重症急性呼吸综合征冠状病毒全长感染性cDNA的反向遗传学研究

摘要

严重急性呼吸综合征（SARS）是一种危及生命的呼吸道疾病，可能于2002年秋季起源于中国广东省(1,2). 一种以前未被描述的冠状病毒（CoV），从发热和垂死的患者中分离出来，是导致该病的病原体(三–8). SARS-CoV感染与总病死率相关，据认为接近≈14-15%，选定人群的风险增加(www.who.int/csr/sars/archive/2003_05_07a/en). SARS-CoV感染者>8000人，导致>800人死亡(www.who.int/csr/sars/en)之前，积极的感染控制措施成功控制了疫情的范围。尽管进行了大量的努力，但还没有描述出有效的抗病毒治疗SARS的方法。

CoV是Nidovirus目的成员，包含自然界中最大的单链阳性RNA基因组，分为三个主要血清组，第一组CoV：传染性胃肠炎病毒（TGEV）和人CoV 229E（HCV-229E），第二组：小鼠肝炎病毒（MHV）和牛CoV，第三组：传染性支气管炎病毒（IBV）虽然初步的系统发育比较表明SARS-CoV可能代表IV组的原型菌株(6,8–10)，最近的分析将SARS-CoV描述为第二组中的早期分裂(11). SARS-CoV基因组RNA的长度约为29700 bp，在亚基因组和全长mRNA中有几个大的ORF编码(8–10). 亚基因组mRNA包括一组嵌套的3′-共端分子，其中编码在基因组5′端的前导RNA序列在包含高度保守一致序列（CS）的不同转录调控序列处连接到身体序列。准确的SARS CS被预测为CUAAAC或AAACGAAC(8,9). SARS-CoV基因组长度RNA可能由多个50-kDa核衣壳蛋白包被（N）(8). 与其他CoV一样，病毒粒子包含几种病毒结构蛋白，包括约140 kDa（S）的尖峰糖蛋白、23-kDa膜糖蛋白（M）和约10-kDa E蛋白。

CoV基因1或复制酶基因包含基因组的三分之二。MHV和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒包含两个重叠的ORF，ORF1a和ORF1b，它们通过核糖体框架移位连接(图1A类). 在MHV中，有三种蛋白酶，木瓜蛋白酶样蛋白酶1和2(11–14)和3C类蛋白酶，介导多蛋白裂解成至少15种成熟蛋白质(11,15). SARS病毒复制酶基因预计只编码木瓜蛋白酶样蛋白酶2和3C样蛋白酶(6,7).

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图1。

全长SARS-CoV cDNA的组装。(A类)SARS-CoV基因组的结构(8,9). SARS Urbani≈29727-bp基因组包含10个或更多ORF，这些ORF由全长和亚基因组mRNA表达(8). (B类)几个Bgl公司组件克隆之间插入I-互连连接，以组装全长cDNA。小写字母表示WT序列，数字表示基因组中的核苷酸位置。(C)“不见了”阿尔我修复SARS同胞克隆。星号代表突变位点。粗体数字代表组成一致的SARS F亚克隆的兄弟克隆的部分。

持续的多蛋白加工对病毒的持续转录至关重要；因此，MHV复制对阻止复制酶处理的蛋白酶抑制剂敏感(12). 据预测，从复制酶多聚蛋白加工的蛋白质还具有其他功能，包括RNA依赖的RNA聚合酶（pol）、RNA解旋酶（hel）、限制酶活性和几种假定的RNA加工酶活性(6,11,16). 在本文中，我们使用一种方法从基因组全长cDNA中恢复重组SARS-CoV，该方法允许对SARS-CoV蛋白功能和复制进行快速遗传分析。

实验程序

病毒和细胞。SARS-CoV的Urbani和Canadian株（Tor-2和Tor-7）在添加了10%FCS、卡那霉素（0.25μg/ml）和庆大霉素（0.05μg/ml₂孵化器。VeroE6细胞培养物以0.1倍感染率感染30分钟，然后清洗，并通过菌斑试验进行滴度测定。感染后1小时，用半胱氨酸蛋白酶抑制剂处理一些培养物（2S公司,3S公司)-转环氧琥珀酰基-我-亮氨酸氨基-3-甲基丁烷乙酯（E64-d），浓度为500μg/ml。感染后2d中性红染色可见病毒斑块。如有或无E64-d所述，生长MHV-A59(12,17).

