Activation of system L heterodimeric amino acid exchangers by intracellular substrates

Christian Meier; Zorica Ristic; Stefan Klauser; François Verrey

doi:10.1093/emboj/21.4.580

EMBO J。2002年2月15日；21(4): 580–589.

数字对象标识：10.1093/emboj/21.4.580

PMCID公司：PMC125871型

PMID：11847106

细胞内底物激活系统L异二聚氨基酸交换器

克里斯蒂安·梅埃尔,Zorica Ristic公司,斯特凡·克劳瑟,¹和弗朗索瓦·维雷²

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摘要

普遍存在的LAT1-4F2介导大中性氨基酸的系统L型转运hc公司和上皮LAT2-4F2hc公司这些异二聚体被认为是必需的交换物，但到目前为止，只有流入特性被详细研究过。在这里，我们使用爪蟾卵母细胞表达系统。高效液相色谱法定量氨基酸流入和流出表明，必需的氨基酸交换具有1:1的化学计量比。注射氨基酸对氨基酸内流的强差异跨刺激表明，细胞内底物的可用性限制了转运速率，外排选择性范围与内流相似。与高细胞外表观亲和力相比，LAT1-和LAT2-4F2hc公司显示出较低的细胞内表观亲和力（表观K（K）_米毫摩尔范围内）。因此，与细胞生长有关的两种系统L氨基酸转运蛋白（LAT1-4F2hc公司)和跨细胞转运（LAT2-4F2碳氢化合物)是具有相对对称的底物选择性但强烈不对称的底物亲和力的强制性交换器，因此细胞内的氨基酸浓度控制着它们的活性。

关键词：上皮细胞极性/糖蛋白相关氨基酸转运体/LAT1-4F2hc公司/LAT2-4F2hc公司

介绍

两种与Na相对应的大中性氨基酸异二聚体转运体⁺-独立系统L最近被确定(Kanai等人，1998年;Mastroberardino等人，1998年;Pineda等人，1999年;Prasad等人，1999年;Rossier等人，1999年;Segawa等人，1999年;Rajan等人，2000年). 这些异二聚体包含名为LAT1和LAT2的催化亚单位，它们属于糖蛋白相关氨基酸转运蛋白（gpaAT）家族，也称为轻链(Verrey等人，1999年,2000). 一个二硫键将这些gpaAT共价连接到其相关糖蛋白4F2hc公司/CD98。

在表达系统中进行的功能实验表明，这两个L型转运体起交换作用(Mastroberardino等人，1998年;Pineda等人，1999年;Rossier等人，1999年). 对于LAT2-4F2hc公司，一些相互矛盾的数据已经公布。我们的实验室和Palacin的实验室已经表明我-Phe和我-Ile依赖于细胞外摄取底物的存在，如预期的强制性交换(Pineda等人，1999年;Rossier等人，1999年). 相反我-Kanai及其同事观察到的Leu被解释为促进扩散(Segawa等人，1999年). 报道了两种L型转运蛋白之间的一些功能差异，特别是LAT2-4F2hc公司具有比LAT1-4F2更宽的选择性范围碳氢化合物因为它还调节较小中性氨基酸的摄取。

两种L型转运蛋白的组织分布和亚细胞定位表明它们必须发挥不同的作用。LAT1-4F2hc公司广泛存在于增殖组织中，尤其在肿瘤中高表达，提示其在氨基酸摄取中起作用(Wolf等人，1996年;Nakamura等人，1999年;Campbell等人，2000年)（另请参见图中的示意图6). 相反，LAT2-4F2hc公司仅在含有上皮屏障的组织中发现(Bassi等人，1999年;Pineda等人，1999年;Rossier等人，1999年;Segawa等人，1999年;Rajan等人，2000年). 在小肠和近端肾小管的（再）吸收上皮中，它在上皮细胞的基底外侧高度表达(Rossier等人，1999年). 我们认为，它的作用可能是将一些中性氨基酸挤出细胞外空间，以交换其他细胞外中性氨基酸。反过来，这些后一种氨基酸将通过一个平行功能的单向输出系统再循环到细胞外空间，该系统尚未被表征，可能显示出有限的选择性范围(Verrey等人，1999年,2000). 最近克隆了一个编码这种外排途径可能候选基因的cDNA(Kim等人，2001年). 然而，这种新的转运蛋白类似于H⁺/单羧酸转运体不能作为肾近端小管的基底外侧流出途径，因为它在该器官中不表达(Kim等人，2001年). LAT2-4F2的作用hc公司因此，跨上皮运输似乎与y的运输是互补的⁺LAT1-4F2hc公司它将阳离子氨基酸基底侧挤出，以交换细胞外中性氨基酸和钠⁺(Torrents等人，1998年;Pfeiffer等人，1999b;Kanai等人，2000年).

