临床疫苗免疫学。2007年2月；14(2): 146–149.
重组截短核衣壳蛋白作为抗原用于新型免疫球蛋白M捕获酶联免疫吸附试验诊断重症急性呼吸综合征冠状病毒感染▿
,1 ,2 ,1 ,1 ,1 ,三和1,*
余福勋
长崎大学热带医学研究所病毒学系，日本长崎市坂本1-12-4号，邮编：852-8523，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
麦昆乐
长崎大学热带医学研究所病毒学系，日本长崎市坂本1-12-4号，邮编：852-8523，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
井上新吾
长崎大学热带医学研究所病毒学系，1-12-4 Sakamoto，长崎852-8523，日本，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
福托希·哈塞贝（Futoshi Hasebe）
长崎大学热带医学研究所病毒学系，日本长崎市坂本1-12-4号，邮编：852-8523，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
Maria del Carmen镶木地板
长崎大学热带医学研究所病毒学系，日本长崎市坂本1-12-4号，邮编：852-8523，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
森川茂
长崎大学热带医学研究所病毒学系，日本长崎市坂本1-12-4号，邮编：852-8523，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
森田口一
长崎大学热带医学研究所病毒学系，日本长崎市坂本1-12-4号，邮编：852-8523，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
长崎大学热带医学研究所病毒学系，日本长崎市坂本1-12-4号，邮编：852-8523，1越南河内国立卫生与流行病学研究所（NIHE）病毒学系，2日本东京国立传染病研究所病毒学系三
2006年10月2日收到；2006年11月15日修订；2006年12月20日接受。
摘要
我们报道了用重组截短SARS-CoV核衣壳蛋白作为抗原，建立了一种用于严重急性呼吸综合征冠状病毒的免疫球蛋白M（IgM）抗体捕获酶联免疫吸附试验（MAC-ELISA）。新开发的MAC-ELISA具有100%的特异性和敏感性，通过使用健康志愿者和实验室确诊的SARS患者的血清进行评估。使用从SARS患者收集的系列血清样本，通过检测SARS-CoV感染后的IgM抗体来确定血清转化的时间。血清转换检测的中位时间为发病后8天（范围为5至17天），发病后第一周的血清转换率为33%，第二周为97%，第三周为100%。与我们之前关于IgG检测的报告结果相比，IgM检测的中位血清转化时间提前了3天，IgM在患病后第二周的血清转化率显著高于IgG检测。我们的结果表明，SARS-CoV感染后，IgM应答比IgG出现得早，这与其他病原体的应答一致。我们新开发的MAC-ELISA系统为SARS-CoV感染的确认提供了一种新的替代方法。
严重急性呼吸综合征（SARS）是最近出现的一种与肺炎相关的人类疾病(5,7,10,15). SARS冠状病毒（SARS-CoV）出现后，有几篇报道涉及用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）或间接免疫荧光试验（IFA）检测特异性免疫球蛋白M（IgM）(1,三,13). 在这些研究中，IgM抗体的检测时间晚于IgG抗体，这与大多数已知病原体的现象形成了对比。早期IgG应答的原因尚不清楚。这可能是由于IgG抗体比IgM抗体发展得更早，或者，观察结果可能只是反映了检测IgM的分析的低灵敏度。众所周知，在不分离IgG的情况下检测IgM会产生较高的假阳性和假阴性率(三). 因此，应使用更敏感的方法来检测严重急性呼吸系统综合征冠状病毒感染患者的血清学反应。
SARS-CoV核衣壳蛋白抗体寿命长，在SARS患者中比其他病毒成分如棘突蛋白、膜蛋白和包膜蛋白的抗体更丰富(2,4,12,14,16). 在我们之前的研究中，我们报告了基于N末端截短的核衣壳蛋白的间接IgG ELISA是诊断SARS-CoV感染的一种安全、特异和敏感的测试(16). 这些数据表明SARS-CoV的核衣壳蛋白是一种很好的诊断靶抗原。
本研究以SARS-CoV核衣壳蛋白为抗原，建立了SARS-CoV特异性、敏感性IgM抗体捕获ELISA（MAC-ELISA）。该MAC-ELISA是专为检测IgM型抗体而设计的。评估了该MAC-ELISA的敏感性和特异性。此外，使用从SARS患者采集的系列血清样本，确定了患者在SARS-CoV感染后出现IgM血清转换所需的时间，并与我们之前的IgG检测研究结果进行了比较，我们发现在SARS-CoV感染中，IgM反应出现早于IgG反应，类似于宿主对其他已知病原体的反应。
材料和方法
血清样本。
在SARS爆发前，从越南河内的健康志愿者采集了175份血清样本，作为阴性血清对照。2003年3月11日至4月3日，在越南河内的法国医院采集了36名实验室确诊的SARS患者的系列血清样本。所有血清在使用前在56°C下热灭活30分钟。
蛋白质制备。
SARS-CoV NΔ121蛋白，包含核衣壳蛋白（N末端截短121个氨基酸的N蛋白结构）的122到422个氨基酸残基，如前所述进行表达和纯化(16). NΔ121蛋白用于动物免疫，抗原用于MAC-ELISA。
产生超免疫小鼠腹水。
将100μl（100μg）纯化NΔ121蛋白与等体积的弗氏完全佐剂（MP Biomedicals）乳化后腹腔注射给3周龄BALB/C小鼠。每隔14天用相同剂量的弗氏不完全佐剂（MP Biomedicals）中的NΔ121蛋白进行两次强化注射。最后一次助推器注射后一周，1×106腹腔注射SP2/0骨髓瘤细胞，收集腹水。
间接IgG ELISA。
基于重组截短SARS-CoV NΔ121蛋白的间接IgG ELISA如前所述(16).