SARS-CoV cDNA克隆策略。使用SuperScript II、寡核苷酸引物和SARS感染培养物的细胞内RNA进行逆转录(17,18). cDNA在94°C下变性2分钟，并使用Expand Long TAQ聚合酶（罗氏分子生物化学）在94°C:30秒、58°C:25-30秒和68°C:1-7分钟下进行25个周期的PCR扩增。扩增子克隆到Topo II TA（Invitrogen）（SARS亚克隆D-F）或pSMART载体（Lucigen、Middleton、WI）中（SARS亚克隆A–C）。基于对四到七个兄弟克隆的独立序列分析和已报道的Urbani序列，将所有cDNA组装为CS(8). 以下引物用于SARS A亚克隆的分离（正向，tactatacgactacatagatattaggtttaccaccagg-1，反向，acacatatcaacgatgcc-4452）；SARS B亚克隆（正向，gcctatatgatgttagat-4359，反向，tgaaccccccgctgtaaacc-8727）；SARS C，子克隆（正向，agccagtgtgtcatac-8710，反向，aggctctgtggcataag-12085）；SARS D亚克隆（正向，actgccagagatgcctatgagc-12070，反向，cagccagggcagacttcacaacc-18939）；严重急性呼吸系统综合征E亚克隆（正向，gtctgccccctgctgataagtttccag-18923，反向，gagcagccgtaggcagcaat-24066）；和SARS F子克隆（正向，attgtgcctacacctgtc-24045反向，（ttt）₇gtcatctcctaagagc-29710）。

为了修复兄弟克隆，设计了包含IIS类限制酶的引物对，如阿尔I.通过使用高保真PCR，扩增不同同胞克隆的共识部分，并用阿尔一、 并连接到质粒中。这个阿尔I连接旨在无缝连接共识片段，从而为每个SARS cDNA亚克隆生成全长cDNA片段(17). 通过使用自动化应用生物系统DNA测序仪，对两到三个候选DNA进行测序，以确定一致克隆。

一个全长严重急性呼吸系统综合征冠状病毒cDNA的系统组装。SARS A–F插入物被限制，通过0.8%琼脂糖凝胶分离，用暗读灯箱（Clare Chemical Research，Dolores，CO）观察，切除并使用Qiaex II DNA纯化试剂盒纯化。隔夜结扎SARS A+B、C+D和E+F亚克隆并分离(17,18). 将SARS AB+CD+EF cDNA在4°C下结扎过夜，提取苯酚/氯仿并沉淀。已生成成绩单在体外（TmMessage mMachine，Ambion），如制造商所述，并进行了某些修改(17). 对于SARS N转录物，用SP6 RNA聚合酶以2:1的cap类似物与GTP的比率转录1μg编码N基因的质粒DNA（引物：5′-nnggctcgatgccatttaggtgacacatatatgatggacccaatc-3′和反向引物（5′-nnnnttttttttttt ttttttdtttttttgcctgagtgaatcagcagcag-3′）。

全长转录本的转染。将RNA转录物添加到800μl BHK细胞悬浮液（8.0×10⁶)，并使用基因脉冲器II电穿孔器（Bio-Rad）在25μF下发出三个850 V的电脉冲(17,18). BHK细胞接种1.0–2.0×10⁶75-cm中的VeroE6细胞²烧瓶，37°C孵育2 d。然后通过菌斑试验纯化病毒子代。对于荧光抗体染色，细胞在PBS中清洗，并在室温下与山羊血清孵育20分钟。清洗细胞，用1:200稀释的MHV多克隆抗血清孵育，该抗血清与SARS N蛋白发生交叉反应，然后在1:400稀释的Alexa 488中孵育30分钟。细胞在10%中性磷酸盐缓冲福尔马林中固定24小时，冲洗30分钟，并在荧光显微镜下观察。

