美国国家科学院院刊。2002年3月19日；99(6): 3609–3614.
透明质酸基质的异常积聚减少了对细胞生长的接触抑制，并促进了细胞迁移
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直系伊塔诺
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
Atsumi富木子
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
Takahiro Sawai先生
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
山田洋一
*医学分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
宫崎骏
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
武士森加
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
Michinari Hamaguchi先生
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
Koji Kimata公司
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
*医学和分子科学研究所‡实验动物研究中心和§爱知医科大学病理学第二系，日本爱知480-1195，Nagakute；和¶名古屋大学医学院分子病理学系，日本名古屋466，昭和区津美町65号
由加利福尼亚州拉霍亚伯纳姆研究所Erkki Ruoslahti传达
2001年4月25日收到；2002年1月9日接受。
摘要
透明质酸生物合成和基质沉积升高与细胞增殖和迁移相关。我们在未转化的大鼠3Y1细胞中体外表达了透明质酸合成酶的三种亚型（HAS1、HAS2或HAS3），并观察到从头开始大量形成透明质酸基质，导致接触介导的细胞生长和迁移抑制部分丧失。所有三种HAS转染剂在划痕实验中均表现出增强的运动能力，并且汇合细胞密度显著增加。在高密度培养中，HAS转染剂具有成纤维细胞形状，并明显形成重叠的细胞层。与HAS1或HAS3转染者相比，HAS2转染剂中的这种表型更为明显，并且微丝组织和细胞-细胞边界处的N-钙粘蛋白分布发生了显著变化。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）通路的抑制导致HAS2转染者正常表型的重新获得，表明细胞内PI3-激酶信号调节由大量透明质酸基质形成引起的接触抑制的减少。我们的观察表明，透明质酸及其基质可以调节细胞生长和迁移的接触抑制，并为不同HAS蛋白合成的透明质酸之间的功能差异提供了证据。
透明质酸（HA）是一种线性多糖，由重复的二糖组成：N个-乙酰基-d日-葡糖胺-β（1→4）-d日-葡萄糖醛酸-β（1→3），广泛存在于大多数脊椎动物组织中，是细胞外基质的主要成分(1,2). HA由三种HA合成酶亚型合成：HAS1、HAS2和HAS3(三,4). 这三个HAS基因在小鼠发育过程中有不同的表达模式(5)，其产品在HA基质形成中具有显著不同的酶性质和作用(6).
HA合成和基质形成可能在癌症的发展、进展和发病机制中发挥作用。例如，当致癌病毒转化成纤维细胞时，HA的合成速度大大提高(7,8)HA水平升高与黑色素瘤和各种癌的过度增殖和恶性表型有关(9–11).
对培养的癌细胞进行的研究表明，HA的过度生产增强了它们的非依赖性生长、致瘤性和转移潜能(12,13)表明HA在肿瘤生长和恶性进展中起着重要作用。然而，目前尚不清楚过度生产是否会导致非转化细胞的恶性转化。
我们过度表达了三种HAS亚型，以测试HA转化非转化细胞的能力。我们还研究了三种HAS亚型在非转化细胞中的功能是否不同。
材料和方法
细胞培养和转染。
3Y1 1-B6细胞取自日本筑波市的Riken Cell Bank。3Y1细胞在含有10%FCS和2mM的DMEM中培养我-谷氨酰胺（生长培养基）。如前所述，建立了稳定的转染剂(6)并在含有0.5 mg/ml G418的生长培养基中进行常规培养。
微粒排除分析。
固定绵羊红细胞（Inter-Cell Technologies，Hopewell，NJ）在PBS中重建为5×10的密度8cells/ml，用于前面描述的微粒排除分析(6). HA矩阵通过添加1×10进行可视化7将红细胞置于生长培养基中，并在奥林巴斯（纽约州纽海德公园）IMT-2倒置相差显微镜下观察。用NIH追踪数字化图像，测定HA细胞周被与细胞面积的比值形象（1.57版）计算机上的软件。所有测量都在前一篇论文中进行了描述(6).