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图6。LAT2-和LAT1-4F2所起作用的示意图碳氢化合物分别在上皮细胞和非上皮细胞中拓宽氨基酸转运选择性范围。(A类)中性氨基酸（AA）通过顶端转运蛋白（B）从管腔侧进入上皮细胞⁰和b^0,+AT-rBAT和/或其他）。我们假设一些中性氨基酸（AAX）通过尚未表征的外排途径穿过基底外侧膜，并且具有有限的底物选择性。这些氨基酸中的一些是必需交换器LAT2-4F2的摄取底物hc公司再循环回细胞，从而允许通过LAT2-4F2流出hc公司细胞中积累的其他中性氨基酸（AAY）。(B类)在该示例中，优先小中性氨基酸（AAX′）的混合物通过二级活性运输系统（系统a）积累到（生长）细胞中。这些氨基酸中的一些是LAT1-4F2的外排底物hc公司被该交换器回收到细胞外空间，从而驱动大的中性氨基酸（AAY′）的吸收。

了解两种L型转运体在增殖细胞（LAT1-4F2）中的功能作用hc公司)以及跨上皮运输（LAT2-4F2hc公司)需要验证它们的交换器功能，并测量它们的交换化学计量比。此外，还需要确定它们的细胞内选择性范围和对氨基酸的表观亲和力。本研究在爪蟾卵母细胞表达系统通过使用氨基酸注射来修改细胞内氨基酸库，并通过示踪物测量和氨基酸分析来量化氨基酸通量。

结果

非洲爪蟾卵母细胞内生氨基酸库

表达4F2的卵母细胞内源性游离氨基酸的测定hc公司单独或与LAT1或LAT2一起使用表明，转运体的表达对卵母细胞内的氨基酸库没有明显影响（图1). 在无氨基酸缓冲液中表达转运体的卵母细胞缺乏氨基酸耗竭，间接证实了我们早期的结论，即这些转运体并不介导促进扩散。卵母细胞中测得的氨基酸绝对量与泰勒和史密斯（1987），除了一些氨基酸(我-瑟，我-瓦尔，我-他的，我-赖氨酸和我-Arg），其数量有很大不同（图1). 造成这种差异的原因尚不清楚。

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图1。内源性氨基酸库爪蟾卵母细胞不受LAT1-或LAT2-4F2表达的影响hc公司在缺乏细胞外氨基酸的情况下。用HPLC分离卵母细胞中的氨基酸，并按照材料和方法中的描述进行定量。显示了从四个独立实验中收集的16个卵母细胞的平均值。4F2的平均值hc公司-表达的卵母细胞在pmol/卵母细胞条形图下方给出。为了进行比较泰勒和史密斯（1987）给出了。