检测插入传染性克隆（ic）SARS-CoV的标记突变。感染后24小时，从WT或icSARS-CoV感染细胞中分离出细胞内RNA。在RT-PCR后，我们获得了1668-nt扩增子（核苷酸位置1007-2675），跨越Bgl公司我在icSARS-CoV组分克隆中消融的1557号位置进行了定位，但没有在WT SARS-CoV中消融。其他PCR产物包括一个跨越SARS-CoV B/C连接的799-nt扩增子（核苷酸位置8381–9180）、一个跨越SAS-CoV C/D连接的544-nt扩增子跨越SARS-CoV E/F接头。对含有1594nt SARS E/F连接的扩增子进行亚克隆和测序。

含铅成绩单的RT-PCR。通过使用基因组3′端的引物（5′-ttttttttttt gtcatctcctaagagc²⁹⁷¹⁰-3′）或在X5或X3 ORF中（5′-ttaattattgtgcgtataaaacaaca^28091′-3′，5′-tatattattatgatgatatctaactcataggttct²⁷²³⁸-3′）和SARS先导RNA序列中位于基因组5′末端（5′-aaaccaaccccgatc-3′；核苷酸26–35）。将含铅扩增子亚克隆到TopoII载体中并测序。

结果

SARS全长cDNA的组装。对迫切出现的病原体的快速反应和控制需要一种快速生成全长cDNA的方法，分子克隆病毒可以从中被拯救出来，从而允许对基因组进行基因操作。使用多种方法分离TGEV、HCoV-229E、IBV和MHV-A59的全长cDNA(17–21). 我们的策略包括一组跨越整个CoV基因组的cDNA，这些cDNA可以通过以下方式系统地定向组装成基因组长度的cDNA在体外结扎(17,18). SARS基因组被克隆为六个相邻的亚克隆，可以通过独特的Bgl公司Ⅰ限制性内切酶位点(图1).Bgl公司I是一类IIS限制性内切酶，可裂解对称序列GCCNNNN^↓NGGC但留下64个不同的不对称端。因此，成对的相邻亚克隆编码了连接，允许中间产物单向组装成全长cDNA。如所示图1A类，两个Bgl公司I连接源自SARS-CoV基因组中编码的位点，位于核苷酸位置4373（A/B连接）和12065（C/D连接）(8–10). 第三个Bgl公司核苷酸位置1577的I位点被移除Bgl公司通过将沉默突变引入SARS-CoV序列，在核苷酸8700（B/C连接）、核苷酸18916（D/E连接）和核苷酸24040（E/F连接）插入I位点(图1B类). 如MHV和TGEV所述，SARS-CoV序列毒性通过破坏毒性结构域和使用稳定的克隆载体来规避(17). 由此产生的cDNA包括SARS A（核苷酸1–4436）、SARS B（核苷酸4344–8712）、SARS-C（核苷酸8695–12070）、SARSD（核苷酸12055–18924）、SARSE（核苷酸18907–24051）和SARS F（核苷酸24030–29736）亚克隆。SARS A亚克隆包含一个T7启动子，SARS F亚克隆终止于21T，允许在体外多聚腺苷封端转录物的转录。

编码特定SARS cDNA片段的四到七个兄弟亚克隆中的每一个都出现了大量突变(图1C). 为了快速组装一致性克隆，我们使用了类IIS限制性内切酶，它们在非对称位点切割并留下非对称末端。这些酶产生特定于股的独特悬链，允许无缝连接两个cDNA，并伴随限制位点的丢失(17). 如SARS F同胞亚克隆所示，设计了包含末端的引物Aar公司I（CACCTGCNNNNN^↓NNNN）的网站，位于不同兄弟克隆的不同共识部分的两侧。在某些情况下（同胞克隆1和4中的扩增子3和2），引物修复了位于给定扩增子末端附近的特定突变(图1C). 结合高保真PCR、寡核苷酸引物修复和序列片段的无缝连接(17)，为SARS A、B、C、D、E和F亚克隆中的每一个快速生成Urbani共有cDNA(图1C). 全长结构中保留的无声变化包括核苷酸位置6460处的A到G变化、核苷酸位置14178处的aTtoCat变化、15740处的T到C变化、19814处的C到T变化、20528处的A至G变化和20555处的T至C变化。