检测FLAG标记的重组HAS蛋白的表达。
根据制造商的说明，通过使用抗FLAG肽抗体M5（Eastman Kodak），然后使用与过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG抗体进行蛋白质印迹。通过使用ECL检测系统（Amersham Pharmacia Biotech）暴露10 s检测免疫复合物。
通过竞争ELISA样分析测定HA浓度。
将指数生长和融合培养物在新鲜培养基中培养24 h，并回收条件培养基。如前所述，通过竞争ELISA样分析测定条件培养基的HA含量(6). 简言之，将条件培养基与生物素化HA结合蛋白（b-HABP）混合，并在4°C下培养20小时。将混合物添加到HA结合96周，然后在室温下培养6小时。以碱性磷酸酶偶联链霉亲和素为二级探针，利用对-以硝基苯磷酸盐为底物。用标准曲线计算HA含量。
HA合成酶分析。
使用UDP监测HA合酶活性-[14C] 如前所述，GlcA[281 mCi（1 Ci=37 GBq）/mmol；NEN；GlcA=葡萄糖醛酸残基](6). 简言之，将HAS转染剂的粗膜部分重新悬浮，并在37°C的0.2 ml 25 mM Hepes-NaOH中培养1 h，pH 7.1/5 mM DTT/15 mM MgCl2/0.1 mM UDP-GlcNAc（Sigma）/2μM UDP-GlcA（京都纳卡拉特斯克）/2μCi UDP-[14C] GlcA公司。通过添加2%（wt/vol）的SDS终止反应。使用在1M醋酸铵（pH 5.5）和乙醇（65:35）中显影的沃特曼3MM号纸，通过下降纸层析法测量放射性并入高分子量HA。用液体闪烁计数法测量放射源中的放射性量。合成酶活性是通过使用已知的特定放射性计算GlcA的结合量来确定的。
细胞增殖试验。
使用细胞计数试剂盒-8（日本熊本市Dojindo）进行细胞增殖分析。细胞以1×10的速度被放置在96个板中4每孔细胞数，并在生长培养基中培养。在指定的时间点，测量三个孔中的细胞数，作为还原WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺苯基）-2H-四氮唑，单钠盐）的吸光度（450 nm）。
损伤细胞单层的修复。
将融合的单层细胞在含有血清的生长培养基中保持至少6天，然后在无血清培养基中保持24小时。使用200μl塑料移液管尖端刮擦单层。然后将受伤细胞在无血清培养基中培养6小时，并在倒置相差显微镜下拍照。在板上标记了三个不同的点，并在这些点细胞迁移前后测量了划痕边缘之间的长度。平均迁移距离（μm）是通过从0小时的长度减去6小时后的长度来计算的。
微丝染色和免疫染色。
细胞在Lab-Tek室载玻片（Nalge-Nunc）中培养至融合。将融合细胞用4%多聚甲醛固定在PBS中15分钟，然后用0.5%Triton X-100在PBS内渗透10分钟。将固定和渗透细胞与罗丹明-卟啉（Sigma）在潮湿的培养箱中培养20分钟，并将培养箱载玻片安装在慢褪色光抗褪色试剂盒（分子探针）上。将固定和渗透的细胞与泛抗钙粘蛋白抗体（Sigma）、抗N-钙粘蛋白或β-连环蛋白抗体（肯塔基州列克星敦的Transduction Laboratories，KY）在湿室中孵育1h，然后与FITC-偶联抗兔抗体或抗鼠抗体（Amersham Pharmacia Biotech）孵育1 h。将固定细胞与生物素化HA结合蛋白在潮湿的培养箱中培养1h，然后与FITC-共轭链霉亲和素（Amersham Pharmacia Biotech）培养1h。在荧光显微镜下拍摄荧光图像。
扫描电子显微镜。
细胞层生长在盖玻片上，用PBS清洗，并用2.5%（wt/vol）多聚甲醛、2%（wt/vol）戊二醛在50 mM磷酸盐缓冲液中在冰上固定1小时。细胞层用1%四氧化锇固定2 h。在梯度系列乙醇中脱水，然后用乙酸异戊酯脱水后，将样品冻干，涂上金，并在日立S-4700型扫描电子显微镜下进行检查。
