用于状态转换的可移动捕光复合物II多肽的鉴定莱茵衣藻

摘要

在含氧光合生物中，两种类型的光系统，即光系统I（PSI）和光系统II（PSII），在电子从水向NADP的转移中串联运行⁺这两个光系统包含它们自己的反应中心和光收集天线系统。PSI集光天线系统包含作为外围单体天线的集光复合物I（LHCI）蛋白质，而PSII集光天线体系分别包含作为外围三聚体和内部单体天线（参见参考文献中的综述）的主要和次要集光复合体II（LHCII）蛋白质。1). 吸收的光能在两个光系统之间的分配是动态平衡的，确保了在不断变化的光环境中光合电子传输的最大效率(2,三). 这种平衡由一个称为“状态转换”的过程调节：状态1是由PSI的优先激发引起的，状态2是由PSII的优先激发诱发的（参见参考文献中最近的评论）。4-6). 这种短期适应过程涉及负责LHCII磷酸化的类囊体结合蛋白激酶(7,8). 激酶的激活受质体醌系统间池的氧化还原状态调节(9)通过细胞色素b条₆ （f）复合体(10). 富含PSII的堆积颗粒区中的磷酸-LHCII蛋白横向重新分布到富含PSI的基质片层区(11). 因此，磷酸-LHCII蛋白很可能从PSII中分离出来并与PSI结合，从而将吸收的能量从PSII转移到PSI(12,13). 当质体醌池被氧化，类囊体结合磷酸酶去磷酸化LHCII蛋白时，发生相反的过程(7).

尽管积累了这些信息，但研究人员尚未成功识别出流动LHCII多肽，使得模型的分子细节模糊不清(14). 这种识别的两个障碍是(我)在状态2下，流动LHCII蛋白可能与PSI核心松散结合，导致其在标准方法分离期间分离，以及(ii（ii）)高等植物中的能量再分配量很小，大多数生化研究都是在高等植物中进行的，因此很难检测到相应少量的流动LHCII多肽。

单细胞藻类莱茵衣藻已用于许多光合作用研究(15)，比高等植物更广泛地显示状态转换。而在高等植物中，LHCII蛋白吸收的激发能只有一小部分被转移到PSI(13)，≈50%转入C.莱因哈迪(16). 此外C.莱因哈迪LHCI和LHCII配合物已被彻底表征(17-19). 在这里，使用一种用于分离叶绿素-蛋白质复合物的流线程序，我们分离出两种类型的复合物：来自状态1和状态2的正常PSI-LHCI超复合物，如参考文献中所述。20以及特定于状态2的PSI-LHCI超复合体。新获得的超复合体包含三个额外的LHCII多肽，其身份（CP29、CP26和LhcbM5）我们已明确确定。我们表明，三种LHCII多肽在状态转换期间在PSI和PSII之间穿梭，这与上述移动天线模型一致，并且我们基于本研究中确定的移动LHCII多肽提出了状态转换的分子模型。

结果

状态转换。传统上，状态转换是通过暴露于光1（700 nm）或光2（680 nm）来诱导的，以分别优先激发PSI或PSII。因为波长之间的差异很小，所以我们不希望出现完全跃迁。当LHCII天线蛋白在系统间质体醌池氧化后脱磷酸时，植物处于状态1。以类似的方式，当LHCII天线蛋白在系统间质体醌库还原后被磷酸化时，植物被置于状态2。我们用3-（3,4-二氯苯基）-1,1-二甲基脲处理细胞，它抑制Q的降低_B类在PSII中，使质体醌池在光照下氧化，使细胞处于状态1，并使用抑制LHCII蛋白磷酸化的staurosporine将其锁定在该状态。我们用羰基氰化物处理细胞第页-三氟甲氧基苯腙，一种通过耗尽ATP导致状态2转变的解偶联剂(21)和氟化钠，其抑制磷酸化LHCII蛋白的去磷酸化，从而使细胞锁定在状态2。通过使用这些状态锁定样品，我们获得了液氮温度下荧光光谱的显著差异(图1)这表明，在状态2条件下，更多的天线蛋白与PSI相关，并且已经建立了最佳实验条件。我们在以下实验中使用了这些条件。

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图1。

低温荧光光谱。荧光发射光谱C.莱因哈迪在77K下测量了锁定在状态1（细线）和状态2（粗线）的类囊体膜。激发波长为440nm。光谱归一化为688 nm的发射。

状态1和状态2类甲状腺中叶绿素-蛋白质复合物的比较。状态1类囊体在蔗糖梯度密度离心中产生三条绿色带(图2A类). 从梯度顶部看，A-1代表主要LHCII蛋白，A-2代表PSII核心复合物，A-3代表PSI-LHCI超复合物(22,23).