IgM捕获ELISA程序。
SARS-CoV特异性IgM检测是通过用山羊抗人IgM抗体覆盖免疫板孔，将患者或对照血清添加到抗IgM涂层孔中，然后让捕获的IgM与重组SARS-CoV-NΔ121蛋白反应来完成的。用SARS-CoV超免疫小鼠腹水检测捕获的SARS-CoVNΔ121蛋白。用辣根过氧化物酶结合抗小鼠IgG检测结合抗NΔ121蛋白抗体，然后用H2O（运行）2-ABTS（2,2′-叠氮二乙基苯并噻唑烷磺酸）底物。用参比血清通过棋盘滴定法确定所有试剂的最佳稀释度。参考血清是根据我们的初步实验结果和血清可用性选择的。参考血清用于检测的内部控制。实际程序如下。将90个6孔Falcon免疫板（Becton Dickinson）涂上100μl 1:250稀释的山羊抗人IgM（BioSource International），并将其稀释在磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）中，然后在4°C下过夜进行板涂。然后用PBS-T（PBS加0.1%吐温20）将平板清洗五次，然后允许其与患者血清反应。患者血清样本在分析稀释剂（PBS-T加5%脱脂奶）中以1:100稀释度稀释。将每个患者血清添加到平板的四个孔中。患者样本在37°C的培养皿上培养1小时，然后清洗。然后将抗原（纯化的重组截短SARS-CoV NΔ121蛋白）以0.2μg（分析稀释液）的浓度添加到上部两个孔中，而仅将分析稀释液添加到下部两个孔作为阴性对照，并在37°C下培养平板1 h。洗涤平板，加入1:4000稀释的抗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒NΔ121蛋白高免疫小鼠多克隆腹水，并在37°C下孵育1小时。清洗平板，添加1:5000稀释的山羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物（Biosource，CA），并将混合物在37°C下孵育1小时。清洗平板，加入100μl ABTS-过氧化物酶底物（Kirkegaard&Perry Laboratories），并在黑暗中37°C孵育30分钟。在405 nm处测量光密度（OD）。通过从带有SARS-CoV NΔ121蛋白抗原的微孔中的特定OD减去无抗原微孔中的非特异性背景OD，计算每个血清的比活性（净OD）。报告的值表示每个样品的重复井结果的平均值。在所有测试板上，阴性对照和弱阳性对照的1:100稀释液（阳性样品的外径超过阴性对照的外径[零件号]约等于5），强阳性对照(零件号同时检测血清样本。阴性对照是175名健康受试者的血样之一。该对照组的OD值是根据175名SARS阴性受试者的平均OD加上2个标准偏差确定的。每个样品进行两次测试，并计算每个样品的平均OD。检测的截止值是阴性对照血清样品平均OD的两倍(零件号≥ 2).
结果
使用重组截短N蛋白的SARS-CoV MAC-ELISA的特异性。
使用SARS爆发前从越南河内健康志愿者收集的175份血清评估MAC-ELISA的特异性。在我们新开发的SARS-CoV MAC-ELISA中，所有175份血清样本均无反应；SARS-CoV MAC-ELISA的特异性为100%。
使用重组截短N蛋白的MAC-ELISA对SARS-CoV的敏感性。
为了确定MAC-ELISA的敏感性，对从越南36例实验室确诊的SARS患者连续采集的血清样本进行了反应性调查。在新开发的MAC-ELISA中，36份患者血清均呈反应性；SARS-CoV MAC-ELISA的敏感性为100%。
使用重组截短N蛋白对SARS-CoV进行MAC-ELISA结果的再现性。
对照血清OD不仅在同一试验时间的不同平板上稳定，而且在不同试验时间之间也稳定；阴性对照血清始终为阴性，弱阳性和强阳性对照血清在不同检测时间之间的OD变化小于0.2。
通过基于NΔ121蛋白的IgG ELISA和MAC-ELISA检测血清转化时间和血清转化率的比较。
收集系列血清样本的36名患者的血清转换次数如表所示对于IgM检测，发病后血清转化的中位时间为8天（范围为5至17天）。对于IgG检测，发病后血清转化的中位时间为11天（范围为6至21天）。采用NΔ121基于蛋白的IgG ELISA和MAC-ELISA检测的36例患者发病后的血清转化率（按时间）如表所示对于IgG检测，发病后第一周的抗NΔ121蛋白IgG血清转化率为22%，第二周为69%，第三周为100%。对于IgM检测，发病后第一周的抗NΔ121蛋白IgM血清转化率为33%，第二周为97%，第三周为100%。发病后第二周的IgM血清转换率显著高于IgG的观察值(对< 0.005).
