）和Jhd2（YJR119C）(). YJR119C基因产物命名为Jhd2(Jmjc域包含小时活塞d日去甲基化酶2命名为Jhd1）。在这里，我们使用了蛋白质组学MS技术，该技术已成功用于单个酵母组蛋白甲基转移酶的先前研究(8,37). 我们系统分析了野生型（WT）和五株酵母组蛋白去甲基化酶候选敲除菌株中的全局（整体模式）和位点特异性组蛋白H3甲基化。甲基化模式的变化使我们预测Rph1、Jhd1、Gis1和Jhd2是组蛋白去甲基化酶。随后的过表达数据是对缺失数据的补充。尤其是过度表达RPH1型和金华D2组蛋白H3-K36me3和H3-K4me3水平分别显著降低。体外酶活性测定表明，Rph1去甲基化组蛋白H3-K36me3为主，H3-K365me2次之。RPH1型过表达菌株对紫外线辐射损伤敏感。此外，其组蛋白H3-K36me3脱甲基酶活性与表型有关。Rph1和Jhd1可能参与转录延伸。
五种JmjC结构域蛋白酿酒酵母A类，域结构。这些图表来自SMART数据库。每个蛋白质名称后面都跟有基因的开放阅读框名称。采埃孚表示锌指结构域。B类，核心β-五种酵母JmjC蛋白的片状序列比对。预测β-板材序列用字母表示b条并以突出显示粗体斜体字母.预测的协同因子Fe2+结合位点如所示红色和预测α-酮戊二酸结合位点蓝色.
实验程序
酵母菌株和质粒
酿酒酵母本研究选用BY4743作为WT酵母菌株(38). 纯合子二倍体敲除菌株ECM5、JHD1、GIS1、RPH1、和金华D2在BY4743中，从酵母菌属基因组删除项目(39). 这个JHD1、RPH1、和金华D2通过转化BY4743和镀锌1携带每个基因编码序列的启动子衍生表达载体（BG1805）(40); 在MS研究中，通过定点突变将一个终止密码子插入每个基因的3′端（以实现无C末端标记的蛋白质表达）。用缺乏插入基因的BG1805载体转化的BY4743被用作过度表达研究中的WT菌株。对于对照点分析转速1缺失菌株(转速1Δ）用不含插入物的质粒转化（仅载体BG1805），用野生型的BG1805转化RPH1型插入，或带有活性缺陷突变体的BG1805(转速1H235A型)分别插入。全部酿酒酵母菌株和未经修饰的基于BG1805的表达载体是从Open Biosystems获得的。
文化成长与媒体
在基因敲除研究中，将10 ml YPD培养物接种到一个新的条纹单菌落中。培养物在30°C和200 rpm下培养9小时，然后稀释成100 ml YPD培养物。继续生长，直到培养物达到对数晚期/稳定期（A6001.7–1.9）。通过5500×离心收集细胞用于组蛋白提取克通过接种20 ml含有2%葡萄糖的SC-乌拉西尔培养基培养10 min，并在30°C和200 rpm下培养9 h，培养出高表达菌株。然后将20 ml起始培养基中的等分样品稀释成200 ml含有2%蔗糖的SC-乌拉西尔，得到初始A6000.02。孵化一直持续到A600达到1.0–1.2。细胞通过4000×离心进行造粒克5分钟后，将其重新悬浮在含有2%半乳糖的200 ml SC-uracil中。细胞在诱导条件下生长4小时，并如前所述收获。
组蛋白提取和质谱分析