LAT1-和LAT2-4F2hc介导的氨基酸交换的化学计量学

为了测量交换的化学计量比，卵母细胞注射1 nmol我-Phe并在有或无细胞外物质的情况下孵育4小时我-Trp（500µM）。之所以选择这些氨基酸，是因为它们是L型转运体的良好运输底物，也是因为初步实验表明它们在4小时孵育期内不会在卵母细胞中显著代谢。在此孵育过程中，表达4F2的卵母细胞内或细胞外氨基酸没有显著变化hc公司单独（阴性对照），即使存在细胞外我-Trp（图2). 当LAT1或LAT2与4F2共表达时hc公司，氨基酸的平均量(我-在标称无细胞外基质的情况下，孵育4 h期间卵母细胞泄漏的Phe）与阴性对照组无显著差异[12.5±7.6和1.1±0.4 pmol/卵母细胞vs 4.2±2.2 pmol/卵子(n个= 6)]. 因此，可能没有相关的超零流出我-Phe通过系统L输送装置。或者，如果存在这种促进扩散流出，则在LAT1-4F2的情况下，其值小于相应汇率的9%hc公司LAT2-4F2为4%hc公司（95%置信区间的上限）。

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图2。氨基酸分析显示LAT1-4F2的氨基酸交换化学计量为1:1hc公司和LAT2-4F2碳氢化合物.表达4F2的卵母细胞hc公司单独或与LAT1或LAT2一起注射1 nmol我-苯丙氨酸。然后在注射后（0 h）或在ND96中孵育4 h后立即进行氨基酸分析，无论是否使用500µM我-事务处理。显示了来自两个独立实验±SD的八个卵母细胞的平均值。

相反，当卵母细胞在含有我-Trp、，我-Phe出现在外面我-卵母细胞内部的Trp。内源性氨基酸的数量没有可测量的变化，这与轻链的共同表达或我-Trp外部（未显示数据）。

以下金额我-Phe出现在外面我-Trp出现在内部(我-培养4小时后Trp减去我-在同一卵母细胞池中测得的Trp几乎相同。较小且无显著差异（<15%我-Phe流出比我-Trp内流）可能由一些内源性氨基酸的外排作用来解释我-Phe（即。我-他的，我-泰尔等）。然而，该结果完全支持这样的假设，即通过两个L系统转运蛋白进行的氨基酸交换与1:1的化学计量比相耦合。

这些实验表明，在注入大量外排底物的情况下，只有少量内源性氨基酸参与交换。因此，即使不校正内源性氨基酸，示踪通量实验也应产生1:1范围内的化学计量比。事实上，在LAT2-4F2中进行的示踪实验hc公司-表达的卵母细胞表明，卵母细胞的内流和外排速率与同型交换相似我-Phe和用于细胞外的异种交换我-Phe对抗细胞内我-Cys（图三). 因此，这些实验证实了其他流入(我-Phe）和流出(我-Cys）底物LAT2-4F2的1:1交换化学计量hc公司.

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图3。氨基酸通量率测量揭示了LAT2-4F2介导的氨基酸交换的1:1化学计量hc公司用表达4F2的卵母细胞进行示踪流入和流出测量hc公司单独或与LAT2一起；1 nmol的我-Phe或1 nmol我-每个卵母细胞注射Cys（用于外排测量以及1 pmol的我-[^三H] Phe或我-[³⁵S] Cys）。在1 mM的情况下测量流入和流出我-Phe在外面。条形图表示从两个独立实验中汇集的12个卵母细胞或12等分（分别用于流入或流出）的平均值±SE。

注射氨基酸对氨基酸内流的反式刺激

使用氨基酸分析测量传输速率（流入和流出）（图2)以及在注入放射性标记氨基酸的卵母细胞上进行的流出量测量（图三以及未显示的数据），确认通过LAT1-和LAT2-4F2的流出hc公司取决于细胞外内流底物的存在。鉴于1:1交换化学计量比（图2和和3），三)反之亦然，即内流速率取决于细胞内外排底物的可用性(Verrey等人，2000年). 因此，如果细胞内浓度的范围明显低于允许的最大流出速度，改变细胞内氨基酸的可用性应相应地影响（反模拟）底物摄取率。

为了验证卵母细胞内内源性氨基酸浓度限制氨基酸摄取速率的假设，我们首先注射1 nmol我-Phe（或仅H₂O）并测量其摄取率我-[^三H] Phe 4小时后。注入量我-选择的Phe（1 nmol）远高于内源性氨基酸（见图1)估计会导致额外的细胞内我-Phe浓度为～2.5 mM。后者的估计基于以下假设：我-Phe为～0.4µl，对应于第5和第6阶段测定的水量爪蟾卵母细胞泰勒和史密斯（1987）.