分子克隆SARS-CoV的拯救。为了构建全长SARS-CoV cDNA，用适当的限制性内切酶消化亚克隆，连接在一起，并用作模板在体外用T7 RNA聚合酶转录。因为N转录物增强了TGEV和MHV转录物的传染性(17,22)和对IBV转录物传染性至关重要(20)，SARS-CoV全长转录物单独测试或与SARS-CoV-N转录物混合测试，并电穿孔到细胞中。48小时内，用荧光抗体染色检测SARS-CoV感染细胞(图2A类–C). 挽救的重组病毒（icSARS-CoV）滴度接近1.0×10⁶混合转录物转染培养物中感染后48h的斑块形成单位/ml(图2D类). 在单独用基因组长度的SARS-CoV转录物转染的培养物中也检测到重组病毒，但滴度降低。SARS-CoV N转录本可能增强SARS全长转录本的传染性，但不是必需的。分子克隆病毒产生与WT SARS-CoV Urbani相似大小的斑块(图2E类).

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图2。

SARS-CoV全长转录本具有传染性。在存在或不存在SARS N转录物的情况下，将全长转录物电穿孔到BHK细胞中，并覆盖敏感的VeroE6细胞。用荧光抗体染色法检测部分细胞。(A类)用SARS-CoV全长转录物转染的培养物。(B类)SARS全长转录本加上N份转录本。(C)未感染对照。(D类)通过菌斑试验测定转染后最初96 h的病毒生长；仅icSARS转录本(▪) 和icSARS加N转录本，试验1（⋄）和试验2（𕱰）(E类)Vero E6细胞中的icSARS-CoV和WT SARS-CoV斑块。

icSARS-CoV标记突变。获救的icSARS-CoV，但不是WT SARS-CoV，应该包含几个Bgl公司I站点被设计为SARS B/C、D/E和E/F亚克隆之间的连接，缺乏Bgl公司I位点位于核苷酸1577位。从感染的培养物中分离出细胞内RNA，使用位于这些不同位点两侧的引物对进行RT-PCR扩增，并用限制性片段长度多态性分析Bgl公司I.很明显，icSARS-CoV包含插入成分克隆内部和之间的标记突变(图3A类和B类). 对选定的扩增子进行克隆和测序，证明icSARS-CoV来源于全长cDNA构建物的转录产物(图3C).

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图3。

icSARS-CoV标记突变。跨不同区域的cDNABgl公司从WT和icSARS-CoV感染细胞扩增出I连接。对片段进行纯化，并用Bgl公司并在1.2%琼脂糖凝胶中分离。(A类)icSARS-CoV（车道2、3、6、7、10和11）和WT SARS-CoV（车道4、5、8、9、12和13）。通道2–5，一个1668-nt扩增子（核苷酸位置1007–2675），用Bgl公司I（3号和5号车道）；车道6–9，一个跨越SARS-CoV B/C交界处（位置8381–9180）的799-nt扩增子Bgl公司I（车道7和9）；车道10–13，一个544-nt扩增子（位置11721–12265），跨越SARS-CoV C/D交界处Bgl公司I（11和13车道）。车道1和14，一个1kb的梯子。(B类)WT SARS（4、5、8和9车道）；icSARS-CoV（车道2、3、6和7）。2–5车道，一个652-nt扩增子，跨越SARS-CoV D/E交界处，经消化Bgl公司I（3号和5号车道）；车道6–9，一个1594-nt扩增子（位置23665–25259），跨越SARS-CoV E/F交界处Bgl公司I（7号和9号车道）。车道1和10，一个1kb的梯子。(C)对1594-nt SARS E/F连接区的扩增子进行亚克隆和测序，证明了在icSARS-CoV中引入的突变。