BrdUrd掺入试验。
通过在新鲜培养基中的10μM BrdUrd中孵育24小时来标记细胞，在室温下在酸性乙醇（5%乙酸和5%乙醇蒸馏水）中固定30分钟，并在室温下与小鼠抗BrdUrd单克隆抗体（BD PharMingen）孵育1小时。在室温下与辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG（Amersham Pharmacia Biotech）孵育30分钟后，用3,3′-二氨基联苯胺四氯化物染色观察BrdUrd并入细胞核。结合BrdUrd的细胞百分比是通过两个独立的实验计算出来的，这两个实验测量了三个不同显微镜下BrdUrd-阳性细胞的平均值。用1 mg/ml分子量超过10的人脐静脉HA攻击被捕细胞6Da（内毒素含量，<0.001内毒素单位/mg）和分子量为3800和5500 Da的HA片段（内毒素含量分别为0.103内毒素单位/mg/mg和0.001内毒素单位/mg）；然后按照上述方法计算包含BrdUrd的细胞百分比。
如前所述，通过流式细胞术分析细胞周期曲线(14). 简单地说，用10μM BrdUrd将生长和汇合细胞脉冲处理24小时。用70%乙醇固定细胞，用PBS冲洗，并将其重新悬浮在1ml冷的0.1 N HCl/0.7%Triton X-100冰上。在用PBS冲洗一次后，将其在95°C的0.5 ml 3.2 mM HCl中加热8分钟，然后立即放在冰上。用HNFN缓冲液（10 mM Hepes/150 mM NaCl/4%FCS/0.1%NaN）冲洗细胞两次三)含有0.5%Tween 20和单独使用HNFN一次。用抗BrdUrd单克隆抗体标记细胞，然后用FITC-偶联的抗鼠IgG抗体标记细胞。将染色细胞重新悬浮在1 ml PI溶液中（50μg/ml碘化丙啶/10μg/ml PBS中的核糖核酸酶A），并在黑暗中放置1 h（4°C），然后使用Epics Elite V流式细胞仪（Coulter）进行分析。
软琼脂生长试验和肿瘤形成。
在六孔板上涂上1 ml 0.6%琼脂糖的生长培养基。那么，2×105, 2 × 104、和2×10三将每个细胞池中的细胞悬浮在0.2ml的生长培养基中。将每个细胞悬浮液与0.3%琼脂糖生长培养基（52°C）混合，并以2 ml的浓度重复添加到0.6%琼脂酶涂层的孔中。琼脂糖在室温下在20分钟内凝固，并向每个孔中添加3 ml生长培养基。每3天更换一次培养基，持续1个月，每周计数菌落数。在6周龄雌性BALB/c nu/nu小鼠的左侧皮下注射0.1 ml 2×10的悬浮液6细胞。对可见肿瘤的外观进行6个月的监测。
结果
HAS蛋白的异位表达导致HA的过度生成和HA基质的异常积累。
我们通过在未转化的、不朽的大鼠3Y1细胞系中转染和表达不同的HA合成酶，研究了HA对细胞生长和转化的影响(15). 我们观察到3Y1细胞中HAS1、HAS2或HAS3的过度表达导致HA和从头开始HA细胞周膜的形成（图。). 以前和现在的实验表明，HAS2转染剂的HA细胞周膜明显大于HAS1或HAS3转染体，尽管HAS1转染物在条件培养基中产生了等量或更多的HA（参考文献。6，图。 A类和C类). 我们在HAS转染体中只检测到FLAG标记的重组蛋白，这意味着转染体HA的过度产生是由于HAS蛋白的异位表达所致（图。B类). 已知HA合成在生长抑制细胞中下调，但在我们的转染剂中，培养基中的合成和HA积累保持在比对照转染剂高几倍的水平，即使在细胞汇合后（图。C类). HA基质形成方面的如此显著差异促使我们研究由各自的HAS合成的不同HA的生物学意义。