如图所示4A、预注射1 nmol我-Phe大量反式刺激了我-[^三H] Phe，表明内源性底物氨基酸的浓度远低于最大转运蛋白激活所需的浓度。在这一系列实验中我-[^三H] LAT1-4F2患者的Phe摄取率为9倍hc公司-表达卵母细胞和6.5倍的LAT2-4F2hc公司-表达卵母细胞。

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图4。LAT1-和LAT2-4F2hc公司-调解的我-[^三H] 苯丙氨酸的摄取受到注入底物氨基酸的强烈反式刺激。我-在4小时或30分钟（对于我-卢，我-Arg和我-Glu）注射1 nmol指定氨基酸后。(A类)平均值我-[^三H] 预注射或不注射1 nmol时的Phe摄取率我-苯丙氨酸。n个=78–80个卵母细胞，来自13个独立实验。(B类和C类)横向模拟我-[^三H] 各种注入的Phe流入我-氨基酸（黑色条）。对每个实验的结果进行标准化，将注射1 nmol我-Phe和车辆。对于每种氨基酸，显示了从2-4个独立实验中收集的14-56个卵母细胞的平均值。流入率（相对于我-[^三H] 显示相同氨基酸（100µM）的Phe）以进行比较（白色条）。流入数据编译自Mastroberardino等人（1998年）,Rossier等人（1999）和新实验。(D类)用注射1 nmol我-Cys（1 pmol我-[³⁵S] Cys作为示踪剂）。卵母细胞在含有1mM的（+Na）溶液中孵育我-苯丙氨酸。显示了从两个独立实验中汇集的六份等分试样的平均值。

LAT1-4F2hc和LAT2-4F2hc细胞内氨基酸选择性的测定

我们通过比较各种预注射氨基酸（1 nmol，相当于～2.5 mM）诱导的跨刺激与1 nmol我-苯丙氨酸。图4B和C显示了一个总结，其中每个注入的氨基酸所施加的反式刺激表示为与我-苯丙氨酸。为了进行比较，相同氨基酸（100µM）的相对内流率显示在相同的面板中[数据汇编自马斯特罗贝拉迪诺等. (1998),罗西尔等. (1999)和当前研究(我-Cys和我-序列号）]。

一些预先注射的氨基酸在LAT1-4F2上显示出不同的跨刺激效率hc公司-和LAT2-4F2hc公司-调解的我-[^三H] Phe摄取。换句话说，这两种L型转运体表现出不同的细胞内底物选择性。对于LAT1-4F2hc公司，没有一种被测试的氨基酸比我-Phe，对于LAT2-4F2hc公司，仅限我-Cys和可能我-Trp支持比我-苯丙氨酸。

重要的是，上皮LAT2-4F2hc公司具有比LAT1-4F2更宽的流出底物选择性范围hc公司事实上，仅在LAT2-4F2的情况下，大约一半的注射氨基酸跨刺激摄取hc公司表达（Gly，我-序列，我-Gln）或至少在LAT2-4F2的情况下更好碳氢化合物大于LAT1-4F2hc公司(我-Trp、，我-瓦尔，我-阿拉，我-Cys）。一个例外是我-Leu对LAT1-4F2产生更强的反式刺激hc公司-与LAT2-4F2相比hc公司-介导摄取。

确认观察到的跨模拟我-Phe内流与注射氨基酸的外排相对应，我们比较了注射的外排时间过程我-[³⁵S] Cys通过两个输送机（图4D） ●●●●。正如差分跨模拟结果所预期的那样（图4B和C），在细胞外存在的情况下大量快速和持续流出我-Phe仅在LAT2-4F2时观察到hc公司表达了。

