多态性酵母白色念珠菌与许多病原体一样，它与宿主既有良性联系，也有致病性联系。念珠菌是共生菌群的一部分：据估计，健康人的胃肠道携带率>50%，口腔、肛门直肠和阴道携带率介于10%至20%之间(29). 在其致病状态下，它会引起多种疾病，包括常见的粘膜表现，如口咽鹅口疮和阴道炎。在住院患者中，播散性念珠菌病是第四常见感染（超过所有革兰氏阴性菌），死亡率超过30%(17,24,41). 由于治疗方案有限(18)下一代抗真菌药物的开发将需要进一步了解感染生物学。
响应分析念珠菌对巨噬细胞来说，这为了解生物体在第一次与免疫系统接触后所需的变化提供了一个窗口。一旦进入巨噬细胞念珠菌分化为丝状菌丝形式，可以穿透巨噬细胞，使其恢复增殖。这种内化和逃逸可以在体外系统中观察到白色念珠菌培养的巨噬细胞混合在一起。然而，很明显，形态发生的改变只是吞噬反应的一部分。一种更全面地分析这种遭遇的方法是将转录中的变化识别为念珠菌正在进行吞噬作用。
直到最近，转录研究还很有限，因为白色念珠菌不可用。然而，全基因组微阵列可用于分析相关但非致病性酵母的吞噬作用，酿酒酵母这些研究确定了乙醛酸循环的上调酿酒酵母被内化了。基于这些发现，乙醛酸循环也被发现在白色念珠菌并在小鼠模型中发挥重要作用(23). 乙醛酸循环在微生物毒力中的作用现已在许多生物体中报道，包括结核分枝杆菌(25)和植物病原体黄斑钩端螺旋体（真菌[14]),稻瘟病菌（真菌[40])、和法西氏红球菌（细菌[39]). 异柠檬酸裂解酶是乙醛酸循环的关键酶之一，在新生隐球菌（真菌）从脑脊液中分离出来，但在该模型中不需要毒力(33). 这些研究有助于证明对宿主-猪相互作用进行基因组分析的潜力。
最近完成的白色念珠菌基因组序列(http://sequence-www.stanford.edu/group/candida/index.html;http://candida.bri.nrc.ca/candida网站)可以在中直接进行基因组分析白色念珠菌这有望成为研究这种无性二倍体酵母的一个有价值的工具。形态发生的基因组研究(26,27)和对压力的反应(9)，血(10)和中性粒细胞(32)已经开始阐明复杂的转录程序白色念珠菌用于活体生存。这里我们确定了白色念珠菌被哺乳动物巨噬细胞内化后。吞噬作用刺激立即的转录反应。早期模式的特征是糖异生/乙醛酸途径的显著上调和翻译装置编码基因的下调。非丝质Δcph1Δefg1突变体(21)被内在化但无法逃脱的，在早期的模式中仍处于冻结状态。我们还发现了一种特殊的非代谢反应，与早期模式中嵌入的丝状结构不同，这种丝状结构对巨噬细胞接触所产生的压力作出反应。当细胞重新编程以逃离巨噬细胞并恢复快速生长时，早期的转录模式转换为后期的模式。这种反应在非致病性酿酒酵母强调了病原体/非病原体的二分法，揭示了白色念珠菌以逃避免疫。
材料和方法
菌株、培养基和生长条件。
这个白色念珠菌大多数实验使用野生型菌株SC5314(11). 这个Δcph1Δefg1（HLC54）和Δ元组1（BCa2-9）菌株已被描述(4,22).念珠菌如前所述，菌株在标准培养基中繁殖，包括YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）和YNB（0.17%酵母氮基，不含氨基酸，0.5%硫酸铵，2%葡萄糖(35)，除了饥饿实验中使用的介质（如下所述）。小鼠巨噬细胞系J774A（ATCC TIB-67）在37°C、5%CO、RPMI和10%胎牛血清（FBS）中生长2在正常空气中。
共培养条件。
在第-1天，收集、清洗巨噬细胞并用血细胞仪计数。共4×107将细胞接种在750毫升组织培养瓶中的RPMI加10%FBS中，并在5%CO中生长过夜237°C时。白色念珠菌菌株在37°C的YPD中用4%的葡萄糖培养过夜，以使细胞保持酵母形态。早上，将这些细胞稀释1:50并培养～4小时。通过离心收集培养物，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤并计数。过夜巨噬细胞培养物的重复细胞计数显示，细胞数略有增加，约为5×107每个烧瓶的细胞数。我们增加了10个8 白色念珠菌这些烧瓶中的细胞（a 2:1白色念珠菌/巨噬细胞比率），并培养1至6小时。对于对照培养物，为2×108 白色念珠菌将细胞接种到50 ml RPMI加10%血清的组织培养瓶中。用橡胶刮刀在冰水中刮取烧瓶收集细胞（以促进巨噬细胞溶解），并转移到50毫升锥形管中。试管在4°C下以3000 rpm的转速离心，用水冲洗两次，转移到1.5 ml的微量离心管中，并在干冰上冷冻。