HAS过度表达对汇合大鼠3Y1细胞的细胞密度和形态的影响。(A类)用对照载体或HAS表达载体转染大鼠3Y1成纤维细胞，建立克隆转染体(6). 通过微粒排斥试验检测HA涂层形成（箭头）。用每个HAS cDNA转染亲代细胞，并合并G418-耐药转染剂。将转染体以5×10的比例放置在10-cm的组织培养皿中5细胞/培养皿并培养14天。混合的HAS转染体显示出纺锤状形态和重叠的细胞层。(B类)对从表达FLAG标记HAS蛋白的转染体中分离的膜组分进行Western blotting分析。箭头表示FLAG标记的HAS1（68 kDa）、HAS2（60 kDa”）和HAS3蛋白质（60 kDa）的蛋白质带。(C类)合流培养物的HA合成酶活性测定如材料和方法。指数生长和融合培养物条件培养基的HA含量通过竞争ELISA样分析测定，如材料和方法柱，三次测定的平均值；巴，标准偏差。
HA的过度生产和HA基质的异常积累促进了融合细胞的增殖和迁移。
我们研究了内源性过量生产HA作为细胞生长调节剂的可能性。低细胞密度下的生长曲线显示，在过表达HAS的3Y1细胞中没有明显的生长刺激或抑制（数据未显示）。在达到融合后，亲代和对照细胞因接触抑制而变得静止，但所有HAS转染剂逐渐增加其饱和密度（表). 然后将融合培养物刮伤并检查伤口修复率。HAS转染剂迁移到划痕伤口的速度比亲代3Y1细胞和对照转染剂更快（表). 这些表型是HAS1和HAS3细胞的中间表型，在HAS2转染剂中最为显著，表明HA基质形成水平与细胞运动接触抑制之间存在密切关系。
表1
| 克隆 | 饱和电池密度* | 细胞运动，†微米±标准偏差 | 单元格重叠 |
|---|
| 3年1月 | 1 | 35.0 ± 11.0 | − |
| 模拟-9 | 1.04 ± 0.04 | 32.2 ± 10.5 | − |
| βgal-1 | 1.03 ± 0.08 | 32.3 ± 7.7 | − |
| HAS1–16 | 1.16 ± 0.16‡ | 44.5 ± 7.8§ | + |
| HAS1–17 | 1.13 ± 0.2§ | 45.3 ± 4.3§ | + |
| HAS2–5个 | 1.23 ± 0.03‡ | 56.3 ± 7.3§ | + |
| HAS2-8 | 1.19 ± 0.06§ | 52.3 ± 5.3§ | + |
| HAS2–12个 | 1.25 ± 0.13‡ | 58.0 ± 11.8‡ | + |
| HAS3-4型 | 1.18 ± 0.09‡ | 52.3 ± 9.2‡ | + |
| HAS3-10型 | 1.16 ± 0.06§ | 47.7 ± 6.8§ | + |
大量HA基质的形成诱导细胞分层并改变细胞骨架组织。
我们生成了稳定的转染剂池，以避免因选择和繁殖单个转染细胞的克隆而产生的任何表型伪影。每次转染后，我们将G418耐药菌落合并。80%以上的HAS转染剂上清楚地存在HA细胞周膜，而对照细胞中没有明显的外壳形成（数据未显示）。在融合培养中，亲代细胞和对照细胞是非重叠细胞的单层，而混合的HAS转染剂显示出纺锤状形态和重叠细胞层，这是细胞转化的特征（图。A类). 在相控显微镜下，与HAS1或HAS3转染剂相比，表达HAS2的细胞的这些形态转化特征更为明显（图。A类). HAS1和HAS3转染体形成较少的HA基质，我们在其培养物中观察到一些漂浮细胞，表明在形成分层细胞层的过程中，大量HA基质充当支架。
扫描电子显微镜显示在HAS2转染子的细胞边缘有许多丝状突起（图。B类). 相反，静止的对照转染体在细胞边界形成紧密连接（图。A类). 与对照细胞相比，罗丹明-球蛋白染色显示HAS2转染细胞中的肌动蛋白丝组织发生了显著变化（图。 C类和D类). 合流的HAS2转染体从以皮质肌动蛋白丝为主转变为以肌动蛋白应力纤维为主。另一方面，HAS1和HAS3转染剂的肌动蛋白组织出现中度改变（数据未显示）。免疫荧光实验表明，在HAS2转染剂中，细胞间界钙粘蛋白的分布发生了显著改变（图。F类). 相反，钙粘蛋白主要积聚在对照转染体的细胞间界，其分布与亲代3Y1细胞的分布无明显区别（图。E类).