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图2。

在蔗糖密度梯度上分离的叶绿素-蛋白质复合物。类囊体C.莱因哈迪处于状态1的单元格(A类)和状态2(B类)溶解后进行蔗糖密度梯度离心。绿色带被指定为A-1、A-2、A-3和A-3′(顶部). 梯度分为20个部分，并进行SDS/PAGE。凝胶用库马斯亮蓝R-250染色(中部)或使用针对PsaA、PsbD（D2蛋白）、CP26、CP29或LHCII II型的抗体进行免疫印迹(底部). CP26、CP29和LHCII II型的位置中部用点表示。

状态2类囊体产生四条绿色带(图2B类). 状态1中的A-3含有29%的总叶绿素，而状态2中的A-2只含有18%的叶绿素。相反，在a-3下方出现了一条新的带，携带17%的叶绿素，被命名为a-3′。多肽分析和免疫印迹显示A-3′含有PSI和LHCI多肽(图2B类)，表明该PSI-LHCI超复合体的分子量高于先前报道的分子量。令人感兴趣的是，A-3′含有另外三种分子量为30-35kDa的多肽（由图中的点表示图2B类 中部). 免疫印迹分析表明，顶部和中部的条带分别为次要LHCII蛋白CP26和CP29(图2B类). 当我们用胰蛋白酶消化底部带并对其进行肽质量指纹分析时（表1，其发布为辅助信息在PNAS网站上），结果是主要的LHCII II型多肽，由LhcbM5型(LhcII-2型)基因(24). 在状态2中，所有LhcbM5、大多数CP29和少量CP26均出现在a-3′组分中(图2B类)而在状态1中，大多数LhcbM5、少量CP29和微量CP26出现在a-2（PSII）分数中。在较强的状态2增溶条件下，A-3′中出现的CP26更少（数据未显示）。这三种多肽的残留量出现在A-1（30-35kDa）中，这可能反映了在溶解和/或纯化过程中解离的多肽。综上所述，这些结果强烈表明CP26、CP29和LhcbM5在状态1下与PSII结合，在状态2下与PSI-LHCI超复合体结合。三种多肽与反应中心的结合能力不同，LhcbM5>CP29>CP26。

凝胶过滤色谱显示，状态1的a-3带的表观分子质量为≈700 kDa的单峰，状态2的a-3′的表观摩尔质量大于1 MDa，除PSI蛋白外，还含有CP26、CP29和LhcbM5(图3). 这些结果证实了A-3′中的PSI-LHCI超复合体具有更大的质量，因为它与额外的LHCII蛋白相关。免疫印迹分析表明，A-3′的主峰包含CP26、CP29、LhcbM5和PsaA，证实三种LHCII蛋白仍然与PSI-LHCI超复合物相关。

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图3。

A-3和A-3′的凝胶过滤色谱图。将状态1的A-3和状态2的A-3′装载到凝胶过滤色谱柱上。在280 nm处检测到蛋白质。指示了分子质量标记的位置(上部). 使用抗PsaA、CP26、CP29或LHCII II型抗体对30至68分钟的组分进行免疫印迹(下部).