营养饥饿状况。
SC5314在含有2%葡萄糖和0.5%硫酸铵的YNB中在37°C下培养过夜。将培养物稀释到相同的培养基中，达到600 nm（OD600)～0.5，增长两倍（至外径600约4小时）。通过离心收集细胞并用水冲洗一次。这些细胞用于接种OD处的新鲜培养基600约0.5。对于每个饥饿条件，培养基为1.7克酵母氮基/升，不含可用的氮或碳源。在该培养基中，我们添加了2%的葡萄糖（无氮）、0.5%的硫酸铵（无碳）、2%的醋酸钾和0.5%的硫酸铵盐（醋酸盐），或者什么都不添加（无碳和无氮）。我们也在YNB加上2%葡萄糖和0.5%硫酸铵（YNB完全）中培养细胞，作为富培养基对照。培养物培养1至3小时（对应于白色念珠菌在37°C条件下，在巨噬细胞实验中位于吞噬体内，并通过过滤收集。过滤器在50毫升锥形管中的干冰乙醇上冷冻。RNA直接从过滤器上收集的细胞中制备，如下所述。
RNA分离、微阵列杂交和数据分析。
通过热酸性苯酚协议从冷冻颗粒或过滤器中制备RNA(1). 对于巨噬细胞吞噬细胞和培养基单克隆对照，RNA通过cDNA方法扩增，使用Arcturus（加利福尼亚州山景城）的试剂盒。饥饿实验中没有扩增RNA。通过既定方案进行微阵列标记和杂交(http://microrays.org). 将所有实验条件与从～20个条件制备的mRNA的复杂参考混合物进行杂交（M.Lorenz、D.Inglis、a.Johnson和G.Fink，未发表的数据）。所有杂交都使用相同的参考RNA库，并且总是用Cy5标记。实验条件用Cy3标记。由于参考条件恒定，不需要进行染色实验。
使用Axon 4000B扫描仪扫描阵列，并使用Axon-GenePix程序提取数据。将每个阵列的数据归一化为一个恒定值，以均衡载玻片的荧光强度。由于高背景强度或低于背景斑点强度，GenePix程序中的标记斑点被从进一步分析中省略。
对于每种条件，我们至少进行了两次生物复制，每次杂交两次，每种条件至少进行四次阵列。平均每个基因的复制数据；具有不同重复的基因被丢弃。所有分析都是在同一时间点使用实验条件（通常加上巨噬细胞）与对照条件（单独培养基）的比值进行的。
聚类分析。
分层聚类(8)用于识别各种数据集中的调控模式。在最初的实验中，观察碳代谢和核糖体功能，模式很容易被发现，聚类只是用作数据可视化的工具。在随后的实验中（见图。和和表)聚类分析用于基因鉴定。对于分析中包含的任何给定基因，必须有至少90%的条件的可靠数据和最小方差（2-至2.5-log）2单位或4-5.6倍，取决于实验），在所有条件下，在最低和最高表达值之间消除表达没有实质性变化的基因。我们使用了三个数据集：野生型（SC5314）和Δcph1Δefg1（HLC54）菌株和野生型菌株在碳饥饿（在缺乏碳、缺乏碳和氮或含有醋酸盐作为碳源的介质中[见上文]）下的3小时时间过程，共19个条件。这些数据的聚类确定了饥饿和吞噬作用相关的基因（见图。)和差异调节基因。由于Δcph1Δefg1突变，227个差异调节基因被发现在多个簇中，为了可视化的目的，这些簇被组合并重新聚类以产生图。和补充图。（完整的标准化数据集和补充数据可从以下网址下载：http://www.lorenzlab.org).
吞噬作用广泛抑制翻译。在整个6小时的时间过程中，与翻译相关的基因表达数据的层次聚类。（A） 我们的阵列中包括所有54个核糖体蛋白。（B） 所有翻译起始因素(n个=23），平移延伸系数(n个=11）和细胞质tRNA合成酶(n个=20）在我们的数组中找到。基因名称来自酿酒酵母同源物。红色表示诱导基因，绿色表示抑制基因，黑色表示无变化。
饥饿和吞噬之间的相似性。野生型和Δcph1Δefg1菌株按饥饿条件（无氮无碳、无碳或醋酸盐作为碳源，每个条件有1、2和3h的时间点）进行聚类。（A） 巨噬细胞和饥饿上调的基因簇。与碳代谢相关的基因用黑线表示；营养转运蛋白由一条绿线表示。在这个集群中的66个基因中，有19个符合其中一个类别。（B） 下调集群。核糖体蛋白用黑线表示，tRNA合成酶用蓝色表示，翻译因子用橙色表示，糖酵解基因用紫色表示。在145个基因中，52个符合其中一个类别。
巨噬细胞标志表达簇。来自野生型和Δcph1Δefg1在不同的饥饿条件下，聚集了带有巨噬细胞的菌株和野生型菌株。该簇包含227个基因，这些基因通过巨噬细胞接触而非饥饿上调。所有显示的19个条件都聚集在一起；这三个实验的分离只是为了清楚起见。