组蛋白按照描述进行纯化(41). 组蛋白H3在16.5%Tris-Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝胶上从其他组蛋白中分离。胰蛋白酶凝胶内消化、液相色谱-质谱（LC-MS）、纳米LC-MS/MS和MADLI-TOF MS程序改编自之前的工作(42). 在LTQ-FTICR质谱仪（热电）上进行了高分辨率LC-MS/MS实验。通过计算MALDI-TOF质谱中的峰面积来定量Lys-4亚型，而通过分析纳米LC-MS/MS光谱中的前体离子来定量Lys-36和Lys-79亚型。报告值代表四次试验的平均值。
体外活性测定
为了获得Rph1的GST融合蛋白，酵母基因组DNA被扩增并亚克隆到pGEX6p2载体中，以构建GST-Rph1-（1–373），其JmjC结构域位于C末端。将质粒转化为BL21-CodonPlus（DE3）-RIL细胞进行过度表达。在25°C和0.5mM异丙基-1-硫代物下诱导细胞-β-D-吡喃半乳糖苷8小时。用谷胱甘肽-葡萄糖珠（Sigma）纯化蛋白质，然后透析到HEPES缓冲液中（30 mM HEPES，pH 7.5和1 mMβ-巯基乙醇）。使用类似程序以GST融合形式生成重组Gis1、Jhd2和Ecm5 JmjC结构域。使用Stratagene QuikChange系统获得GST-Rph1-（1–373）H235A突变质粒。全长His6-标记的重组蛋白Rph1、Jhd1和Jhd2（在pET28a载体中）在大肠杆菌并用镍-次氮基三乙酸树脂纯化。为了从酵母中纯化全长蛋白，通过液氮法裂解来自1升SC尿嘧啶培养物的细胞，并用镍次氮基三乙酸树脂纯化。
用于分析的H3-K4、-K36和-K79肽序列为ARTK（me1-3）QTARKST、STGGVK（me1-3）KPHRY和IAQDFK（me1–3）TDLRFQ。在以下分析中，所有试剂都是新制的。分析缓冲液由30 mM HEPES（pH 7.5）、5 mM抗坏血酸、1 mM二硫苏糖醇、1 mMα-酮戊二酸和100μM（NH4)2铁（硫）4)26小时2O.在典型分析中，20μg蛋白质与0.5孵育μl of 5 mM肽/60μl分析缓冲液在37°C下放置30分钟至2小时。通过添加1μl 100 mM EDTA。1μ然后用5稀释l反应混合物μ饱和矩阵解的l(α-氰基-4-羟基肉桂酸）在50%乙腈/0.1%三氟乙酸/50%H中2O、 并对样品进行MADLI-TOF MS分析。
生长表型分析
细胞生长至中对数期（A6000.5–1.0). 五μ每种培养物的5倍或10倍系列稀释液中的1份进行电镀。对于UV辐照分析，YP板受到UV辐照（Stratalinker UV Crosslinker，Stratagene）。对于6-氮杂嘧啶（6-AU）敏感性分析，SC-U菌板补充30μg/ml 6-AU。细胞在30°C下生长2-5天后拍摄平板照片。
结果
JmjC基因敲除株组蛋白H3修饰的整体变化
我们首先通过LC-MS研究了组蛋白H3在WT和缺失菌株中的整体修饰。显示了WT菌株组蛋白H3的典型质谱。15225Da处的峰值对应于未修饰组蛋白H3；随后的17个修饰物种以14Da的间隔分开。虽然这一系列峰可以代表甲基化的增量，但乙酰化也可以引起42Da（3×14）的位移。在乙酰化和甲基化之间的模糊性被澄清之前，将使用“甲基化当量”来描述这些峰之间的质量差异。
JmjC基因敲除株组蛋白H3甲基化的整体变化A类WT H3的典型LC-MS光谱。最高峰值有六个甲基化当量。B、，条形图显示敲除菌株中每个峰值相对于WT的“相对百分比变化”。对于给定的峰值(我)，使用以下方程式计算相对百分比变化：100×[percentage（突变体，我)−百分比（WT，我)]/百分比（WT，我).
