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EMBO J。2006年5月3日；25(9): 1906–1914.
2006年4月20日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601068
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PMID：16628226

SUMO结合减弱吉普赛人染色质绝缘体

玛亚·卡佩尔森1和维克多·G·科尔塞斯1,一
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

染色质绝缘体与独立基因表达结构域的建立和染色质的核组织有关。据报道，小泛素样修饰物（SUMO）对蛋白质进行翻译后修饰，以调节其活性和亚核定位。我们提供的证据表明吉普赛人染色质绝缘体黑腹果蝇、Mod（mdg4）2.2和CP190被酰化，并且SUMO与基因组绝缘体位点的子集相关。SUMO结合途径的破坏改善了部分活性绝缘体的增强子阻断功能，表明SUMO修饰对细胞的活性起到负调控作用吉普赛人绝缘体。氨酰化并不影响CP190和Mod（mdg4）2.2结合染色质的能力，相反，它似乎调节了细胞核组织吉普赛人绝缘体复合体。结果表明，SUMO偶联可以抑制绝缘体蛋白的长程相互作用，并且可以调节染色质结构域的建立。

关键词：染色质、绝缘体、核组织、SUMO、转录

介绍

人们认为真核基因组被组织成独立的基因表达域。维持这种自主性对于正确执行复杂的发展程序和细胞对刺激的反应非常重要。染色质绝缘体具有两个关键特性，提示其参与独立表达域的组织。首先，当绝缘体位于这些元件之间时，它能够阻断增强子-促进剂之间的通信(Geyer和Corces，1992年;Kellum和Schedl，1992年). 其次，绝缘体可以保护转基因免受周围染色质的影响，从而实现其位置无关的表达(Kellum和Schedl，1991年;钟等1993年).

这个吉普赛人绝缘子黑腹果蝇由约350 bp的DNA序列组成，该序列结合至少三种成分的蛋白质复合物，即Su（Hw）、Mod（mdg4）2.2和CP190。Su（Hw）和CP190可以通过锌指结构域直接结合DNA(斯帕纳等, 1988;派等, 2004)，而Mod（mdg4）2.2不直接结合DNA，但被招募到吉普赛人通过与Su（Hw）和CP190物理相互作用的绝缘子序列(格拉西莫娃等, 1995;派等, 2004). 这个吉普赛人绝缘体最初被确定为吉普赛人反转录转座子(Geyer和Corces，1992年)，但数百个内源性结合位点吉普赛人蛋白质复合物存在于果蝇属基因组(Gerasimova和Corces，1998年). 对高度复制的多线染色体的分析表明吉普赛人绝缘体蛋白优先出现在浓缩和去浓缩染色质之间的边界，这表明它们在划分独立染色质结构域中的作用(拉布拉多和科尔塞斯，2002年;派等, 2004). 然而，在二倍体细胞核中，吉普赛人绝缘体蛋白结合成大的复合物，称为绝缘体(Gerasimova和Corces，1998年;伯德和科尔塞斯，2003年). 这些小体被认为代表了遥远的绝缘体复合体的汇合处，这些复合体将染色质纤维圈起来，从而描绘出染色质域。Mod（mdg4）2.2和CP190都包含一个能够自我作用的保守BTB/POZ域(多尔丹等, 1995;高希等, 2001)已被提议用于调节绝缘体复合体的聚集。绝缘体的完整性在功能上与吉普赛人绝缘体活性。例如，绝缘体成分的突变破坏了吉普赛人也会干扰绝缘子本体的形成(Gerasimova和Corces，1998年).

因此，染色质绝缘体在独立发生的转录活性的结构域划分中可能发挥重要作用。不出所料，这些结构域通常受到发育或环境调节，这意味着绝缘体本身可能受到调节，以允许生物体的各种基因表达程序。脊椎动物绝缘体蛋白CTCF的调控机制可以影响绝缘体活性。H19/Igf2位点CTCF的亲本特异性增强子阻断活性由该印迹位点内其结合位点的差异甲基化控制(贝尔和费尔森菲尔德，2000年;哈尔克等2000年). 具体而言，父系染色体上结合位点的甲基化只会阻止CTCF的结合，从而激活Igf2的表达。在这种情况下，CTCF的绝缘体活性在其DNA结合能力的水平上进行调节。CTCF活性的第二个调节机制是通过聚ADP-核糖（PAR）进行翻译后修饰，这似乎与绝缘体活性的正向调节有关(于等, 2004). PAR与CTCF的结合不会改变其DNA结合特性，但可能是建立染色质结构域所涉及的蛋白质-蛋白质相互作用所必需的(Klenova和Ohlsson，2005年).