表4。
| 类别 | 基因 | ORF19型 | 功能 |
|---|
| DNA损伤修复 | APN1型 | 7428 | AP内切酶（无嘌呤/无嘧啶DNA裂解酶） |
| CDC45型 | 1988 | 启动DNA复制所需 |
| HPR5型 | 5970 | DNA解旋酶参与修复 |
| POL2型油轮 | 2365 | DNA Pole，参与复制和修复 |
| POL30系列 | 4614 | 增殖细胞核抗原，用于复制和修复 |
| RAD57型 | 2174 | 复合和复合修复所需 |
| RDH54型 | 5367 | 复合和复合修复所需 |
| 细胞色素活性 | COQ3公司 | 3400 | 参与辅酶Q生物合成的蛋白质 |
| COQ4公司 | 3008 | 参与辅酶Q生物合成的蛋白质 |
| CYC3公司 | 1957 | 红细胞增多症c（c）合成酶 |
| FESUR1型 | 6794 | 泛醌还原酶 |
| 质量控制R2 | 2644 | 泛喹啉细胞色素c（c）还原酶 |
| RIB3级 | 5228 | DBP合成酶，核黄素生物合成 |
| 氧化应激 | CCP1型 | 7868 | 细胞色素c（c）过氧化物酶，破坏有毒自由基 |
| 墨西哥比索1 | 8675 | 甲硫氨酸亚砜还原酶 |
| GPX3系列 | 85 | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| GRE3考试 | 4317 | 木糖还原酶 |
| AYR1年 | 6167 | 推定氧化还原酶 |
| YPL088-1型 | 8893 | 假定氧化还原酶 |
| YPL088-4型 | 4477 | 假定氧化还原酶 |
| YBL064型 | 5180 | 推测的1-半胱氨酸过氧化物酶 |
| YHB1型 | 3707 | 无反应黄血红蛋白 |
| 国内流离失所者1 | 5211 | 异柠檬酸脱氢酶 |
| 金属稳态 | CIP1级 | 7761 | 镉诱导蛋白 |
| 频率3/CFL1 | 6139 | 铁还原酶 |
| FRE7公司 | 7077 | 铁还原酶 |
| CTR1号机组 | 3646 | 铜运输车 |
| ZRT2型 | 1585 | 低亲和力锌转运蛋白 |
| YFH1型 | 1413 | 人类frataxin同源物，铁稳态 |
结果
巨噬细胞-白色念珠菌共培养体系。
吞噬作用的转录分析涉及J774A小鼠巨噬细胞样细胞与白色念珠菌37°C组织培养基（RPMI加10%FBS）中的酵母细胞。在念珠菌/巨噬细胞比率为1:2，几乎所有（>98%）白色念珠菌细胞在共培养1小时内与巨噬细胞（附着或内化）相关联（图。). 这些细胞的极化生长最终会破坏巨噬细胞，破坏吞噬细胞并释放白色念珠菌单元格。我们测定了相互作用期间（接种后1、2、3、4和6小时）吞噬细胞在不同点的转录谱，并将这些转录谱与在没有巨噬细胞的情况下相同培养基中相同时间生长的细胞进行了比较（见材料和方法）。
体外白色念珠菌-巨噬细胞相互作用系统。白色念珠菌菌株SC5314在37°C的RPMI和10%FBS中孵育，有或没有巨噬细胞系J774A。在6小时的实验中，无论有没有巨噬细胞，芽管的形成都具有大致相同的动力学，可以从巨噬细胞中逃逸。
切换到营养不良的生长模式。
就可用营养素而言，吞噬体的分子组成基本上是未知的，但它不太可能是一个丰富的环境；特别是，我们不希望它含有大量的葡萄糖或其他糖。我们之前的工作证明了乙醛酸循环的诱导以及该代谢途径的毒力作用，与这一假设相一致(23)吞噬细胞的转录谱白色念珠菌细胞。
内化的早期反应反映了葡萄糖缺乏。
巨噬细胞内部环境的初始转录反应是从糖酵解到糖异生的转换（图。). 除了作为首选能源外，葡萄糖是其他大分子的前体，尤其是通过戊糖磷酸途径合成核苷酸，如果不可用，必须进行合成。总体情况显示了向糖异生生长的转变，以及碳可能从脂肪酸通过乙醛酸循环流向葡萄糖。
吞噬作用时替代碳代谢的完全诱导。β-氧化、乙醛酸循环、糖异生和糖酵解的途径如图所示白色念珠菌基因名称。给出了1小时的诱导率（即有巨噬细胞/无巨噬细胞），粗体字的基因至少调节了三倍。虚线箭头显示了这些途径的净反应：脂肪酸转化为葡萄糖。