免疫印迹显示A-3′中对应于CP29和LhcbM5的两条带被磷酸化(图4). CP26在A-1中磷酸化，但在A-3′中未磷酸化。A-3′中磷酸化CP26的缺失可能是由于组分中存在少量磷酸化CP24，而A-1中磷酸化CP的存在再次表明其与PSI的结合相当松散。这些结果与磷酸-LHCII蛋白在状态2迁移到PSI的模型一致。

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图4。

状态1和状态2的磷酸化多肽C.莱因哈迪类囊体。用抗磷酸苏氨酸抗体对来自状态1（S-1）和状态2（S-2）类囊体的A-1和A-3′带的多肽进行免疫印迹。代表S-1中A-3′带的样品（未观察到）对应于S-2中A-3’带的当量分数。

讨论

PSI和PSII分别主要位于类囊体膜的基质片层（未压缩）和堆积基粒（贴伏）区域(25). 许多证据表明，状态2下的LHCII蛋白位于未处理区域（基质板层）（例如，参见参考文献。11). 这一发现可能反映了基粒区的LHCII蛋白池与PSII分离，横向迁移，并将激发能量转移到基质板层区的PSI。当单元格切换到状态1时，可能会发生相反的过程。LHCII蛋白的这种可逆迁移被认为是PSI和PSII之间激发能重新分配的机制(5,13). 尽管通过显示PSI和PSII的吸收截面的互补变化，已经获得了LHCII与PSI和PSII在状态转变过程中可逆缔合的功能证据(26,27)支持LHCII蛋白与PSI和PSII物理关联的生化证据相当薄弱。尽管已经有多次尝试分离结合LHCII蛋白的PSI-LHCI超复合物(28-30)，没有一种能成功地获得与大量LHCII蛋白连接的高纯度PSI-LHCI超复合物。本研究表明，根据状态条件可逆结合到PSI-LHCI超复合体的三个LHCII蛋白是两个单体LHCII蛋白质（CP26和CP29）和一个主要LHCII蛋白酶（LhcbM5）。

图5显示了一个邻居加入的系统发育树C.莱因哈迪LHC蛋白质：九个主要LHCII蛋白质（LHCII）、两个次要LHCII蛋白（CP29和CP26）、九个LHCI蛋白质和一个远亲LHC家族LI818作为外群。该树显示主要LHCII蛋白的四个不同分支：I型(LhcbM6、LhcbM4、Lhcb2M3、Lhcb M8、和LhcbM9型)，II型(LhcbM5型)，类型III(LhcbM2型和LhcbM7型)和IV型(LhcbM1型). 四种主要LHCII蛋白C.莱因哈迪不对应于高等植物中的三种主要LHCII蛋白质，而次要LHCII蛋白CP29和CP26是保守的(24). 在我们鉴定为流动LHCII组分的三种多肽中，有两种是次要LHCII蛋白CP29和CP26，另一种是与次要LHCIII蛋白相对接近的主要LHCII蛋白质（II型）(图5). 有趣的是，在被认为与PSII相关的LHCII蛋白质中，这三种蛋白质与与PSI相关的LHC蛋白质（LHCI）的相似性最高。在高等植物中，三种次要的LHCII蛋白CP24/CP26和CP29与PSII-LHCII超复合体中PSII二聚体的每一侧相关，位于PSII二聚体和LHCII三聚体之间的界面(1,31). LHCII II型蛋白由LhcbM5型(LhcII-2型)基因(19)但从未在LHC制剂中进行过生化检测，这就对LHC的作用、表达水平和稳定性提出了质疑(17,19). 而基因组携带单拷贝LhcbM5型和LhcbM1型基因，另一个LhcbM公司基因至少重复一次(图5). 只有28个表达序列标签（EST）克隆与LhcbM5型发现于15000年以上莱因哈特藻ESTs，而编码其他主要LHCII蛋白的每个基因均大于122。较低的表达水平表明该蛋白的主要作用可能不是捕光(19). 然而，我们的结果表明，II型LHCII的积累水平与次要单体LHCII蛋白（CP26和CP29）相似，尽管其水平远低于I、III和IV型LHCII(图2).