结合小泛素样修饰物（SUMO）是另一种调节多核因子活性的翻译后修饰。与泛素类似，SUMO通过级联酶与靶蛋白共价连接，包括激活酶E1（Aos1/SAE1和Uba2/SAE2的异二聚体）、结合酶E2（也称为Ubc9）和多种特异性增强E3连接酶(多曼，2004;海伊，2005). SUMO共轭最常在sumoylation共有基序ψKxE中检测到（其中ψ是一个大的疏水氨基酸残基，x是任何残基）。SUMO附着与多种功能输出有关，包括调节转录活性、亚核靶向和形成核隔室。通常，蛋白质的琥珀酰化会改变其结合DNA或其他蛋白质因子的能力。

多个SUMO E3连接酶，似乎不需要，但可以增强特定底物的sumoylation体内和在体外的特征。SUMO E3连接酶的Siz/PIAS家族成员包含一个与泛素E3连合酶的RING结构域同源的结构域(Johnson和Gupta，2001年;施密特和穆勒，2002年). 最近，含有RING结构域的dTopors被鉴定为E3泛素连接酶，参与吉普赛人绝缘体活度(Capelson和Corces，2005年)，但一些报告也暗示了SUMO途径中dTopor、人类Topor和病毒ICP0的同源物(Muller和Dejean，1999年;韦格等, 2003,2005;李等, 2004). 因此，我们调查了以下可能性：吉普赛人绝缘体蛋白受SUMO修饰以及dTopor在这一过程中的潜在参与调节，可能作为E3 SUMO连接酶。这里，我们提供的证据表明吉普赛人绝缘体复合体Mod（mdg4）2.2和CP190被聚合体内和在体外以及磺酰化负衰减吉普赛人绝缘体活性。具体来说，SUMO结合干扰了绝缘体的核聚合，这表明高阶染色质结构域的建立可以通过绝缘体蛋白的翻译后修饰来调节。

结果

绝缘蛋白被酰化在体外

Topor是dTopor的哺乳动物同源物，最近被证明与SUMO E2结合酶Ubc9相互作用(韦格等, 2003). 这种关联在进化上似乎是保守的，因为我们也检测到了果蝇属酵母双杂交试验中的Ubc9和dTopors（数据未显示）。为了确定dTopors是否作为绝缘体蛋白的E3 SUMO连接酶发挥作用，将Su（Hw）、Mod（mdg4）2.2和CP190作为底物在在体外在存在或不存在dTopors的情况下，sumoylation反应。所有三种蛋白质都含有在SUMO修饰一致模体ψKxE中发现的赖氨酸，因此可以被SUMO潜在修饰。对于每一个酰亚胺化反应，在体外-转录和翻译35S标记底物蛋白与E1、E2酶、SUMO和在体外-生成或纯化的重组dTopors。CP190和Mod（mdg4）2.2都可以被SUMO修饰，因为当添加SUMO共轭机构时会出现更大的分子量带(图1A和B). 添加dTopors不仅不能促进，而且似乎破坏了CP190和Mod（mdg4）2.2的sumoylation，这是通过在存在dTopor的情况下两种蛋白质中较高迁移修饰形式的水平降低来评估的(图1A和B). 在反应中引入等量的另一种底物蛋白后，如在以CP190为底物的反应中添加Mod（mdg4）2.2，未观察到sumoylation的破坏（数据未显示）。当使用抗SUMO抗血清检测SUMO结合时，可以观察到相同的模式(图1C). 同样，添加重组纯化的dTopors蛋白可以抵消Mod（mdg4）2.2特异性SUMO结合物的出现。

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SUMO修改了Mod（mdg4）2.2和CP190在体外各种蛋白质带的大小以kDa表示。Mod（mdg4）2.2的未修改形式为100kDa，CP190的未修改类型为190kDa。CP190的sumoyated形式为220kDa，Mod（mdg4）2.2显示了120和135kDa的两个不同的sumoyated带。(A、 B类)体外sumoylation反应35S标记的CP190（A）或Mod（mdg4）2.2（B）用作底物，存在或不存在SUMO反应成分（SUMO rxm），包括E1、E2酶、SUMO和ATP或dTopors。1号车道，仅CP190；车道2，CP190，带SUMO rxm；3号车道，CP190，带SUMO rxm和在体外-生成的dTopor；车道4，仅Mod（mdg4）2.2；车道5，Mod（mdg4）2.2，带SUMO rxm；车道6，Mod（mdg4）2.2，带SUMO rxm和在体外-生成的dTopor。箭头指向CP190和Mod（mdg4）2.2的汇总形式。(C类)体外用α-SUMO抗体监测存在或不存在SUMO E1和E2、SUMO、Mod（mdg4）2.2或dTopors时的sumoylation反应。箭头指向Mod（mdg4）2.2特定的SUMO-GST共轭。标有星号的低分子量带对应于Ubc9-SUMO-GST。(D类)与谷胱甘肽珠结合的GST-Ubc9或GST与他的6-Mod（mdg4）2.2（无论是否存在His）6-d建议。沉淀组分和输入蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并用α-Mod（mdg4）2.2或α-dTopors抗体进行Western blot。