表1。
基于SARS-CoV NΔ121蛋白的MAC-ELISA和间接IgG ELISA检测血清转化次数
| 免疫球蛋白 | 发病后血清转化的时间（天）
|
|---|
| 最早的 | 最新的 | 中值的 |
|---|
| 免疫球蛋白M | 5 | 17 | 8 |
| 免疫球蛋白G | 6 | 21 | 11 |
表2。
基于SARS-CoV NΔ121蛋白的MAC-ELISA和间接IgG ELISA检测的发病后时间长短安排的血清转化率
| 免疫球蛋白 | %发病后指定工作周内血清转化的患者数量b条
|
|---|
| 弗斯特 | 第二一 | 第三 |
|---|
| 免疫球蛋白M | 33 (12/36) | 97 (35/36) | 100（36/36） |
| 免疫球蛋白G | 22 (8/36) | 69 (25/36) | 100 (36/36) |
讨论
IgM抗体在免疫反应早期产生，并在疾病过程中迅速上升，因此IgM的检测是快速诊断急性病毒感染的有价值的工具(6). MAC-ELISA是专为IgM设计的。MAC-ELISA的捕获格式消除了由外来抗体引起的任何潜在背景，这反过来导致不太频繁的非特异性反应以及没有由类风湿因子引起的假阳性结果。IgM和IgG之间的抗原结合竞争被最小化，减少了假阴性结果的发生，从而使针对抗原的IgM抗体的检测更加可靠和敏感(8,9,11).
SARS-CoV出现后，已报道了几项利用间接ELISA或IFA方法检测特异性IgM抗体的研究。Woo等人报告称，在间接ELISA和IFA中，IgM抗体的检测时间晚于IgG抗体(13). Hsueh等人报告称，IgG血清转换与IFA的IgM血清转换同时发生，或提前1天发生。他们在检测IgM之前吸收IgG，以避免IgG抗体的干扰(三). Chang等人还报告了SARS-CoV感染后类似的IgG-IgM亚类反应(1). 在所有这些研究中，IgM抗体的检测时间晚于或与IgG抗体同时出现，这与大多数已知病原体所描述的现象形成了对比，针对这些病原体的IgM血清通常比IgG血清早几天出现。众所周知，在不分离IgG抗体的情况下检测IgM抗体会产生较高的假阳性和假阴性结果。因此，上述研究中观察到早期IgG反应的原因可能是其检测IgM的检测系统灵敏度低，而不是宿主免疫反应的生物学。
以重组截短的SARS-CoV核衣壳蛋白为抗原，建立了SARS-CoV的IgM捕获ELISA系统。新开发的MAC-ELISA具有100%的特异性和敏感性，通过使用健康志愿者和实验室确诊的SARS患者的血清进行评估，表明该检测系统是敏感和可靠的。我们最新开发的MAC-ELISA系统是首次报道使用重组蛋白对SARS-CoV进行IgM捕获检测。为SARS血清学诊断提供了一种新的选择。
使用从36例实验室确诊的SARS患者采集的系列血清样本，我们比较了SARS-CoV感染后的IgM和IgG抗体血清转换时间。对于IgM抗体，检测到的血清转化的中位时间为发病后8天，发病后第一周的血清转化率为33%，第二周为97%，第三周为100%。对于IgG抗体，检测到血清转换的中位时间为发病后11天，发病后第一周的IgG血清转换率为22%，第二周为69%，第三周为100%。IgM的平均血清转换时间比IgG早3天，此外，到发病后第二周，IgM阳性率明显高于IgG。我们的结果表明，SARS-CoV感染后，IgM应答出现早于IgG应答。这与大多数已知病原体的现象一致，针对这些病原体的IgM抗体通常比IgG抗体出现早几天。我们的结果表明，其他研究人员之前报告的IgG反应早于IgM反应可能是因为所用测试系统的灵敏度低，而不是代表IgM-IgG转换的实际时间。
本文结合我们以前的报告给出的结果(16)明确表明重组截短SARS-CoV核衣壳蛋白是SARS诊断的良好靶抗原。结果重复性很高。在我们新开发的系统中，不需要使用感染性病毒来生产抗原，这需要高度的微生物安全性以及适当的灭活和监测病毒灭活过程的方法。因此，这是一种更安全的诊断方法。利用原核宿主生产重组蛋白的优点是容易放大，细菌生长成本低。重组产物可以在相对较短的时间内（克隆后1周内）获得，表达和纯化过程简单易行。从1升培养的细菌培养基中，我们获得了10毫克以上的纯化NΔ121蛋白。与使用病毒感染细胞培养或真核表达系统相比，我们的方法制备抗原的成本要低得多。它在发展中国家以及大规模流行病学调查中特别有用。
致谢
这项研究得到了日本厚生劳动省和长崎大学21世纪热带和新发传染病全球控制战略卓越中心项目对新发和再发传染病研究的部分资助。
参考文献
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