为了解决五个突变体组蛋白H3修饰的变化，分析了每个峰的相对百分比变化。首先，计算给定光谱中每个峰的百分比，以反映样品中该物种的丰度。然后将该百分比与WT菌株中的对应百分比进行比较，以产生相对百分比变化。如所示组蛋白H3修饰模式发生了一致的改变。相对于WT，除了电子控制模块5Δ，每个敲除菌株的组蛋白H3物种中甲基化当量少于6个，显示出可识别且可重复的减少。相反，每个敲除菌株的组蛋白H3种类增加，甲基化当量为6-17。这些结果表明，高度修饰的组蛋白在敲除菌株中积累。
仔细分析后提供了关于JmjC蛋白底物特异性的线索。变化的幅度遵循顺序转速1Δ >jhd1型Δ ≥jhd2型Δ >gis1Δ. 此外，组蛋白H3修饰模式的改变转速1Δ和jhd2型Δ菌株相似；那些jhd1型Δ和gis1Δ也相似。这些差异令人感兴趣，而且可能具有重大意义。关注7-15甲基化当量的数据转速1Δ和jhd2型Δ菌株显示了9、12和15甲基化当量的显著积累，而jhd1型Δ和gis1Δ应变没有显示这种模式。如果三甲基化是甲基化的主要状态（事实上，如下文所述），那么合理的解释是Rph1和Jhd2是三甲基赖氨酸脱甲基酶，而Gis1和Jhd1可能是单甲基或二甲基赖氨酸脱甲基酶。这是我们从这一点开始的工作假设。
为了验证上述假设，进行了以下实验：（i）对WT组蛋白H3和5个敲除突变体进行胰蛋白酶消化；（ii）使用高分辨率LTQ-FTICR分析消化样品，以识别含有甲基化赖氨酸的片段，并将三甲基化片段与相应的乙酰化片段区分开来；以及（iii）分析每个片段的未修饰、单甲基、二甲基和三甲基物种的相对丰度。
酿酒酵母组蛋白甲基化模式的高分辨质谱分析
为了破译我们之前描述为“甲基化等价物”的H3修饰的化学特性，我们使用了消化肽的高分辨率质谱。基于乙酰化肽和三甲基化肽（在同一赖氨酸上）具有不同的质量（相差0.0364 Da）这一事实，对三甲基化肽类（H3-K4me3、H3-K36me3和H3-K79me3）和乙酰化肽类（H3-K9ac、H3-K14ac、H-K18ac、H1-K23ac、H2-K27ac和H3-K56ac）进行了明确的分配。数据表明H3-K4、-K36和-K79完全甲基化。结果与酵母组蛋白修饰模式一致(43).
敲除菌株特定位点甲基化水平的变化
在明确的甲基化分配后，通过LC-MS/MS或MALDI-TOF MS对组蛋白H3甲基化进行定量分析，以比较WT和五个突变株之间每个甲基化片段的丰度。在所有样品中，H3-K4、-K36和-K79主要以三甲基化形式存在，同时存在不同程度的二甲基化、单甲基化和非甲基化形式。
上述分析的定量结果总结如下。使用t吨测验。虽然总体上变化很小，但主要变化是可重复的和一致的。下面详细分析了五个敲除菌株。
敲除菌株组蛋白H3甲基化的位点特异性定量未修饰、单甲基、二甲基和三甲基肽的相对水平以百分比表示面板A,B类、和C分别表示H3-K4、-K36和-K79。*，第页<0.05; #,第页<0.1.
rph1Δ和jhd2Δ
这个jhd2型Δ菌株的K4me3水平升高，K4me2和K4me水平降低。同样，转速1Δ应变显示K36me3水平较高，K36me2和K36me水平降低。数据支持全球分析的预测，即Rph1和Jhd2是组蛋白三甲基赖氨酸脱甲基酶，进一步表明它们分别以组蛋白H3-K36和-K4为靶点。
gis1Δ和jhd1Δ
这些菌株仅在Lys-36的甲基化水平出现轻微变化(). 相比之下转速1Δ应变gis1Δ和jhd1型Δ菌株显示K36me3水平降低，但二甲基化和单甲基化物种水平增加。因此，我们预测Gis1和Jhd1是H3-K36me或H3-K365me2脱甲基酶。
ecm5Δ