与许多已确定的SUMO偶联底物一样，CP190和Mod（mdg4）2.2似乎不需要E3连接酶的存在在体外为了被酰化，这表明它们能够直接结合Ubc9。我们使用GST下拉分析证实了Mod（mdg4）2.2和Ubc9的这种关联(图1D，左侧面板）。SUMO E3连接酶被认为是作为适配器表面发挥作用，同时结合催化E2和目标蛋白以促进结合。如果dTopors充当SUMO E3连接酶，它应该能够与Ubc9和Mod（mdg4）2.2形成复合物，并促进它们之间的相互作用。然而，根据在体外sumoylation分析表明，向纯化的GST-Ubc9和Mod（mdg4）2.2混合物中添加dTopor会干扰它们的相互作用，并导致下拉馏分中恢复的Mod（mdg4）2.1水平降低(图1D，右侧面板）。这些结果表明，dTopors可能通过干扰Ubc9与Mod（mdg4）2.2或CP190之间的关联来对抗sumoylation。dTopors降低CP190和Mod（mdg4）的sumoylation的能力2.2在体外让人想起体内抑制SUMO修饰PML和Sp100蛋白的病毒同源物ICP0的特性(Muller和Dejean，1999年). 总之，这些发现表明CP190和Mod（mdg4）2.2被酰化，并反对dTopors作为绝缘体蛋白的E3 SUMO连接酶发挥作用。相反，dTopors可能通过抑制其sumoylation来调节这些蛋白质的修饰。

对CP190和Mod（mdg4）2.2进行了汇总体内

确定CP190和Mod（mdg4）2.2是否相加体内，我们分析了使用和不使用两种SUMO异肽酶抑制剂制备的幼虫蛋白提取物中的内源性蛋白质，N个-乙基马来酰亚胺（NEM）和碘乙酰胺（IAA）(Eloranta和Hurst，2002年). 与未使用抑制剂制备的提取物相比，在NEM和IAA存在的情况下对细胞进行裂解，可获得更高水平的SUMO结合物回收，这一点在使用SUMO抗血清的西方分析中得到了证明(图2A，左侧面板）。同样，这种处理导致出现CP190和Mod（mdg4）2.2的高分子量共轭物(图2A，右侧面板）。我们通常在蛋白质提取物或在体外这与Mod（mdg4）2.2氨基酸序列中存在的两个强一致性sumoylation位点一致。CP190似乎有一种主要的sumoylated形式体内或在体外尽管其序列包含五个预测的共识位点。无论Western blot暴露的时间长短，均未观察到较高分子量形式的Su（Hw）与抑制剂的添加相关。

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将Mod（mdg4）2.2和CP190相加体内各种蛋白质带的大小以kDa表示。Mod（mdg4）2.2的未修改形式为100kDa，CP190的未修改类型为190kDa。CP190的sumoyated形式为220kDa，Mod（mdg4）2.2显示了120和135kDa的两个不同的sumoyated带。(A类)蛋白质提取物果蝇属幼虫在存在或不存在SUMO异肽酶抑制剂（SII）NEM和IAA的情况下制备，通过SDS-PAGE进行解析，并用SUMO抗体进行蛋白质印迹，表明吉普赛人绝缘体蛋白。(B类)野生型生物或指示生物的幼虫蛋白提取物低分子量在SII存在下制备突变体，通过SDS–PAGE进行解析，并用指示蛋白的抗体进行蛋白质印迹。三角形表示凝胶上的提取物含量增加。星号表示抗体识别的非Mod（mdg4）2.2带(蒙格拉德等2002年). (C类)野生型（−）或UAS-dTopors公司/ActGAL4（+）幼虫在SII存在下制备，通过SDS–PAGE进行解析，并用指示蛋白的抗体进行Western blot。