抢救icSARS-CoV的表型。重组icSARS-CoV复制效率与WT Urbani相同，但略低于Tor-2和Tor-7 SARS-CoV分离株(图4A类). 所有病毒复制到滴度≈1–5×10⁷感染后约24～48小时内。icSARS-CoV亚基因组mRNA应包含一个共同的≈72-nt先导RNA序列，该序列源自基因组的5′端。从Urbani WT和icSARS-CoV感染的培养物中分离出细胞内RNA。引物对来源于先导RNA序列和基因组3′端的不同位置。在对含有前导的扩增子进行RT-PCR扩增后，序列分析表明，8个WT和icSARS-CoV亚基因组转录物起源于相同的CS位点，由核心序列ACGAAC定义(图4B类). 该序列代表了Rota预测的AAACGAAC CS位点的截断等。(8)分别与I、II和III组CoV CS、CUAAAC（TGEV）、UCTAAAC（MHV）和CUUAACAA（IBV）不同。虽然之前的一些研究表明SARS E蛋白和ORF X3可能由多顺反子mRNA表达，但我们的研究结果表明，独立的转录物是在核心CS ACGAAC启动的，分别位于E转录物的26109位和ORF X1转录物的29913位(图4B类). 几个可以编码两个或多个ORF(图4B类) (11). 使用5′RACE，SARS N转录物包含来自基因组5′端的相同的72 nt 5′前导RNA序列（数据未显示）。

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图4。

WT和icSARS-CoV的表型比较。细胞培养物感染倍数为0.1。1小时后，用浓度为500μg/ml的E64-d处理培养物，并通过菌斑试验测定VeroE6细胞中的病毒滴度(C). (A类)Urbani的增长(▪), icSARS（□）、Tor-2（▴）和Tor-7（）CoV。(B类)编码各种icSARS-CoV亚基因组ORF的含铅转录本。*，使用标准CoV命名法分类的预测ORF(11). (C)在存在或不存在E64-d的情况下，icSARS和Urbani SARS-CoV的生长。孵化棒，24小时滴度；黑条，48小时滴度。(D类)感染后72小时，Urbani SARS-CoV感染细胞。

体外抑制SARS-CoV复制。在MHV和口蹄疫病毒感染期间，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64-d阻断复制酶多蛋白处理，从而抑制病毒RNA的合成和生长(12). E64-d对细胞无细胞毒性，不抑制细胞RNA合成。此外，删除E64-d可以恢复病毒复制(12). 为了确定icSARS-CoV是否对E64-d的抑制作用敏感，在有无药物的情况下进行生长比较。在没有E64-d的情况下，WT和icSARS-CoV生长到等效滴度≈1.0×10⁷感染后24–48小时后形成斑块单位/ml。未经处理的感染VeroE6细胞在72小时时表现出广泛的细胞病变效应，细胞变圆和丢失(图4D类). 在感染后1 h用单剂量E64-d处理细胞，分别在感染后24 h和48 h使WT和icSARS-CoV的病毒产量显著降低≈3-4 log，同时在72 h降低病毒细胞病变效应，并使健康完整的单层细胞减少(图4C和D类). 在类似条件下，MHV复制也从3.0×10减少了≈3.0 logs⁷至1.5×10⁴10小时，但反弹至1.0×10⁷感染后24h形成斑块单位/ml。因此，单剂量E64-d抑制icSARS-CoV复制的持续时间似乎比MHV更长。E64-d对SARS多蛋白加工的影响的细节将在其他地方进行更详细的报道。

讨论

据推测，SARS-CoV来自中国的外来动物。虽然没有人能够准确预测SARS-CoV对全球社会的未来影响，但在过去25年中，动物中出现了几种新的致病性CoV并在全球传播(23–25). 与在体外研究发现，冠状病毒是严重的新兴病原体，能够快速进化、跨物种传播和新宿主物种的定植(26,27). 鉴于SARS-CoV疫情的紧迫性，全长cDNA的可用性将提供一种遗传方法来操纵SARS-CoV基因组以开发疫苗，并探索基因组的复杂性。SARS复制酶包含几个预测的酶活性和未定义的结构域，其在复制中的功能在很大程度上尚未探索，但可能代表抗病毒干预的靶点(11).

有效的生物防御和控制新发感染需要快速反应方法，以开发安全有效的疫苗和治疗方法。对于SARS-CoV，高通量筛选和IIS类限制性内切酶的结合简化了共有cDNA片段的分离和组装，并在获得病毒RNA的2个月内恢复了重组SARS-CoV。我们假设这些方法可以应用于任何新出现的RNA或DNA病毒病原体，也可以通过连接合成的寡核苷酸来组装大基因和基因组在体外(17,18).