融合HAS2转染剂的形态和细胞骨架改变。对照转染剂的融合培养(A类,C类,E类、和G公司)和HAS2转染剂(B类,D类,F类、和H（H）)通过扫描电子显微镜进行分析(A类和B类)并用罗丹明-球蛋白染色(C类和D类)，泛抗钙粘蛋白抗体(E类和F类)或生物素化HA结合蛋白（HABP；G公司和H（H）). 扫描电子显微镜显示HAS2转染体细胞边缘有许多丝状突起(B类). 合流的HAS2转染体将其肌动蛋白丝组织从皮质肌动蛋白纤维改变为肌动蛋白应激纤维(D类). 在HAS2转染体中，钙粘附素在细胞间界的分布发生了显著改变(F类). 棒材=5μm(A类和B类)和20微米(C类–H（H）).
非转化细胞中HA的过度生成并不能增强其锚定非依赖性生长或形成皮下肿瘤的能力。
评估HAS的致癌能力在体外，细胞悬浮在0.3%琼脂中，允许生长1个月。这种软琼脂分析显示，在HAS转染细胞和对照细胞中都没有明显的集落形成。我们将这些HAS转染物注射到裸鼠体内，6个月内未观察到注射部位的肿瘤形成。
合流细胞的细胞周期进展与HA的过度产生有关。
我们使用BrdUrd掺入试验来监测HAS转染剂的生长模式。当对指数生长的细胞进行免疫细胞化学染色时，发现所有HAS转染剂和对照细胞中BrdUrd-掺入细胞的百分比超过15%。汇合后，不到3%的对照3Y1细胞被发现是BrdUrd结合细胞。相反，我们观察到，在HAS2转染体汇合后，纳入BrdUrd的细胞百分比显著增加。为了表征这些细胞在细胞周期中的分布，用流式细胞术分析BrdUrd在融合细胞中的掺入。亲代和对照细胞的细胞周期曲线显示S和G的比例下降2/M细胞和G细胞比例的增加0/G公司1电池（图。). 相反，所有HAS转染克隆的S期和G期比例都较高2/M相，G的百分比较低0/G公司1相较于对照细胞（图。).