通过检测SUMO结合E2酶Ubc9的突变体，进一步验证了CP190和Mod（mdg4）2.2的这些缓慢迁移形式的一致性果蝇属由基因编码lesswright公司(轻水反应堆). 两种低形态等位基因组合幼虫的蛋白质提取物轻水反应堆，纯合子轻水反应堆5个/轻水反应堆5和转基因轻水反应堆5/轻水反应堆5486(阿波尼舍夫等, 2001)与野生型相比，CP190和Mod（mdg4）2.2的高分子量形式显著减少(图2B). 正如预期的那样，在这些突变体中未检测到Su（Hw）的变异。

自从发现dTopors干扰了sumoylation在体外此外，还检测了其影响CP190和Mod（mdg4）2.2的酰化形式的能力体内为此，通过actin-GAL4在携带UAS-dTopors转基因构建物的幼虫中诱导dTopor过度表达(实际GAL4)驱动程序。dTopors水平升高会导致CP190和Mod（mdg4）2.2的sumoylated形式减少，这是通过Western分析从含有诱导dTopor的幼虫和未诱导dTomors的幼虫中获得的蛋白质提取物判断的(图2C). 总之，在SUMO E2连接酶突变的幼虫或过表达dTopors的幼虫中观察到的这些较慢迁移的蛋白质形式的减少强化了它们代表CP190和Mod（mdg4）2.2的SUM酰化形式的观点。

SUMO与绝缘体蛋白的染色质结合位点相关

为了检测绝缘体蛋白SUMO修饰的功能相关性，我们分析了SUMO是否存在于细胞的染色质结合位点吉普赛人绝缘子复合体。为此，SUMO在多线染色体上的分布果蝇属将3龄幼虫与Mod（mdg4）2.2和CP190进行比较。符合其参与多个核进程的情况，如前所述(勒昂布尔等2000年)，SUMO定位于基因组中数百个离散的结合位点。此外，它似乎与多线染色体的不同染色质状态有关，包括异色染色中心、常染色去凝聚带间以及带间和凝聚带间的边界区域。一部分Mod（mdg4）2.2位点（仅在边界区域发现）与SUMO共定位，这是由多烯染色体与抗SUMO和抗Mod（mdg4）2.2抗血清共染色所揭示的(图3A). 同样，在CP190染色质结合位点的一个子集检测到SUMO(图3B). 如前所述，Mod（mdg4）2.2的所有结合位点都与CP190重叠，但CP190与不与Mod（mdg4）2.1和Su（Hw）重叠的其他位点结合(派等, 2004). 尽管CP190与SUMO重叠的总条带数高于Mod（mdg4）2.2，但我们估计两种分析的绝缘体蛋白与SUMO-共定位的位点百分比约为10-15%。这些位点可能对应于绑定CP190或Mod（mdg4）2.2可能被SUMO修改的区域。部分绝缘体部位存在SUMO修饰，这表明sumoylation可能与特定的绝缘体状态有关。

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SUMO与吉普赛人染色质上的蛋白质复合物。白色箭头指向SUMO和绝缘体蛋白之间的共定位位置。DNA用DAPI（蓝色）染色。(A类)用Mod（mdg4）2.2（红色）和SUMO（绿色）抗体对三龄幼虫多线染色体进行免疫染色。(B类)用CP190（红色）和SUMO（绿色）抗体对多烯染色体进行免疫染色。

SUMO修饰途径拮抗吉普赛绝缘体活性

为了理解苏美化的功能后果吉普赛人绝缘体蛋白，我们分析了SUMO结合途径组分的突变对增强子阻断活性的影响吉普赛人为此，三吉普赛人逆转录转座子诱导的突变被用作吉普赛人绝缘体功能。这个年2等位基因包含吉普赛人在增强子和促进剂之间黄色的(年)导致低表达的基因黄色的成虫表皮中的基因产物(图4，顶部面板）。类似地切6(计算机断层扫描6)突变等位基因是由插入吉普赛人在启动子和翼缘增强器之间切基因。典型的表现是飞翼边缘出现锯齿状或切割状(图4，顶部面板）。最后爆炸物管理第1页至第11页突变是由插入吉普赛人在爆炸物管理a的基因和启动子白色插入该位点的转基因(济等, 1997). 控制白色基因表达爆炸物管理调节区在蝇眼的背侧和腹侧斑块中产生红色素的特征性表达。插入吉普赛人绝缘体可防止爆炸物管理监管区域对白色基因启动子，使红色素在整个眼睛中分布更广(图4，顶部面板）。