与整体分析结果一致电子控制模块5Δ应变与WT应变相比没有显著差异。我们没有足够的实验证据来断定Ecm5是否是组蛋白去甲基化酶。总之，我们预测五种酵母JmjC蛋白中有四种是组蛋白H3-K4或H3-K36脱甲基酶。
RPH1、JHD1和JHD2高表达菌株甲基化的变化
敲除菌株的一个潜在论点是，由于组蛋白甲基转移酶的冗余或主导作用，甲基化水平的全部影响可能被掩盖。如果可以在相应的过度表达菌株中观察到与敲除菌株的作用互补的效应，这将在给定的酶与其提议的去甲基化位点之间建立更强的联系。因此，我们研究了单个过度表达的后果RPH1、JHD1、，和金华D2Western blot证实JmjC蛋白过度表达(补充图S1). 如所示对过表达菌株组蛋白H3的全球分析表明，低甲基化物种的相对百分比增加，而高甲基化物种则减少。与基因敲除菌株中观察到的模式相比，中的模式相反的方向和更高的幅度，强烈表明这些JmjC蛋白直接参与组蛋白H3甲基化。具体来说，作为表示，在金华D2过度表达菌株，但不在金华D1或RPH1型过表达菌株的三甲基化H3-K4水平降低，但单甲基化H3-K4水平显著升高。这种效果与在jhd2型Δ应变如所示这支持了我们之前的断言，即Jhd2催化H3-K4me3的去甲基化。类似地，在，组蛋白H3-K36me3水平RPH1型过表达菌株减少了一半，这与我们基于敲除数据的预测一致，即Rph1是H3-K36me3去甲基酶。我们注意到组蛋白H3-K36me3水平在金华D2过度表达菌株。可能是金华D2轻度影响组蛋白H3甲基化模式的机制尚待确定。在，类似于组蛋白H3-K79甲基化水平的变化非常轻微。因此，这里没有预测到组蛋白H3-K79去甲基酶。
过表达菌株的MS分析A类，条形图显示了过表达菌株中每个峰值相对于WT的“相对百分比变化”。B类WT和过度表达菌株的全长组蛋白H3 MS谱RPH1型和金华二期C，截短H3（残基22–135）的相应光谱。
过表达菌株组蛋白H3甲基化的位点特异性定量H3-K4、-K36和-K79肽的定量如所示A类,B类、和C分别，*，第页<0.05; #,第页<0.1.
如前所述，在一些组蛋白H3纯化试验中观察到前21个氨基酸的丢失(10). 在前21个氨基酸中酿酒酵母组蛋白H3，唯一可能的甲基化位点是Lys-4。在如果我们观察13072和13114之间的峰值（高度修饰的群体），截断的H3（残基22-135）在WT和金华D2过度表达菌株，表明：（i）金华D2不影响Lys-36或Lys-79甲基化水平；并且（ii）金华D2-15309–15351区域的诱导差异仅是H3-K4脱甲基的结果，这与从jhd2型敲除和过表达的结果如和综上所述，数据表明Jhd2是一种H3-K4me3脱甲基酶。
Rph1的体外酶分析
为了确认是JmjC结构域专门催化组蛋白去甲基化，在体外用重组JmjC蛋白进行检测。为了获得活性酶大肠杆菌纯化并测试截短的JmjC蛋白。当全长重组Rph1、Jhd2和Jhd1在大肠杆菌，其中大多数存在溶解度问题，因此没有进行进一步的分析。当从酵母中过度表达和纯化全长蛋白时，只有Jhd2对Lys-4肽表现出轻微的酶活性。当截短的重组Rph1、Gis1、Jhd2和Ecm5从大肠杆菌经测试，只有Rph1表现出强大的酶活性。在此，我们报告了Rph1酶测定的结果。