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图5。

LHC蛋白的邻居连接系统发育树C.莱因哈迪。构建邻接距离树时，在适当的节点上显示引导值（1000个重复的%）。整个编码区，包括转运肽，用于对齐氨基酸序列。LI-818蛋白（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X95326”，“term_id”：“1865772”，“term_text”：“X95326“}}X95326型)被用作外部组。比例尺表示每个位点氨基酸替换的预期数量。

目前的结果令人惊讶，因为两个单体LHCII蛋白（CP26和CP29）长期以来一直被视为仅属于PSII复合体，而LhcbM5现在被假定在两个光系统之间穿梭，并充当LHCII三聚体与PSI和PSII反应中心之间的连接(图6). 然而，我们不能排除主要LHCII三聚体也参与状态转换的可能性。这种外围天线的松散结合将使使用当前程序很难从状态2类囊体中纯化含有LHCII三聚体的PSI超复合物。需要进一步研究以分离出PSI-LHCI/II超复合体，该超复合体在较温和的条件下保留三聚LHCII蛋白。

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图6。

LHCII蛋白从状态1到状态2的迁移的拟议模型。在状态1下，两个LHCII三聚体和三个单体[CP29、CP26和LHCII II型（LhcbM5），灰色圆圈]与PSII二聚体的每一侧相结合。当PSII过度激发时，LHCII蛋白被磷酸化（星号），并从PSII中分离出来。然后，通过使用单体LHCII蛋白作为对接位点，磷酸-LHCII三聚体与PsaH亚基附近的PSI重新结合。

在我们的工作模型中衣原体(图6)，我们将LHCII II型（LhcbM5）放置在高等植物PSII-LHCII超级复合体中CP24的建议位置(1). 当PSII过度兴奋时，LHCII蛋白被磷酸化。磷酸化LHCII蛋白从PSII分离并迁移到PSI，完成从状态1到状态2的转换。Scheller和他的同事(32)据报道，植物受到抑制磅/平方英寸基因表达在状态转换中高度缺乏，这表明PsaH亚单位可能是磷酸-LHCII蛋白的PSI对接位点。最近，当PSI-LHCI超复合体的晶体结构表明PsaH亚基位于PSI核的一侧，而PsaG/F/J/K亚基位于“LHCI带”的另一侧时，这一观点得到了加强(33). 在PsaH亚单位一侧似乎有足够的空间容纳几个LHCII蛋白。因此，当三种流动LHCII蛋白与PSI结合时，可能的结合位点可以在PsaH亚单位附近建模。德国等。(34)假设质量为40nm²在PSI-LHCI超复合体的单粒子图像中莱因哈特藻对应于三个LHCI单体。本研究中鉴定的三种单体LHCII蛋白可能位于同一区域。

PSI-LHCI超级复合体在C.莱因哈迪高于高等植物(34,35)也许是因为藻类有九个Lhca公司基因(图5)而高等植物只有四五株。PSI-LHCI复合物中至少有7个LHCI蛋白(23,36)并可能形成LHCI带的第二排，如参考文献中所述。35(图6仅描述了高等植物中观察到的一排LHCI带）。此外，C.莱因哈迪比高等植物更广泛地显示状态转换。由此推断，绿藻和高等植物中状态转换的潜在机制可能有很大不同。事实上，有报道称衣原体具有较宽但较少的贴伏类囊体层，并且光系统的横向异质性较少(37). LhcbM5被确定对绿藻的状态转换很重要，也可能是这一问题的线索，因为它在高等植物中没有同源物，尽管它与许多主要LHCII蛋白总体上相似。

最近发表的两篇论文通过重建PSI-LHCI/II超复合体的单粒子图像解决了与本研究类似的问题(38,39). 库伊勒等。(38)在光照2处理的洋地黄素固体类囊体膜中，观察到分配给LHCII三聚体的PsaH/L/a/K侧密度较大拟南芥树叶。然而，卡古尔等。(39)在PsaH附近观察到一个较小的密度，该密度被分配给CP29，在来自类囊体提取物的富含PSI的部分中衣原体细胞在黑暗中厌氧培养。这两份报告在流动LHCII的大小、位置和密度特征上相互矛盾。在本研究中，我们成功地从化学状态锁定的PSI-LHCI/II超复合体中进行了生化纯化衣原体并明确鉴定与超复合物可逆结合的LHCII蛋白。虽然我们的结果与Kargul的结果部分一致等。(39)，我们的制剂中检测到更多LHCII多肽，可能是因为本研究使用了彻底的状态锁定方法。低等LHCII多肽参与状态转换的现象有望在高等植物中得到阐明。