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SUMO结合途径成分的突变促进了吉普赛人绝缘体。显示的是腹部、翅膀和眼睛年2爆炸物管理第1页至第11页计算机断层扫描6; +; +,年2爆炸物管理第1页至第11页计算机断层扫描6; +;修改（mdg4）u1型,年2爆炸物管理第1页至第11页计算机断层扫描6; 轻水反应堆5486/表面贴装34493; 修改（mdg4）u1型和年2爆炸物第1页至第11页计算机断层扫描6; 轻水反应堆2858/表面贴装3k06307型; 修改（mdg4）u1型雌性苍蝇。

为了测试磺酰化对绝缘体活性的积极或消极影响，在Mod（mdg4）2.2中的零突变产生的受损绝缘体的致敏背景中检测SUMO途径成分的突变，修改（mdg4）u1型(蒙格拉德等2002年). 缺少Mod（mdg4）2.2部分破坏绝缘体活性，从而增加增强子-启动子通信。在年2和计算机断层扫描6这表现为基因产物表达的增加，这分别导致腹部色素沉着或翼缘光滑(图4，从顶部面板算起第二个）。在爆炸物管理第1页至第11页轨迹修改（mdg4）u1型突变对转录产生相反的影响，因为在这种情况下，绝缘体干扰了消音器-启动子的通讯。因此，结果更少白色基因产物或眼睛中较小的红色色素沉着区域(图4，顶部面板的第二个）。

SUMO E2-结合酶的联合突变轻水反应堆和SUMO基因表面贴装3抑制mog（mdg4）u1型在吉普赛人-诱导表型，表明SUMO结合减少吉普赛人绝缘体活性。两种不同的杂合子组合轻水反应堆和表面贴装3,轻水反应堆5486/表面贴装34493和轻水反应堆2858/表面贴装3k06307型，对年2,计算机断层扫描6和爆炸物管理第1页至第11页这些等位基因纯合子的表型无法评估，因为它们都无法存活到成年。表达减少黄色的或者腹部更轻年2; lwr5486/smt3型4493; 修改（mdg4）u1型或年2; 轻水反应堆2858/表面贴装3k06307型; 修改（mdg4）u1型将苍蝇与年2; 修改（mdg4）u1型控件(图4，底部两个面板），表明吉普赛人绝缘体。类似地，对于计算机断层扫描6根据携带SUMO途径突变的果蝇的翼缘更加锯齿状和不连续的判断修改（mdg4）u1型背景相对于修改（mdg4）u1型苍蝇(图4，底部两个面板）。的眼睛爆炸物管理第1页至第11页; 轻水反应堆5486/表面贴装34493; 修改（mdg4）u1型突变体显示出比那些爆炸物管理第1页至第11页; +;修改（mdg4）u1型控件(图4，从底部第二个面板），表明绝缘体活性增加，这意味着SUMO结合途径与正常途径相反吉普赛人绝缘体功能。观察到的表型变化是微妙的，因为只有这些等位基因的杂合组合才能被检测。观察到的影响计算机断层扫描6和爆炸物管理第1页至第11页突变苍蝇种群和图中所示的照片一致图4很好地代表了观察到的效果。出现表型变化年2在中lwr/smt3号机组两种基因型中约30%的苍蝇出现突变（其余70%的苍蝇表现出不太明显的连续体效应）。有趣的是，所有这些遗传相互作用在女性中都特别明显，尽管它们在两性中都可以检测到。The effects of the表面贴装3k06307型上的突变爆炸物管理第1页至第11页无法进行评估，因为这种突变是由携带白色基因。这些结果表明轻水反应堆SUMO结合途径参与吉普赛人绝缘体功能。

绝缘体蛋白的氨酰化不调节其与DNA的结合

据报道，sumoylation可以干扰某些转录因子的DNA结合能力或干扰其向某些染色质位置的募集(古德森等, 2001;Chalkiadaki和Talianidis，2005年). 同样，CP190或Mod（mdg4）2.2的sumoylation可能会破坏它们与染色质的结合。为了研究这种可能性，我们分析了不同水平的Ubc9对绝缘体蛋白与多线染色体结合的影响。Mod（mdg4）2.2和CP190在轻水反应堆突变幼虫或过度表达的幼虫UAS-lwr公司由实际GAL4驱动程序，与野生型相比(图5A). 染色质相关绝缘体蛋白的水平或其全局结合模式没有观察到显著变化。