含有JmjC结构域的截短Rph1构建物Rph1-（1–373）被过度表达为GST融合蛋白，进行纯化，然后检测脱甲基酶活性。对在Lys-4、Lys-36和Lys-79处含有单甲基、二甲基和三甲基赖氨酸的九个合成肽进行了测试。正如预测的那样，K36me3肽很容易去甲基化为K36me2，后者进一步转化为K36me，但效率较低(). 没有观察到对甲基化Lys-4或Lys-79肽的活性。重要的是，Rph1对K36me3和K36me2的活性因缺铁而被消融2+，省略α-酮戊二酸、添加过量EDTA或用H235A突变株替换WT酶(). 虽然依赖于α-酮戊二酸证实了这是一种共底物，在没有添加铁的情况下观察到的残余活性2+可以用微量铁的存在来解释2+在纯化蛋白样品中。过量EDTA存在时活性完全丧失，表明金属辅因子确实对催化至关重要。基于序列比对的235残基突变()预计会结合铁2+失活的Rph1进一步证实了Rph1的JmjC结构域起催化作用的结论。总之，上述数据明确证明Rph1是一种铁2+/α-对H3-K36me3具有特异性的酮戊二酸依赖性组蛋白赖氨酸去甲基化酶。
体外GST-Rph1-（1-373）的酶分析A类，关于K36me2肽去甲基化的MALDI-TOF MS数据。B、，K36me3肽去甲基化的MS数据。C、，控制实验。固体和开放式列分别表示K36me3和K36me2肽的转化率。列数：1，正常分析；2，不含酶的对照分析；三，无对照分析α-酮戊二酸(α-千克);4，不含铁的对照分析2+;5，EDTA过量的对照分析；6，用Rph1 H235A突变体进行测定。
紫外线照射下RPH1过度表达导致生长缺陷
作为阐明五个酿酒酵母JmjC蛋白是必需的，进行了表型筛选。在正常条件下，在任何单个敲除菌株中均未观察到可辨别的生长表型。然而，当半乳糖用作合成培养基（SC-uracil）中的碳源时RPH1型过度表达菌株显著下降(,右侧面板). 相比之下，在含有葡萄糖的SC-培养基中，这些菌株之间没有差异(,左侧面板). 有趣的是，在富培养基（YP-葡萄糖或YP-半乳糖）中，没有观察到生长缺陷。结果表明RPH1型在合成介质中导致生长缺陷，但在富介质中不会。
组蛋白去甲基化酶基因过表达酵母的生长表型A类，过度表达RPH1型在合成培养基中，SC-乌拉西尔有生长缺陷。细胞在棉籽糖中生长到A类600达到1.0时，将其稀释10倍，并用2%葡萄糖在SC-U培养板上进行标记(左侧面板)或半乳糖(右侧面板).B类，RPH1过表达菌株对紫外线照射的超敏反应。细胞在含有2%葡萄糖的富培养基（YP）中生长(DEX公司)或半乳糖(女孩). 通过在YP-半乳糖平板上连续稀释细胞，然后暴露于紫外线照射（10 mJ/cm2).C，Rph1的组蛋白去甲基化酶活性与细胞对DNA损伤的存活有关。这个转速1缺失菌株(转速1Δ）用不含插入物的质粒转化(矢量)或镀锌1启动子驱动的野生型(RPH1型)和活性缺陷突变体(转速1H235A型)分别是。按照中所述进行紫外线敏感性分析B类.
为了避免在合成培养基中观察到生长缺陷，在YP板上进行了以下分析。如前所述，Rph1是PHR1的阻遏物，PHR1编码光解酶以响应紫外线损伤(44). 为了确定组蛋白去甲基化酶活性在紫外线损伤反应中是否需要，进行了紫外线敏感性试验。单个JmjC基因的缺失对紫外线照射下细胞的活力没有明显影响(补充图S2A类). 然而RPH1型，但不是金华D1或金华D2，导致响应紫外线照射的生长缺陷(). 观察到的表型范围为5–20 mJ/cm2紫外线照射。为了测试三甲基化H3-K36脱甲基酶活性是否与脱甲基酶活动缺陷突变体的表型有关，转速1H235A型，在紫外线敏感性试验中进行测试。在相同的紫外线照射处理下，转速1H235A型突变体消除了表型(). 结果表明，脱甲基酶活性是必需的RPH1型-依赖性表型。此外，MS数据()证明了RPH1型，不是金华D1，H3-K36me3水平降低50%。总的来说，数据表明，Rph1可能通过改变组蛋白H3-K36me3的水平，参与细胞存活以应对DNA损伤。
RPH1和JHD1过表达菌株对6-AU有轻微抗性