我们构建了具有代表性的I组和II组CoV的全长cDNA。与MHV和TGEV一样，N转录物增强了拯救病毒的恢复(17,18). 虽然确切的机制尚不清楚，但我们实验室的数据表明，功能性N ORF至关重要。N蛋白可能增强病毒mRNA的翻译，保护病毒基因组，或增强亚基因组转录（K.M.C.、B.Y.、A.C.Sims和R.S.B.，未发表的观察结果）。与早期报告一致(11)，icSARS-CoV感染细胞包含基因组长度和至少八个亚基因组mRNA，编码共同的72-nt先导RNA序列，融合在共同核心CS“ACGAAC”。CS核心序列仅在这些亚基因组转录的关键位点编码。其中一些亚基因组mRNA（mRNA 3、7、8和9）可能具有多顺反子功能，但这些下游群体特异性ORF的功能尚不清楚。由于高度同源性对于先导/机体CS融合和亚基因组mRNA的有效合成是必要的，我们预测，之前未描述的SARS转录调控序列可能会对组间RNA重组，尤其是基因组3′端的重组，造成巨大障碍。

SARS全长cDNA可能允许开发含有特定衰减突变的活候选疫苗株。事实证明，生产安全有效的冠状病毒疫苗对动物和人类都具有挑战性，因为这些病毒经常在粘膜表面复制，最严重的疾病经常发生在新生动物身上。由于疾病严重程度有限和短期保护性免疫，尚未开发出针对人类CoV HCV-229E和HCV-OC43的疫苗。候选的灭活病毒疫苗对TGEV、猫传染性腹膜炎病毒和IBV的治疗效果并不理想。减毒活疫苗和重组病毒疫苗已被证明对TGEV、MHV和IBV有效(32–37). 然而，用灭活、重组或活性减弱的病毒接种猫传染性腹膜炎病毒会产生抗S抗体，导致疾病加重和病毒攻击后死亡(38,39). 虽然长效粘膜免疫、免疫增强和与现有菌株重组是研制有效SARS疫苗面临的潜在问题，但几种动物疫苗方法已被证明是成功的，大多数SARS患者产生了免疫反应并恢复(2,4,40,41).

虽然处于发展的早期阶段等。(42)同时通过结膜、鼻子和气管感染四只猕猴。动物在第3天变得昏昏欲睡，在血清转化的所有四只感染动物中都检测到病毒。感染高剂量的两只动物在感染后第6天进行尸检，其肺部病变与感染者相似。将分子克隆的icSARS-CoV作为灵长类动物的一种疫苗进行测试，将为CoV在SARS中的病因学提供进一步的证据。进一步完善非人灵长类模型，再加上全长cDNA克隆，以便对获救的icSARS-CoV进行精确修改，应考虑为诊所开发候选疫苗。例如，删除基因组最后三分之一中编码的非服务性、群体特异性ORF并不损害CoV复制在体外，但病毒被减弱体内(22,28,29). 这些ORF也可以被外源基因取代，从而从重组病毒和单次命中复制子粒子中表达外源基因(22,30,31). 虽然是推测性的，但一些SARS群体特异性ORF也可能编码奢侈功能，从而减弱发病机制体内但可能对在体外复制。

SARS-CoV感染性克隆的可用性将为研究候选抗病毒药物提供工具。目前的数据表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64-d可能在感染期间随时抑制SARS病毒的复制。在MHV模型中证实的E64-d抑制多种蛋白酶的能力表明，它可能不太容易因单个蛋白酶的突变而逃逸病毒(12). CoV 3C类蛋白酶结构的最新描述(44)将指导候选抗病毒药物敏感性和耐药性演变的靶向遗传研究。此外，复制酶基因包含SARS-CoV基因组的三分之二，并编码许多功能未知的蛋白质。SARS基因组全长cDNA的可用性应允许复制酶基因的遗传操作，从而为病毒复制过程中特定蛋白水解裂解和复制酶蛋白的作用提供新的见解。

致谢

笔记

缩写：冠状病毒；严重急性呼吸系统综合征；icSARS，传染性克隆SARS；E64-d，（2S公司,3S公司)-转环氧琥珀酰基-我-亮氨酸氨基-3-甲基丁烷乙酯；TGEV，传染性胃肠炎病毒；MHV、小鼠肝炎病毒；传染性支气管炎病毒；CS，共识序列。

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