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氨酰化不影响CP190和Mod（mdg4）2.2与染色质的结合。DNA用DAPI（蓝色）染色。(A类)野生型多线染色体的免疫染色，UASlwr/ActGAL4公司和轻水反应堆5/5486具有Mod（mdg4）2.2（红色）和CP190（绿色）抗体的幼虫。(B类)多线染色体的免疫染色年2; +;修改（mdg4）u1型和年2; 轻水反应堆5/5486; 修改（mdg）u1型具有Mod（mdg4）2.2（红色）和CP190（绿色）抗体的幼虫。箭头指向年2轨迹（插图）。

由于SUMO途径突变的表型后果在修改（mdg4）u1型背景，我们还检测了CP190与染色体的结合低分子量5/轻水反应堆5486; 修改（mdg4）u1型和修改（mdg4）u1型突变体。在CP190与多烯染色体的总结合中未检测到任何变异轻水反应堆和修改（mdg4）与幼虫突变相比修改（mdg4）独自一人(图5B). 由于我们没有观察到Su（Hw）的sumoylation，因此在没有SUMO E2连接酶的情况下，其结合不会发生改变。因此，在年2位于轻水反应堆5/低分子量5486; 修改（mdg4）u1型与…有关的遗传背景修改（mdg4）u1型(图5B，插图）。同样，CP190在年2这些突变体中的位点，表明sumoylation不会影响绝缘体蛋白与染色质结合的能力。

氨酰化破坏绝缘体蛋白的核聚集

SUMO结合也被描述为调节蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质的sumoylation导致它们失去某些结合或获得新的结合(西勒等, 2001;格德伍德等, 2003). 因此，研究表明，sumoylation可诱导亚核重组，从而使sumoylated蛋白与不同于其未修饰对应物的核隔室相关联(金等, 1999;罗斯等2002年). 自核组织以来吉普赛人绝缘体蛋白在功能上与绝缘体活性有关(Gerasimova和Corces，1998年;派等, 2004;Capelson和Corces，2005年)，我们想研究Mod（mdg4）2.2和CP190的SUMO改性是否会影响它们形成绝缘体的能力。

通过驱动UAS-lwr公司具有行动GAL4用抗Mod（mdg4）抗血清对三龄幼虫二倍体细胞进行免疫染色，结果表明，绝缘体显著扩散(图6A). 用DAPI染色DNA可以控制核完整性。这些发现与所观察到的具有增强阻断功能的琥珀酰化基因干扰一致吉普赛人此外，他们认为SUMO结合通过干扰绝缘体蛋白的核聚合来负调控绝缘体活性。

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SUMO结合可对抗绝缘体蛋白的核结合。(A类)野生型和非野生型大脑和影像盘二倍体细胞的免疫染色UASlwr/ActGAL4公司具有Mod（mdg4）抗体的幼虫（红色）。(B类)野生型二倍体细胞的免疫染色，修改（mdg4）u1型,轻水反应堆5/5;修改（mdg）u1型和轻水反应堆5/5486; 模块（mdg）u1型带有CP190抗体的幼虫（红色）。DAPI单独显示在左侧，在叠加图中以蓝色显示。

较低水平的Ubc9对吉普赛人绝缘子本体。在没有Mod（mdg4）2.2的情况下，由于绝缘体复合体的一个桥接组件的损失，绝缘体的形成被破坏(Gerasimova和Corces，1998年). 对于两种分析的突变等位基因组合轻水反应堆在中修改（mdg4）u1型背景，轻水反应堆5/轻水反应堆5; 修改（mdg4）u1型和轻水反应堆5/轻水反应堆5486; 修改（mdg4）u1型，标记有抗CP190抗体的绝缘体可以以类似于野生型细胞中观察到的模式进行改造(图6B). 绝缘体蛋白核簇的改善与SUMO对其修饰水平较低的相关性表明，SUMO酰化可能会干扰远处绝缘体复合物的自相互作用(图7). 这与Mod（mdg4）2.2的BTB结构域中一致存在的sumoylation位点一致，且紧邻CP190的BTB区域，因为这些结构域参与介导这两种蛋白质之间的相互作用(派等, 2004).