HA过度生产导致接触抑制3Y1细胞的细胞周期进展。在与BrdUrd融合的细胞培养物脉冲后24小时，用流式细胞仪监测细胞周期。按照材料和方法所有HAS转染体的S期和G期细胞比例都很高2/M相，G中百分比低0/G公司1相，与对照细胞相比。
外源添加HA可诱导DNA合成，但不会在融合细胞中诱导分层。
为了进一步确认高细胞密度下的细胞周期进展是否是由于HA的过度产生，3Y1细胞在一定时间内暴露于外源可溶性HA，然后监测BrdUrd的掺入。当用1 mg/ml高分子量HA（分子量大于106Da），亲代细胞部分地从接触性生长抑制中释放，并恢复其细胞周期进程。在没有HA的对照培养物中，只有不到3%的细胞启动了DNA合成，而10.8±2.8%的细胞在HA刺激后掺入了BrdUrd。由于HA的生理作用因链长而异，我们还研究了短HA片段对细胞周期进程的影响。当用分子量为3800和5500 Da的HA片段攻击这些滞留细胞时，观察到微弱但显著的生长促进作用（BrdUrd的结合率分别为7.3±0.9%和8.2±2.1%）。有趣的是，无论是高分子量HA还是低分子量HA都不会影响HA基质的形成，也不会诱导细胞分层。
为了阐明条件培养基中分泌的HA对细胞增殖的影响，我们将3Y1细胞暴露于HAS转染剂的条件培养基。当用3Y1-mock-9和β-半乳糖苷酶（βgal）-1细胞的条件培养液对亲代细胞进行激发时，BrdUrd掺入率分别为0.4±0.1%和1.3±0.6%。相反，用HAS2-5、HAS2-8和HAS2-12细胞的条件培养基处理后，BrdUrd并入亲代细胞的比例略有但显著增加（分别为5.6±1.9%、3.7±1.1%和5.8±0.9%）。然而，在相同的实验条件下，即使在2周后也没有观察到高细胞密度下的细胞层分层（数据未显示）。这些结果表明，HA的过度生产在高细胞密度下的细胞周期调节中起作用，并表明，当HA基质异常积累时，它明显有助于形成分层细胞层。
PI3-激酶途径的抑制导致HAS2转染者正常表型的重新获得。
细胞内信号调节多种细胞过程，包括增殖、细胞间通讯和转化。我们最近对PI3-激酶抑制剂对HA依赖性细胞运动的作用的研究表明，通过HA-CD44相互作用激活PI3-激酶是增强HA依赖性的细胞运动所必需的(16). 为了测试PI3-激酶抑制剂对细胞转化的影响，用LY294002或沃特曼（PI3-激酶的有效抑制剂）处理HAS2稳定转染体。PI3-激酶的抑制导致HAS2转染剂正常表型的重新获得，如细胞形状、肌动蛋白细胞骨架组织和细胞-细胞机械分布所示（图。). 然而，即使在用PI3-激酶抑制剂处理后，HAS2转染体上仍保留有HA基质，这表明HA介导的PI3-激酶活化在调节细胞-细胞粘附的稳定和细胞生长的接触抑制中起作用。
PI3-激酶途径的抑制导致HAS2转染体正常表型的重新获得。HAS2稳定转染体与(B类,D类,F类,H（H）、和J型)或不带(A类,C类,E类,G公司、和我)10μM的LY294002，一种PI3-激酶抑制剂，在细胞汇合后，在抑制剂存在下再培养5天。经抑制剂处理的HAS2转染体形态正常(B类). 肌动蛋白的罗丹明-球蛋白染色显示经抑制剂处理的HAS2转染体中细胞周肌动蛋白环再次出现(D类). HAS2转染体中N-钙粘蛋白和β-连环蛋白的免疫荧光染色表明，PI3-激酶抑制导致N-钙粘素和β-连蛋白在细胞边界积聚(F类和H（H）)而HAS2转染体即使在用LY294002治疗后仍保持HA基质(J型). Wortmannin（50μM）是一种有效的PI3激酶抑制剂，对HAS2转染子的表型变化也有类似的影响（数据未显示）。