材料和方法

应变和介质。 C.莱因哈迪野生型（品系137c）是日内瓦大学J.-D.Rochaix赠送的礼物。细胞在高盐培养基中生长到中对数期(40)和5%（体积/体积）CO₂-20（状态1）或120（状态2）μmol/m光子的富集空气²每秒。

状态锁定胸腺素膜的分离。我们锁住了莱因哈特藻状态1或状态2的类囊体膜(21,41)并将其从细胞中分离出来，基本上如参考文献所述。42简单地说，对于状态1-锁定类囊体膜，我们将细胞与激酶抑制剂staurosporine（马萨诸塞州沃本市LC实验室）在100 nM下培养80分钟，然后在10μM 3-（3,4-二氯苯基）-1,1-二甲基脲（宾夕法尼亚州西切斯特市化学服务局）中培养10分钟，我们将细胞与磷酸酶抑制剂氟化钠（大阪Wako Pure Chemical Industries，Osaka）在100 mM下培养50分钟，然后在5μM羰基氰化物中培养第页-（三氟甲氧基）苯腙（Sigma）10分钟。用于制备类囊体膜的缓冲液包含25 mM Mes、0.33 M蔗糖、5 mM MgCl₂1.5 mM NaCl（pH 6.5），以及适用于上述每种状态的抑制剂（细胞破裂后10 mM的氟化钠除外）。使用BioNeb（Glas-Col，Terre Haute，IN）破坏细胞。

蔗糖密度梯度离心法分离叶绿素-蛋白质复合物。类囊体（0.8 mg Chl/ml）用0.7-0.8%溶解n个-十二烷基-β-d日-麦芽糖苷（日本熊本Dojindo实验室）在冰上放置30分钟。然后我们将溶液加载到蔗糖密度梯度上（0.1-1.3 M蔗糖/5 mM Tricine-NaOH，pH 8.0/0.05%n个-十二烷基-β-d日-麦芽糖苷）并在288000×克（SW41Ti；贝克曼）。

SDS/PAGE和免疫印迹。我们将梯度分为20个部分，并对其进行脲-SDS/PAGE(43)和免疫印迹(22). 我们使用一种合成的寡肽（CKGTASTKVKPSK）与半胱氨酸残基上的携带蛋白锁孔帽贝血蓝蛋白偶联，生成了一种抗CP26的抗体（Sigma Genosys）。通过蔗糖密度梯度离心和随后的DEAE-Toyopearl 650S（Tosoh，Toyo）色谱获得的富含LHCII-Ⅱ型的组分，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，针对纯化的多肽制备针对LHCII-II型的抗体。针对p9蛋白（CP29）产生针对CP29的抗体C.莱因哈迪)我们在之前的研究中纯化的(44). 抗磷酸三氢嘌呤抗体是从Zymed实验室获得的。

凝胶过滤色谱法。我们测试了A-3和A-3′带（参见图2)在FPLC系统（Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ）上使用Superose 6HR 10/30凝胶过滤色谱进行进一步表征。洗脱缓冲液含有50 mM Tris·HCl（pH 7.5）和0.05%n个-十二烷基-β-d日-麦芽糖苷。

肽质量指纹图谱。对应于LhcbM5的带用1μg/ml的胰蛋白酶（Promega）进行凝胶内消化(45)，通过肽质量指纹法确定其身份。质谱是在反射式MALDI-TOF质谱仪（Bruker）上进行的。

光谱分析。我们使用日立（东京）F-2500荧光分光光度计和R-928F红敏光电倍增管（日本滨松市滨松光子公司）在77K下测量稳态荧光光谱。激发波长为440 nm，激发狭缝和发射狭缝分别为10 nm和5 nm。

系统发育分析。如参考文献所述，我们进行了序列比对和系统发育分析。36，在适当的节点上显示引导值（1000个复制的%）。LHCI和LHCII蛋白质名称以Stauber命名等。(17)和Minagawa和Takahashi(19)分别是。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：Y.T.和J.M.设计了研究；H.T.和M.I.进行了研究；Y.T.和J.M.分析数据；M.I.、Y.T.和J.M.撰写了论文。

利益冲突声明：未声明冲突。

缩写：LHCI，捕光复合物I；LHCII，捕光复合体II；PSI，光系统I；PSII，光系统II。

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