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SUMO修饰对染色质结构域形成的影响模型。染色质环域可以通过远距离的相互作用建立吉普赛人绝缘体复合体，并通过dTopors的系留功能进一步稳定（右）。CP190和Mod（mdg4）2.2的Sumoylation干扰了它们的自我相互作用，导致染色质结构域的破坏（左）。灰色线代表核膜，黄色球体代表核小体。

讨论

的两种蛋白质成分吉普赛人染色质绝缘体Mod（mdg4）2.2和CP190被SUMO修饰在体外和体内dTopors可能通过破坏SUMO E2酶Ubc9和底物绝缘体蛋白之间的接触来干扰其sumoylation。尽管dTopor的抑制作用相对较小，但在所使用的各种分析中，其抑制作用是一致的，因此无论何时，只要通过直接添加，dTopors都会被引入较高水平在体外或者通过增加表达体内发现其导致Mod（mdg4）2.2和CP190的酰化降低。Ubc9和SUMO编码基因突变破坏SUMO结合对吉普赛人绝缘体活性，表明SUMO修饰的正常作用是拮抗绝缘体功能。一部分染色质结合绝缘体蛋白似乎与SUMO相关，但SUMO途径中的突变并未影响CP190或Mod（mdg4）2.2的染色质结合特性。相反，sumoylation干扰了核绝缘体的形成，以至于Ubc9的过度表达导致核绝缘物结构的破坏，而Ubc9和sumoylion水平较低导致在缺少Mod（mdg4）2.2的情况下部分恢复失去的结合。

这些发现表明，SUMO对CP190和Mod（mdg4）2.2的修改可能会阻止自结合，从而干扰形成绝缘子体所需的远距离绝缘子复合体之间的远程相互作用(图7). 因此，sumoylation可能会阻止形成闭合的染色质环和随后建立自主的基因表达域。

多项证据表明SUMO修饰在转录抑制中发挥作用。组蛋白的氨酰化被认为是染色质被抑制的标志(Shiio和Eisenman，2003年)而SUMO与某些转录调节因子的结合导致其与组蛋白脱乙酰化酶的结合，从而消除组蛋白中的活性乙酰化标记(格德伍德等, 2003;Yang和Sharrocks，2004年). Polycomb群（PcG）蛋白SOP-2的SUMO修饰是其稳定抑制霍克斯基因(张等, 2004)和另一个PcG阻遏物Pc2起SUMO E3连接酶的作用(卡吉等, 2003). 修改吉普赛人SUMO的绝缘体蛋白似乎并不完全与转录抑制相关，因为lwr/smt3号机组突变体导致表达上调爆炸物管理P1-D1页基因座，但在转录下调中年2和计算机断层扫描6在这些情况下，转录输出似乎仅与绝缘体的增强子阻断活性相关。然而，可能的是，sumoylation的作用之一涉及基因组中选定的绝缘体位点与转录抑制的关联。Sumoylated insulator complex可能不参与表达域的形成，但可以将沉默因子靶向周围的染色质。

在哺乳动物细胞核中，dTopor的同源物定位于PML体，PML体在SUMO共轭机制中富集(拉希德等2002年). 如果抑制sumoylation也是哺乳动物Topors的特性，那么它可能在阻止针对这些核隔室的因子进一步sumoylate方面发挥作用。以这种方式，ICP0也定位于PML体，在PML体中它会导致PML和SP100这两种主要成分的去甲酰化(Muller和Dejean，1999年). 最近有报道称Topors可能作为肿瘤抑制蛋白p53的SUMO E3连接酶发挥作用(韦格等, 2005). 与我们的结果明显矛盾的原因可能有几个。Topor和dTopor可能在SUMO途径方面的功能发生了分歧，例如Topor作为SUMO E3发挥作用，而dTopors由于与Ubc9的保守相互作用而干扰SUMO加法。或者，dTopors参与SUMO通路可能是底物特异性的，因为它可能以允许与特定靶蛋白相互作用或阻止其发生的方式与Ubc9结合吉普赛人dTopor对sumoylation的干扰与之前的观察一致，即dTopors促进了绝缘体的活性(Capelson和Corces，2005年)而苏美化似乎打乱了它。

有人认为，即使去除了SUMO标签，SUMO结合也可能影响修饰蛋白的功能，从而为蛋白质调节创造细胞记忆(海伊，2005). 这个想法的产生部分是为了解释通常观察到的SUMO修饰的给定蛋白质的小百分比与修饰对蛋白质细胞功能的显著影响之间的矛盾。蛋白质可能需要Sumoylation才能进入稳定的复合物或功能状态，但在最初建立后可能不需要SUMO修饰的持久性。因此，由于SUMO共轭和随后的去共轭改变了更大比例的分子的功能，因此，sumoylation的实际效果可能远远超过可检测到的sumoylated群体。与其他报告的病例类似，Mod（mdg4）2.2和CP190的sumoylated形式在绝缘体蛋白总库中只占一小部分，但这些形式丢失的表型效应相当显著。SUMO附着可能调节染色质结构域的初始组织，可能在早期发育或有丝分裂后，但一旦建立，这些结构域可能在没有SUMO的情况下保持稳定。此外，SUMO标签的快速结合和去结合循环意味着sumoyalization可能被需要根据信号重组的过程所使用。从这个意义上说，SUMO修饰似乎特别适合调节基因表达域，因为它可以产生“记忆”但灵活的状态。