吞噬细胞从糖酵解到糖异生的转变可以在这些途径不同的两个步骤中最清楚地看到（见图。); 这两项都是关键的费率限制监管措施。首先，相互转化果糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸的酶之间存在约30倍的表达差异。糖异生酶FBP1比对照细胞高9.6倍，而糖酵解PFK1和PFK2则分别被抑制～3.3倍。更引人注目的是对影响磷酸烯醇式丙酮酸水平的基因的控制，CDC19将其转化为柠檬酸盐（抑制10倍），而PCK1将其从草酰乙酸合成（诱导28.1倍）。因此，内化后，这些竞争酶之间的表达差异近300倍。与此相反，共有步骤被轻度下调（平均抑制2.5倍），这一发现与细胞代谢的普遍降低一致，如下所示。
在营养不良的条件下，从简单的碳化合物中生成草酰乙酸需要乙醛循环。我们之前已经证明，关键酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶（ICL1和MLS1）在这两种细菌的吞噬群体中都受到强烈诱导白色念珠菌和酿酒酵母(23). 微阵列数据证实了这一点白色念珠菌显示这些酶的诱导倍数为33.6倍和28.0倍。其他三种酶参与乙醛酸和三羧酸循环：乌头糖（ACO1）和柠檬酸合成酶（CIT1）分别上调3.5倍和8.9倍。第三种酶有三种亚型，苹果酸脱氢酶（MDH1），可诱导1.3倍、2.5倍和3.4倍。因此，所有乙醛酸步骤都在一定程度上被诱导（平均9.2倍）。未诱导非乙醛酸三羧酸循环步骤（比率为0.8；参见补充图。). 因此，转录谱显示了糖异生前体草酰乙酸是如何产生的，即通过乙醛酸循环。
我们的数据有力地表明，驱动乙醛酸循环的乙酰辅酶A（乙酰辅酶C oA）是脂肪酸β-氧化的产物。该途径的每一步（除了POT1的三种亚型；图。)显著上调。因此，转录谱显示了碳通过这三条生化途径从脂肪酸到乙酰辅酶a再到葡萄糖的清晰流动。
此外，还诱导了许多其他与乙醛酸分流相关的蛋白质（参见补充图。)包括转运蛋白、过氧化物酶体生物发生基因和乙酰辅酶A合成酶。这一途径的显著清晰性（几乎所有脂肪酸转化为葡萄糖所需的酶都被大量诱导），加上糖异生和糖酵解之间的明显差异（补充图。)这是引人注目的，并表明了替代碳源在体内的利用中具有极其重要的作用。我们以前的数据表明了这一点，但这些全基因组研究为这一建议提供了直接证据(23)吞噬作用诱导新陈代谢重新编程以产生葡萄糖。
在早期反应中，其他营养物质获取过程也被上调。
大量转运蛋白，包括多个寡肽转运蛋白（表)，在吞噬作用后也会被诱导。鉴于酿酒酵母具有两种已证实的（OPT1和OPT2）和一种推定的（YGL114w）寡肽转运蛋白，白色念珠菌这些基因有10个同源基因（所有基因的BLASTp e值都小于10−48). ScPTR2是一种肽转运蛋白，有三种白色念珠菌同系物（e值≤10−43). 这种多样性本身表明白色念珠菌在其生命周期的不同阶段，利用小肽作为营养物质。尤其是，肽的输入在巨噬细胞接触期间可能很重要，这一观点得到了几种分泌肽酶的巨噬细胞特异性诱导（见下文）的支持。吞噬体内这13个基因在1h时的平均诱导倍数为4.2倍，其中7个基因的诱导倍数大于4倍。显然，并非所有这些基因都是诱导的，但这可能表明这些基因的复制导致了调控专门化，使细胞能够对不同的条件作出反应。
表1。
| ORF公司 | 最接近的酵母 | BLASTp e值 | 表达式比率：
|
|---|
| 1小时（平均值=4.2） | 2小时（平均值=4.1） |
|---|
| 19.2292 | 选项2 | 10−170 | 33.5 | 80.9 |
| 19.11233 | 选择2 | <10−200 | 14.1 | 24.1 |
| 19.3718 | 选项2 | 10−73 | 19.9 | 20.5 |
| 19.3746 | 选项2 | <10−200 | 5.7 | 7.8 |
| 19.2584 | 选项1 | 10−48 | 4.9 | 6.7 |
| 19.6937 | PTR2型 | 10−180 | 5 | 4.8 |
| 19.3749 | 选项2 | 10−163 | 4.9 | 2.9 |
| 19.2602 | 选项1 | 10−81 | 3.6 | 2.7 |
| 19.5673 | 选项2 | 10−61 | 2.6 | 1.9 |
| 19.5770 | YGL114w型 | <10−200 | 1.3 | 1.2 |
| 19.4655 | 选项2 | <10−200 | 1 | 1.2 |