讨论
我们在大鼠3Y1细胞中建立了稳定的HAS转染体，以检测HA在细胞转化中的可能作用和作用模式。在这里，我们发现HAS的过度表达会导致HA基质的异常堆积，从而导致接触抑制的部分丧失。此外，我们试图阐明三种HAS亚型之间的功能差异，发现HAS2转染剂中的表型最为显著，而HAS1和HAS3转染体中的表型为中间型。正如我们在上一篇论文中所预期的那样(6)，这些表型差异可以通过各自HAS的酶特性差异来解释。通过基因操作获得的最新发现为不同HAS蛋白合成的HA分子的功能差异提供了证据。
先前的研究表明HA受体介导的信号通路在调节肌动蛋白细胞骨架组织和细胞迁移中可能发挥作用(17–19). HAS基因的过度表达增强了人黑色素瘤细胞系的运动能力(20)HAS2基因表达的反义抑制减少了角质形成细胞的迁移(21). HAS2基因的破坏证明了Ras信号通路在HA依赖性细胞迁移中的重要作用(22)我们最近的研究进一步表明，同时激活Ras-mitogen-activated protein（MAP）激酶和PI3-激酶途径是激活HA依赖性细胞运动所必需的(16). CD44-HA相互作用还触发小的GTP-结合蛋白信号级联，导致肌动蛋白细胞骨架的重排和跛足足的快速生长(18,19). 因此，受体介导的信号通路可能协同增强HAS转染子进入伤口的迁移，留下空间。
研究表明，在培养基中施用可溶性HA可以通过HA受体相互作用激活细胞内有丝分裂信号(23,24). 在这里，我们证实了可溶性HA对促进细胞增殖的作用。然而，施用外源可溶性HA或HAS2转染剂的条件培养基并不能诱导分层细胞层的形成，这表明大量HA基质可作为细胞层分层的支架。HA的过度生产和基质的异常积累改变了N-钙粘蛋白在细胞间界的分布，并诱导了融合细胞的细胞周期进展。因为钙粘蛋白介导的细胞粘附可以调节细胞周期机制的几个组成部分(14,25,26)，我们的结果使我们相信，HA基质的异常积累导致细胞-细胞粘附的破坏是接触抑制减少的原因。一种可能的机制可能是细胞-细胞粘附通过HA基质的其他成分调节，例如大硫酸软骨素蛋白聚糖(27). 虽然控制这些表型功能方面的机制尚未完全了解，但本研究的结果表明，PI3-激酶途径也参与调节细胞-细胞粘附的稳定和细胞生长的接触抑制。
HA的不受控制的产生和基质的异常积累导致未转化的永生细胞系接触抑制减弱，这是细胞转化的早期事件。HAS2的过度表达确实增强了人类纤维肉瘤细胞的锚定非依赖性生长和致瘤性(12)HAS1的过表达增强了小鼠乳腺癌细胞的转移能力(13). 然而，HAS表达的3Y1细胞并未表现出增强锚定物非依赖性生长或皮下肿瘤形成。这一结果表明HA本身对肿瘤转化没有影响。因此，当与其他基因改变结合时，基质的异常积累可能会促进肿瘤的进展。卡梅尼施等。证明通过施用可溶性HA激活的Ras信号参与内皮细胞向间质的转化(22). 然而，根据我们的结果，外源性可溶性HA、，这表明细胞转化需要另一种涉及基质积累的机制。因此，阐明HA基质在肿瘤不同发展阶段的作用将是非常有意义的。
致谢
我们感谢Andrew P.Spicer博士（加州大学戴维斯分校）和John A.McDonald博士（斯科茨代尔梅奥诊所）提供小鼠HAS2 cDNA。我们感谢Youji Ohnuki博士（日本精贺株式会社）提供HA片段。这项工作得到了日本教育、文化和科学部的部分资助，日本政府科学技术署的特别协调基金，爱知癌症研究基金会的资助，以及精贺株式会社的特别研究基金。
注释
当我们处于写作的最后阶段时，发表了一篇文章，为本文的主题提供了有趣的信息(28).