材料和方法

体外SUMO化

对于与放射性标记底物的反应，CP190、Mod（mdg4）2.2或Su（Hw）分别为在体外-转录和翻译35S-蛋氨酸（使用TNT偶联兔网织红细胞裂解物系统；Promega）。将每个TNT反应的3μl量与150 ng SAE1/SAE2、1000 ng Ubc9、1000 ng SUMO（来自LAE Biotech#K007的sumoylation试剂盒的所有成分）混合，加入或不加入1000 ng重组纯化的His6-dTopors或3μl在体外-转录/翻译的数据。反应在含有20 mM HEPES、pH 7.5、5 mM MgCl的缓冲液中进行2，5 mM ATP，37°C下60分钟，在7.5%SDS–PAGE凝胶上溶解，并通过放射自显影进行可视化。研究dTopors对Mod（mdg4）2.2和Cp190酰化的影响在体外，我们使用了越来越多的在体外-转录/翻译蛋白的范围为1至5μl。在3μl以下未观察到任何影响，这是所示实验中使用的浓度图1.对于要通过Western blotting检测的反应，400 ng重组蛋白纯化果蝇属将Ubc9 GST（pGEX-Ubc9构建体是L Griffith博士赠送的）和150ng SAE1/SAE2（LAE#P006）在含有50mM Tris、pH 7.5、2.5mM MgCl的缓冲液中合并2，0.1 mM DTT，5 mM ATP，含或不含3μg纯化的重组果蝇属SUMO-GST（pGEX-SMT3gg构建物是a Courey博士的礼物），400 ng重组纯化的His6-Mod（mdg4）2.2和1000 ng重组纯化His6-dTopors，反应在30°C下进行120分钟。用α-SUMO抗体（a Dejean博士的礼物）在1/10000稀释度下进行蛋白质印迹。

重组蛋白纯化和GST下拉分析

GST-Ubc9、GST-SUMO、GST、His的培养6-Mod（mdg4）2.2和His6-dTopors转化为Rosetta细菌株（Novagen），用0.1 mM IPTG诱导，培养3h，在含有1%Triton X的PBS中超声裂解，并通过谷胱甘肽或镍色谱纯化。对于GST下拉分析，将表达GST-Ubc9或GST的培养物的0.5 ml裂解液与谷胱甘肽结合珠在4°C下孵育3 h，用PBS洗涤一次，并与纯化的His结合6-Mod（mdg4）2.2，含或不含等摩尔量的His6-d顶部。过夜培养后，用PBS洗涤结合蛋白，煮沸洗脱并用Western blotting分析。

蛋白质提取物的制备和蛋白质印迹分析

按说明制备三龄幼虫的蛋白质提取物(Capelson和Corces，2005年)，含有或不含有SUMO异肽酶抑制剂，80 mM的NEM和0.2 mM的IAA。蛋白质在7.5%的SDS–PAGE上解析，并在含有7%甲醇的甘氨酸缓冲液中转移到PVDF膜上。按说明对斑点进行探测(Capelson和Corces，2005年).

苍蝇变种和杂交

苍蝇种群保持在25°C的标准培养基中。的库存表面贴装34493和表面贴装3k06307型突变是从布卢明顿库存中心获得的。这个轻水反应堆5486,轻水反应堆5,轻水反应堆2858突变株和UAS-lwr公司转基因菌株是S Tanda博士的礼物。

免疫组织化学

如前所述，对幼虫影像盘和大脑的多线染色体和二倍体细胞进行免疫染色(Gerasimova和Corces，1998年;格拉西莫娃等2000年). 兔和大鼠α-CP190抗体分别以1:400和1:100稀释，兔α-SUMO以1:50稀释。

致谢

我们感谢S Tanda博士为我们提供轻水反应堆突变体和转基因，A Dejean博士和J Seeler博士针对α-SUMO抗体，A Courey博士针对SUMO-GST和其他结构，L Griffith博士针对Ubc9-GST结构，A Spradling博士针对有用的建议，EP Lei博士和M Labrador博士针对长夜富有启发性的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院颁发的美国公共卫生服务奖GM35463的支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团