| 19.2583 | PTR2型 | 10−43 | 1.3 | 0.7 |
| 19.5121 | 选项2 | <10−200 | 1.3 | 0.5 |
除肽外，白色念珠菌诱导碳化合物的其他渗透酶，包括四种己糖转运蛋白同源物（3.7至7.5倍）、一种麦芽糖转运蛋白（6.0倍）、宽特异性氨基酸渗透酶（通用氨基酸渗透酶GAP1，29.8倍；二羧酸渗透酶DIP5，3.4倍；碱性氨基酸渗透酶CAN1，8.1倍）。还诱导了肌醇（ITR1，4.7倍）、多胺（UGA4，4.5倍）、钾（HAK1，6.9倍）和烟酸（TNA1，8.5倍）的转运子。总之，很明显，吞噬反应的一个主要组成部分是重组吸收和同化功能，以利用吞噬体中可利用的营养谱的改变。
早期的反应伴随着对翻译机构的大规模压制。
在诱导糖异生的同时，翻译装置的成分也发生了显著的下调。我们的数组包含78个预测值中54个的明确同系物酿酒酵母核糖体蛋白(30). 其余24个基因要么不存在于早期的基因组组合中，要么缺失于白色念珠菌（许多酿酒酵母核糖体蛋白重复），或在我们的PCR扩增中失败，以构建阵列。吞噬作用后1小时内，这54个基因平均被抑制5倍于单独培养基中培养的细胞（巨噬细胞/非巨噬细胞比率为0.21）。这些基因中只有11个受到<3倍的抑制（数据未显示）。这些基因的表达可以在图中的整个相互作用过程中看到。相反，在吞噬酿酒酵母核糖体蛋白基因的表达率为0.9，基本上表示表达没有变化（M.C.Lorenz和G.R.Fink，未发表的数据）。这种压制的速度和程度是惊人的，表明白色念珠菌（但不是酿酒酵母)立即识别巨噬细胞接触中固有的一些信号，并主动下调核糖体功能。
除了核糖体蛋白mRNA丰度降低外，翻译的其他方面也受到类似的抑制。与仅在培养基中生长的细胞相比，数十个编码翻译因子、核糖体生物生成活性、tRNA合成酶、RNA聚合酶I和III亚单位的基因被下调至少四倍。图显示了的表达式白色念珠菌所有已知的同源物（当可以找到明确的同源物时）酿酒酵母转录起始和延伸因子以及所有细胞质tRNA合成酶，共有54个基因。
这些基因的抑制协同作用是显著的。图中显示的108个基因中。，45被抑制至少四倍（未显示数据）。当我们将参与rRNA加工和核糖体生物生成的其他基因包括在内时，这个数字上升到56个与翻译相关的基因下调了四倍以上。的响应白色念珠菌与巨噬细胞接触比酿酒酵母（表)，调控基因>500个>4倍白色念珠菌与～50英寸酿酒酵母这可能是病原体和非病原体之间的重要区别。
表2。
| 有机体 | 基因数量一:
|
|---|
| 诱导 | 压制 |
|---|
| 白色念珠菌 | 339 | 206 |
| 酿酒酵母 | 31 | 22 |
与细胞质翻译机制的调节相反，线粒体翻译似乎基本上不受吞噬作用的影响。～50线粒体核糖体组分在1小时时的表达率为0.8（数据未显示）。这与线粒体活性在吞噬应激过程中的重要作用一致。乙醛酸循环和β-氧化（如上所示，在这些条件下都会被显著诱导）都需要线粒体对这些途径片段的活性。此外，氧化剂的中和需要线粒体（见下文）。
延迟反应：早期转录轮廓的重塑。
最初对吞噬作用的强烈反应（诱导交替碳代谢[参见补充图。]和抑制翻译[图。])当细胞开始逃离巨噬细胞时被调节。因此，这种互动的后期阶段包括白色念珠菌释放后恢复快速糖酵解生长模式。表显示了参与上述营养调节过程的基因的早期（1h）和晚期（6h）表达比率的比较。到6小时，碳代谢和翻译机制显示出与从未见过巨噬细胞的细胞基本相同的表达水平。补充图。跟踪每个基因在早期（1h）时间点的表达（上调或下调）>4倍。诱导基因和抑制基因在数量和时间上的相似性是惊人的。到6小时，诱导和抑制的基因集都已恢复到接近控制的表达（平均诱导1.5倍，抑制1.4倍）。
表3。
| 过程 | 基因数量一 | 表达式级别b条地点：
| 比率（6小时/1小时） |
|---|
| 1小时 | 6小时 |
|---|
| 核糖体蛋白质 | 54 | 0.21 | 0.81 | 3.9 |
| 乙醛酸循环 | 4c（c） | 13.1 | 1.39 | 0.11 |
| 糖异生d日 | 2 | 12.7 | 0.61 | 0.05 |
| 糖酵解d日 | 三 | 0.20 | 1.10 | 5.4 |
| 其他翻译e（电子） | 55 | 0.40 | 0.82 | 2.1 |
与形态发生开关的关系。