H3-K36的甲基化状态与转录延伸有关。先前的研究表明，组蛋白H3-K36甲基转移酶Set2的缺失导致对6-AU治疗的中度耐药(45,46). 6-AU是一种常用的检测转录延伸缺陷的药物，它抑制核苷酸代谢并导致细胞GTP和UTP的耗竭。核苷酸耗竭影响伸长效率(47). 为了测试JmjC蛋白是否参与转录延伸，我们进行了6-AU敏感性分析。初步研究表明RPH1型或金华D1导致对6-AU产生轻微抗性(补充图S2B类). 结果仅在过度表达H3-K36脱甲基酶（Rph1和Jhd1）的菌株中观察到，而在过度表达的H3-K4脱甲基酶中没有观察到。数据与之前的观察一致，H3-K36甲基转移酶基因缺失设置2导致对6-AU的适度抵抗(45,46). 我们的数据支持这样的观点，即Rph1和Jhd1对H3-K36的去甲基化可降低H3-K36-的甲基化水平并干扰转录。
讨论
JmjC结构域编码组蛋白去甲基化酶活性
当我们的工作正在进行时，YER051W，新命名金华D1，被证明编码酵母H3-K36脱甲基酶(17); 据我们所知，这是迄今为止唯一报道的含有组蛋白脱甲基酶的酵母JmjC。尚不清楚Jhd1是否能使H3-K36me3脱甲基。我们的体内MS数据预测Jhd1是H3-K36me2或H3-K365me脱甲基酶。我们的数据还表明，Rph1、Jhd2和Gis1是去甲基酶。其中，Jhd2和Rph1分别是对H3-K4和H3-K36具有特异性的三甲基赖氨酸脱甲基酶。Gis1预计与Jhd1类似，作为H3-K36me或H3-K365me2脱甲基酶。Rph1对组蛋白H3-K36的特异性去甲基化酶活性已通过在体外酶测定。JmjC结构域负责Rph1脱甲基酶活性。我们还观察到Jhd2和Gis1的去甲基酶活性很弱，但可重复，分别对K4和K36肽具有特异性。6总之，五种酵母JmjC蛋白中的四种（Jhd1、Rph1、Jhd2和Gis1）是组蛋白脱甲基酶。
关于人类酶，有几个小组独立报告了六种JmjC蛋白为H3脱甲基酶。尽管JHDM1和JHDM2A分别是去甲基单体和二甲基H3-K36和-K9(17,19)，JMJD2家族组蛋白去甲基酶（JMJD2A、JMJD2B、JMJD2 C和JMJD2D）去甲基化三甲基H3-K9/K36(18,20–22). 值得注意的是，这六种JmjC蛋白中的每一种都有锌指、PHD或都铎结构域。这与我们的一个搜索标准相匹配，并暗示了这些蛋白质在转录中的每个角色。
总之，通过使用不同的方法，我们和其他小组得出了相同的结论，即JmjC结构域编码组蛋白去甲基化酶活性。我们的研究是第一份关于单个生物体中所有JmjC蛋白的系统MS蛋白质组学报告。我们的体内MS分析结果匹配在体外酶测定结果。在我们的淘汰赛MS数据中()，与过度表达数据相比，变化相对较小(). 表型筛查分析表明RPH1型导致在缺失菌株中未观察到的表型。这些差异表明缺失菌株对组蛋白H3甲基化的影响较小。考虑到所有三个位点（H3-K4、H3-K36和H3-K39）都被严重甲基化（超过60%），我们认为在酵母中，组蛋白甲基转移酶占主导地位。此外，去甲基化酶的局部效应可能不会导致全球MS数据的变化。尽管有这些影响，但观察到了微小但一致的变化。双方达成的良好协议在体外活性分析和体内Rph1的MS数据为我们方法的可靠性提供了坚实的支持。这种方法可以应用于其他生物体，以鉴定组蛋白去甲基化酶。
Rph1是一种参与DNA损伤反应和转录延伸的H3-K36me3脱甲基酶