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1Laurent T C，Fraser J R E。美国财务会计准则委员会J。1992;6:2397–2404.[公共医学][谷歌学者] 2克努森C B，克努森W。美国财务会计准则委员会J。1993;7:1233–1241.[公共医学][谷歌学者] 三。Weigel P H、Hascall V、Tammi M。生物化学杂志。1997;272:13997–14000.[公共医学][谷歌学者] 4Itano N，Kimata K。趋势糖衣甘草酚。1998;10:23–38. [谷歌学者] 5Spicer A P，麦当劳J A。生物化学杂志。1998;273:1923–1932.[公共医学][谷歌学者] 6Itano N、Sawai T、Yoshida M、Lenas P、Yamada Y、Imagawa M、Shinomura T、Hamaguchi M、Yoschida Y、Ohnuki Y等。生物化学杂志。1999;274:25085–25092.[公共医学][谷歌学者] 7Ishimoto N、Temin H M、Strominger J L。生物化学杂志。1966;241:2052–2057.[公共医学][谷歌学者] 8霍普伍德J J，多夫曼A。生物化学杂志。1977;252:4777–4785.[公共医学][谷歌学者] 9Kimata K、Honma Y、Okayama M、Oguri K、Hozumi M、Suzuki S。癌症研究。1983;43:1347–1354.[公共医学][谷歌学者] 10Turley E A、Tretiak M。癌症研究。1985;45:5098–5105.[公共医学][谷歌学者] 11Simpson M A、Reiland J、Burger S R、Furcht L T、Spicer A P、Oegema T R、McCarthy J B。生物化学杂志。2001;276:17949–17957.[公共医学][谷歌学者] 12Kosaki R、Watanabe K、Yamaguchi Y。癌症研究。1999;59:1141–1145.[公共医学][谷歌学者] 13Itano N、Sawai T、Miyaishi O、Kimata K。癌症研究。1999;59:2499–2504.[公共医学][谷歌学者] 14Croix B S、Sheehan C、Rak J W、Florenes V A、Slingerland J M、Kerbel R S。细胞生物学杂志。1998;142:557–571. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Kimura G、Itagaki A、Summers J。国际癌症杂志。1975;15:694–706.[公共医学][谷歌学者] 16Sohara Y、Iahiguro N、Machida K、Kurata H、Thant A A、Senga T、Matsuda S、Kimata K、Iwata H、Hamaguchi M。分子生物学细胞。2001;12:1859–1868. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Entwisle J、Hall C L、Turley E A。细胞生物化学杂志。1996;61:569–577.[公共医学][谷歌学者] 18Oliferenko S、Kaverina I、Small V、Huber L A。细胞生物学杂志。2000;148:1159–1164. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19.Bourguignon L Y，Zhu H，Shao L，Chen Y W。生物化学杂志。2000;275:1829–1838.[公共医学][谷歌学者] 20.Ichikawa T、Itano N、Sawai T、Kimata K、Koganehira Y、Saida T、Taniguchi S。《皮肤病学杂志》。1999;113:935–939.[公共医学][谷歌学者] 21Pienimaki J P、Rilla K、Fulop C、Sironen R K、Karvinen S、Pasonen S、Lammi M J、Tammi R、Hascall V C和Tammi M I。生物化学杂志。2001;276:20428–20435.[公共医学][谷歌学者] 22Camenisch T D、Spicer A P、Brehm-Gibson T、Biesterfeldt J、Augustine M L、Calabro A，Jr、Kubalak S、Klewer S E、McDonald J A。临床投资杂志。2000;106:349–360. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Slevin M、Krupinski J、Kumar S、Gaffney J。实验室投资。1998;78:987–1003.[公共医学][谷歌学者] 24Serbulea M、Kakumu S、Thant A A、Miyazaki K、Machida K、Senga T、Ohta S、Yoshioka K、Hotta N、Hamaguchi M。国际癌症杂志。1999;14:733–738.[公共医学][谷歌学者] 25Levenberg S、Yarden A、Kam Z、Geiger B。致癌物。1998;18:869–876.[公共医学][谷歌学者] 26Orford K、Orford C C、Byers S W。细胞生物学杂志。1999;146:855–867. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Vleminckx K L、Deman J J、Bruyneel E A、Vandenbossche G M、Keirsebilck A A、Mareel M、van Roy F M。癌症研究。1994;54:873–877.[公共医学][谷歌学者] 28刘恩，高福，韩Z，徐X，安德希尔C B，张磊。癌症研究。2001;61:5207–5214.[公共医学][谷歌学者] 