这些转录变化与从酵母形态到菌丝形态的转变一致，这就提出了一个问题，即这些模式是吞噬作用所特有的，还是形态发生的结果。我们的数据表明，形态发生与上述转录反应无关。如图所示。与巨噬细胞接触的细胞相比，对照组的纤丝速度基本相同。两个种群生长的组织培养基具有中性pH值（～7.4），含有10%的血清，温度为37°C，所有条件都能促进菌丝分化。与酵母到菌丝转换相关的基因，如电子控制1和硬件P1(三,36)，在丝状细胞中被显著诱导，而与巨噬细胞的存在无关（数据未显示）。由于巨噬细胞生长的细胞和对照细胞中的这种平行形态发生，菌丝标记基因不在巨噬细胞接触特异性诱导的基因之列。碳代谢的改变和翻译相关基因表达的减少仅发生在接触巨噬细胞的细胞中。该分析证实了我们最初的假设，即形态发生仅代表吞噬反应的一个片段，并且存在潜在的丝状依赖性代谢成分。
识别非营养反应。
这些数据提供了强有力的证据，证明吞噬细胞发生了巨大的代谢变化，表明营养应激——需要找到可用营养素的可利用储存——是吞噬作用早期反应的重要部分。随着时间的推移，早期模式消失，并被晚期模式取代。然而，很明显，吞噬作用也调节着许多非代谢基因。然而，考虑到大量的新陈代谢变化，很难评估其重要性，所以我们设计了进一步的实验（图。)以验证这些附加响应。首先，我们使用了一个非丝状突变体，它改变了念珠菌-巨噬细胞相互作用。此外，我们在体外使用了一系列饥饿条件来确定在缺乏巨噬细胞接触导致的其他线索的情况下发生的转录反应。
附加阵列实验示意图。（A） Δcph1Δefg1菌株（HLC54）和巨噬细胞。因为这种菌株是非丝状的，它无法逃离巨噬细胞。（B） 体外饥饿实验示意图。在富含碳和氮的最小培养基中预培养的细胞被转移到缺乏氮或碳（或两者）的培养基中。与条件1（含碳和氮的培养基）相比，计算每个条件下每个基因的比率。
非丝状突变体只显示早期反应。
这个Δcph1Δefg1在大多数菌丝诱导条件下，菌株不能长丝(22)因为它缺乏对MAP激酶信号（CPH1）和环AMP信号（EFG1）都有反应的转录因子(12,16,20,21,37). 正因为如此，它在吞噬作用后无法逃离巨噬细胞（图。). 尽管突变细胞被“困”在巨噬细胞内，但它们并没有被杀死。事实上Δcph1Δefg1在6小时实验期间，细胞在巨噬细胞内大约经历一次倍增，这是通过使用标准XTT染料转化试验确定的（数据未显示）。
为了分析无法逃离巨噬细胞的细胞的反应，我们从Δcph1Δefg1菌株HLC54与巨噬细胞在1-6小时的时间过程中。将转录谱与同一菌株在同一培养基中生长相同时间进行比较。这些数据与来自野生型数据集的数据进行了聚类。分析（图。数据未显示）表明，这两个实验之间的基因调控大致相似，尤其是代谢基因，只是表达变化往往持续存在于Δcph1Δefg1诱捕在巨噬细胞内的突变体。无法逃离巨噬细胞的细胞维持早期转录模式证实了这种模式是由巨噬细胞环境产生的，并明确区分了早期和晚期程序。
同样，我们使用了组成丝状菌株来证明，我们归因于巨噬细胞吞噬作用的转录谱确实是由于摄入而不是其他因素，例如培养基中未检测到的变化。TUP1是一种全球转录阻遏物，是丝状生长和Δ元组1菌株以假菌丝的形式被锁定(4). 由于这些细长细胞链的尺寸较大，巨噬细胞对其吞噬能力较差。在这个实验中，我们发现有微生物吞噬和无微生物吞噬条件之间几乎没有变化（数据未显示）。虽然Δ元组1突变具有多效性效应，本实验中有限的转录反应确实表明，暴露于巨噬细胞内部环境对于我们观察到的变化确实是必要的。
在体外鉴定饥饿状况。
上述巨噬细胞摄取细胞的情况与观察到的情况非常相似酿酒酵母体外失去营养的细胞(7). 抑制转换和激活交替营养代谢都是这种反应的特征。要在中确定特定响应白色念珠菌对于巨噬细胞接触，我们通过分析几种营养不良条件下的转录谱，筛选出饥饿导致的转录变化。
我们将生长在含有充足葡萄糖和首选氮源（YNB；2%葡萄糖和0.5%硫酸铵）的最小培养基中的细胞转移到缺乏碳、氮或两者兼有的培养基中，并在转移后1、2和3小时收集细胞（如图所示。). 由于上述乙醛酸循环的诱导，我们还包括了一个条件，即醋酸盐是唯一的碳源。我们创建了饥饿条件下每个基因的表达比率，与相同时间内转移到原始YNB培养基（2%葡萄糖和0.5%硫酸铵）的细胞相比（例如，1小时无碳条件与1小时富YNB条件的比率）。这些数据将在下文中进行更全面的讨论，它们清楚地描述了吞噬细胞和饥饿细胞转录谱之间的相似性和重要差异。
巨噬细胞特征表达谱。