在当前的研究中，体内MS数据表明，Rph1是一种H3-K36me3脱甲基酶，通过在体外分析。其JmjC结构域特异性催化H3-K36me3和H3-K365me2上的去甲基化，对H3-K4和H3-K79肽没有任何检测到的活性。据我们所知，这将是首次报道的酵母H3-K36me3脱甲基酶。我们的表型筛选实验表明RPH1型过表达菌株对紫外线辐射敏感，Rph1-JmjC结构域的催化活性是缺陷的原因。表型表明，Rph1是一种H3-K36me3脱甲基酶，参与DNA损伤反应。一直以来，有报道称H3-K36甲基转移酶Set2参与DNA损伤反应(11). 此外，由于RPH1型在金华D1过度表达张力。这种差异可以通过我们的预测来解释，Jhd1不是H3-K36me3脱甲基酶，而Rph1是H3-K365me3脱甲酶。这些结果表明，紫外线损伤反应与H3-K36甲基化水平相关，尤其是在H3-K36me3水平上。
如所示，MS数据RPH1型过表达菌株的H3-K36me3水平急剧下降。全球水平的下降表明，RPH1的过度表达具有全球影响。因为酵母中H3-K36甲基化和转录之间的联系已经建立，并且H3-K36-甲基转移酶Set2已被证明与RNA聚合酶II相互作用，并在转录延长中发挥重要作用(45,46,48–50)，H3-K36去甲基酶Rph1可能影响转录延长。确实，当RPH1型过度表达，有轻微的6-AU表型，表明其参与转录延伸。此外，另一种H3-K36脱甲基酶，Jhd1，而不是H3-K4脱甲基酶Jhd2，表现出与Rph1相同的表型。H3-K36脱甲基酶Rph1和Jhd1可能会将H3-K36-转移到甲基化程度较低的物种，导致转录活性降低。这可能是它们对6-AU轻度耐药的原因。生化细节需要进一步研究。
Jhd2是一种H3-K4脱甲基酶
体内MS数据表明Jhd2是一种H3-K4去甲基化酶。在在体外分析。据我们所知，之前没有报道过含有H3-K4脱甲基酶的JmjC结构域。Jhd2是一种功能未知的核蛋白。最近一项大规模酵母蛋白质相互作用研究确定了三种Jhd2相互作用蛋白，即Sas10、Fun30和YIL091C(51). Sas10过表达导致HML和HMR交配型基因的去表达(52). Fun30是一种推测的ATP-解旋酶，与Snf2同源。Fun30的过度表达影响染色体的稳定性和完整性(53). 有趣的是，Snf2家族酵母蛋白Isw1，一种ATP依赖的染色质重塑因子，已被证明通过H3-K4甲基化被激活基因招募(54). 这些研究表明，Jhd2可能是与沉默相关的组蛋白修饰和染色质重塑复合物的一个组成部分。我们目前的数据表明，Jhd2是一种作用于H3-K4的新型组蛋白去甲基化酶。
H3-K4上的甲基化有许多有趣的结果。一方面，Lys-4三甲基化发生在基因的启动子区，参与转录激活(49). 另一方面，Lys-4甲基化也介导rDNA和端粒沉默。H3-K4甲基转移酶Set1是rDNA区域、端粒和HML交配型位点沉默所必需的(5,55). 因此，Jhd2可能负调控转录，也可能抑制rDNA区域、端粒或HML交配型位点的沉默。
可能的H3-K79脱甲基酶
在组蛋白H3中的三个已知赖氨酸甲基化位点（Lys-4、Lys-36和Lys-79）中，迄今为止只有Lys-4和Lys-36被脱甲基酶作用。因为H3-K79在酵母中高度甲基化（90%）(8)相对较高的组蛋白甲基转移酶活性可以掩盖去甲基化酶敲除突变体中的微小变化。因此，不能排除Ecm5或非JmjC蛋白可能是H3-K79去甲基化酶。需要进一步调查来解决这个问题。
酵母JmjC蛋白质在转录中的作用
中的五种JmjC蛋白酿酒酵母Jhd1、Jhd2和Ecm5各有一个PHD结构域，而Rph1和Gis1有锌指结构域。这些结构域可能与组蛋白去甲基化相关的转录调控有关。据报道，Rph1和Gis1起到了阻遏作用(44). Rph1与启动子元件URS结合菲律宾比索可能通过锌指结构域。我们推测Jhd1和Jhd2中的PHD结构域可能通过甲基化组蛋白与染色质结合。使用染色质免疫沉淀和JmjC蛋白的DNA微阵列（CHIP-CHIP）进行全基因组定位分析，将提供有关其在转录中作用的详细信息。