我们将吞噬野生型和突变型细胞的数据与饥饿状况相结合，并使用层次聚类法确定饥饿、野生型菌株中早期基因表达模式和突变型中持续模式之间的相似性和差异。相似之处，如图。主要包括交替碳代谢（在诱导基因中）和翻译活动（抑制基因）。从这些数据中可以清楚地看出，吞噬细胞和饥饿之间的相似之处仅限于缺乏碳源的细胞。缺氮细胞显示出明显不同的基因表达模式，与摄入细胞几乎没有重叠（数据未显示）。由于这个原因，氮缺乏数据集被排除在进一步分析之外。
其他集群强调了饥饿和摄入情况之间的差异。227个这样的基因簇如图所示。（该图的注释版本以及随附的基因名称可作为补充图。). 这些基因大多上调；我们发现相对较少的巨噬细胞抑制基因不受营养限制的调节。包括Δcph1Δefg1该分析中的数据也使我们能够确定这种反应的各个方面可能受到这些转录因子之一或两者的调节。图的顶部。显示了在吞噬的野生型细胞中诱导的几个基因，但在Δcph1Δefg1; 这些基因可能受到这些转录因子的正调控。底部是突变株中诱导更强的基因，可能受到CPH1或EFG1的抑制。
精氨酸生物合成。
我们的控制条件非常成功地从巨噬细胞诱导的图谱中消除了代谢基因。精氨酸生物合成是一个明显的例外；除一种酶（ARG2）外，其他所有酶都受到强烈诱导，这九个基因在1小时内平均上调5.6倍。精氨酸基因是唯一以这种方式调节的氨基酸代谢基因。由于巨噬细胞样品和对照生长的基础组织培养基富含包括精氨酸在内的所有氨基酸，因此在进入巨噬细胞之前，精氨酸饥饿不太可能导致该途径的特异性诱导。目前尚不清楚为什么精氨酸代谢会以这种方式受到特异性调节。
运输工具。
在227个基因中，17个编码各种化合物的转运体。其中五种是寡肽转运蛋白，再次表明寡肽在这种环境中的导入作用。此外，该簇包括氨肽酶I（ScLAP4）、羧肽酶Y（ScPRC1）、二肽基氨肽酶（ScDAP2）、蛋白酶B（ScPRB1）的同源物，以及天冬氨酰蛋白酶的弱同源物（不是SAP基因之一）。因此，很明显，蛋白质水解和小肽的利用对吞噬存活很重要。
此外，还有亚硫酸盐、磷、胆碱、氧化羧酸盐和尿囊酸的转运蛋白。还诱导了几种金属转运体；这些将在下文中讨论。
压力反应。
吞噬巨噬细胞将释放活性氧和氮化合物，作为抗菌爆发的一部分(6). 我们模型中使用的培养J774A细胞具有相对较弱的氧化爆发；足以杀人酿酒酵母但不是白色念珠菌类似地，J774细胞杀死大肠杆菌（通过DNA损伤）但不致病肠道沙门菌伤寒血清型菌株(34). 表中列出了许多基因有助于解毒这些自由基，包括几种过氧化物酶和还原酶。此外，对解毒至关重要的细胞色素电子传递系统的许多方面也被诱导（表).
铁稳态在细胞中至关重要，因为铁是细胞色素活性的必要辅因子，是几种抗氧化蛋白（如氧化还原酶和超氧化物歧化酶）的电子受体，使铁的吸收和储存成为氧化应激反应的一个关键方面。铁的吸收在缺铁的宿主体内尤为重要。许多病原体分泌铁载体和/或高亲和力吸收系统来获取铁。白色念珠菌也不例外，这些系统在毒力方面是必需的(13,31). 在这个簇中，我们发现了两种跨膜铁还原酶的同源物，这两种酶对铁的吸收很重要。金属离子内稳态是相互依赖的，将铁的可用性与铜和锌等其他金属的可用性联系在一起，这两种金属的转运蛋白上调，镉诱导蛋白CIP1也是如此。
氧化应激的结果是DNA和蛋白质损伤。一个热休克蛋白（HSP78）被诱导，DNA重组-修复系统的多个方面也被诱导（表). 特别是，介导碱性位点修复的基因上调，这是DNA氧化损伤的常见表现。总之，巨噬细胞引起的氧化应激可通过白色念珠菌通过应激反应的激活，包括电子传递、金属稳态和DNA损伤修复的改变。这些变化足以保持白色念珠菌在这些条件下活着。
未知基因。
诱导基因的最大类别包括那些与已知基因没有同源性的基因。这些是常见的；在我们的注释中，“孤儿”基因约占基因组的18%。这可能是因为这种在真菌中罕见的共生/病原体性质导致了许多基因的进化，以支持这种生活方式。如果是这样的话，人们可能会认为这些基因在体内特别重要，并且会在与发病相关的条件下被诱导，例如在我们的巨噬细胞试验中。事实上，我们的聚类中有36%（227个基因中的81个）是未知的，这是一个显著的过度表达。相反，约13%的基因组与酿酒酵母功能未知的基因，而巨噬细胞诱导簇中只有10%是未知的。因此，总的来说，我们簇中近50%的基因功能未知，并且大多数这些基因是唯一的（此时）白色念珠菌将这组序列与其他致病真菌进行比较将非常有趣，因为这些序列的发布是为了测试我们的假设，即这些很可能是病原体适应。
讨论
全基因组阵列的使用已经确定了摄入白色念珠菌由巨噬细胞引起。早期反应是碳代谢的广泛重塑：细胞从糖酵解转变为糖异生。转录谱显示，脂肪酸转化为葡萄糖所需的每个基因都有明确的诱导作用。这种重构伴随着翻译相关基因的大量下调。后期反应是糖酵解的恢复和翻译机制的恢复。大多数重编程事件在相关酵母中都没有发生，酿酒酵母这可能是共生/病原体之间差异的基础(念珠菌)和环境(酵母菌属)生活方式。
从糖酵解到糖异生的转变表明巨噬细胞缺乏葡萄糖。先前的报道表明，葡萄糖的来源可能是乙酰辅酶A(23). 我们的发现支持了这一观点，即脂质降解的酶也在念珠菌吞噬作用。这意味着脂质来源于念珠菌或者从巨噬细胞的内部环境中作为乙酰辅酶A的前体。几份报告表明，吞噬细胞会释放各种脂质-念珠菌相互作用，包括真菌磷脂多糖(15)和哺乳动物花生四烯酸(5). 这些产品是否可以作为白色念珠菌尚不清楚，但有一些证据表明这种环境中存在脂质。
在抑制糖酵解的同时，还诱导了碳的替代利用。这是意料之中的，因为糖异生和糖酵解的同时活动将导致葡萄糖合成和降解的无效循环，这是不受欢迎的(28). 奇怪的是，这正是白色念珠菌在人体血液中培养，可诱导糖酵解和糖异生(10). 最可能的解释是，这代表了这个复杂系统中的多种细胞群，血液中的自由活细胞（存在葡萄糖）和被中性粒细胞和单核细胞吞噬的细胞同时存在。
伴随着碳代谢的剧烈变化，吞噬细胞迅速而全面地下调编码翻译机制的基因。在诱导糖异生转录物的同时，翻译装置的这种下调提出了一个有趣的难题：当翻译受到抑制时，细胞如何表达糖异生蛋白？据推测，这种行为反映了翻译级别上的其他控件。细胞必须改变翻译机制，以便只翻译一部分信息（例如与糖异生有关的信息）。一般翻译的减少，加上特定信息翻译的增加酵母菌属从可发酵的碳源转移到不可发酵的碳源(19).
另外的实验确定了一组对巨噬细胞接触有特异性反应的基因。这些包括诱导氧化应激反应、DNA损伤修复、精氨酸生物合成、肽利用和大量白色念珠菌-特定基因。氧化应激可能是由于巨噬细胞活性氧和氮物种的爆发造成的。这种氧化应激会损害DNA，特别是通过产生碱性位点。因此，白色念珠菌认识到细胞损伤和特定的营养需求或机会，并做出相应的反应。这种快速反应可能有助于体内存活。
转录的晚期反应与从酵母形式到丝状形式的形态发生转换一致。这种模式涉及翻译机制转录物的恢复、糖酵解的激活和应激反应的下调（图。). 在进行酵母-菌丝转换的对照培养物中没有发生这些变化。此外，仍以酵母形式存在的突变体（Δcph1Δefg1)未能重新编程，且未显示延迟响应。这些数据为感染过程中代谢和形态发生程序的分离提供了有力证据，并表明晚期基因表达程序的启动依赖于吞噬后事件的正确发生。
的摘要白色念珠菌吞噬反应。吞噬诱导白色念珠菌与单独培养基中的细胞相比，采用较慢的生长程序，诱导应激反应和交替碳代谢。然后，形态发生反应允许逃逸，而这些适应被逆转。
主要环境生态位白色念珠菌通常被认为是热血动物的肠道(29). 适应这种环境中生存的一种表现可能是“念珠菌-特定”基因，即与其他生物体中的基因缺乏同源性的基因。如果念珠菌-特定基因实际上是对宿主环境的适应，我们可能会看到它们在相关条件下过度表达。事实上，在我们的注释中，这种独特的基因代表了整个基因组的18%，但是巨噬细胞特征簇的两倍（36%）。这组基因（重要的是，缺乏人类同源物）是开发抗真菌靶点的理想候选基因。
转录可塑性白色念珠菌可能对其在不同环境中生存的能力至关重要。白色念珠菌在胃肠道、口腔和阴道中作为共生体存活。例如，肠道中生存所需的表型可能与阴道中的表型不同。虽然在这些位置生长的细胞没有全局特征，但此处描述的巨噬细胞吞噬细胞的转录程序与从白色念珠菌与中性粒细胞接触的细胞(32). 这进一步支持了这些反应的可塑性，并表明白色念珠菌它不仅能够经历快速的大规模变化，而且能够识别甚至细微的差异，例如它是被巨噬细胞还是中性粒细胞攻击。事实上，应该注意的是，这里描述的实验只使用了一种培养的巨噬细胞细胞系，我们预计在白色念珠菌初级巨噬细胞吞噬的细胞具有更强的抗真菌活性。这些实验正在进行中。The ability of白色念珠菌在切换到早期程序期间进行这些改变显然对其在巨噬细胞中的存活至关重要，因为Δcph1Δefg1以酵母形式和早期程序冷冻的突变体存活下来，而酿酒酵母没有。此外，由于这两种生物都诱导乙醛酸途径，这种代谢转换是必要的，但不足以生存。据推测，早期模式的其他成分提供了免受巨噬细胞攻击的保护。全基因组阵列已经允许识别这些系统，现在可以评估其在发病机制中的作用。