图中使用的一些跨模拟测量4在注射氨基酸后30min而不是4h进行。例如，情况就是这样的我-Leu，我们注意到注射量1 nmol在4小时内减少了约50%，而注射我-Phe和我-Trp保持稳定。这一减少我-亮氨酸既没有伴随其他细胞内氨基酸的变化，也没有出现我-亮氨酸在外，因此可能是由于代谢分解。横向模拟我-Glu和by我-在注射后30分钟也进行了精氨酸注射，因为第一次实验表明，这些氨基酸的高细胞内水平会导致跨刺激的时间依赖性增加，这表明出现了作为外排底物的代谢物。注射的跨模拟我-Glu或我-LAT2的Arg高于LAT1-4F2碳氢化合物与该代谢物是我-Gln，因为这是LAT2-比LAT1-4F2更好的流出底物碳氢化合物.

综合起来，图中所示的跨模拟实验4B和C表明通过LAT1-和LAT2-4F2流出的选择性范围和等级顺序hc公司在很大程度上对应于流入。

细胞内氨基酸对LAT1-和LAT2-4F2hc的低表观亲和力

获得LAT1-和LAT2-4F2半最大激活所需的细胞内氨基酸浓度估计值hc公司，我们通过增加注射氨基酸的量进行了跨刺激实验。我们选择注射我-伊利，我-Ala和Gly由于其不同的跨模拟能力（见图4B和C），它们在卵母细胞中的稳定性及其在水中的溶解度。结果如图所示5并表示为我-[^三H] 注射水的对照卵母细胞对苯丙氨酸的吸收（仅内源性氨基酸库）。在所有测量到大量跨模拟的情况下，将修改后的Hill方程拟合到实验点，得出Hill系数为1（介于1.00和1.07之间）。因此，拟合了与Michaelis–Menten动力学相对应的曲线，并且V（V）_最大值和明显的K（K）_米可以导出值（表我). 对于LAT1-4F2hc公司，注射的最大跨刺激我-Ile是约40倍，这意味着卵母细胞内源性胞内氨基酸库仅支持约2.5%的V（V）_最大值.小氨基酸我-丙氨酸和甘氨酸没有通过LAT1-4F2实质性地跨刺激摄取hc公司估计通过注射～19 nmol我-每个卵母细胞。假设分配体积为0.4µl，这对应于K（K）_米对于我-Ile为～50 mM（见计算材料和方法）。的绝对值x个-曲线拟合产生的轴截距对应于我-这将对内流速度产生与内源性氨基酸混合物相同的反式刺激作用。

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图5。注射氨基酸的反式刺激的剂量依赖性显示出低的细胞内表观亲和力。注射不同量氨基酸后4小时，我-进行Phe摄取。摄取率标准化为H的平均值₂O注入卵母细胞。(A类) n个=每个数据点12个卵母细胞，来自两个独立实验(我-Ile）。我-Ala和Gly：n个=每个实验数据点6个。(B类) n个=每个数据点12个卵母细胞，来自所有三种氨基酸的两个独立实验。

表一。

LAT1-和LAT2-4F2的细胞内外动力学比较hc公司

	LAT1-4F2hc公司			LAT2-4F2hc公司
	外部外观K（K）_米（百万）^一	最大流入跨模拟（分数变化）^b条	内部外观K（K）_米（百万）^b条	外部外观K（K）_米（百万）^一	最大流入跨模拟（分数变化）^b条	内部外观K（K）_米（百万）^b条
我-伊利	38.7 ± 5.3 × 10^–6	39.7 ± 5.7	49.5 ± 9.5 × 10^–3	36.5 ± 9.5 × 10^–6	9.3 ± 1.4	7.0 ± 2.5 × 10^–3
我-阿拉	>10 × 10^–3	无显著影响	–	167 × 10^–6	9.1 ± 1.9	27.5 ± 9.5 × 10^–3
格莱	9.0 ± 2.7 × 10^–3	无显著影响	–	4.2 ± 0.7 × 10^–3	7.0 ± 0.5	2.6 ± 0.6 × 10^–3

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^一支持半最大流入率的外部底物浓度（表观K（K）_米)被确定为Rossier等人（1999）.在以下情况下我-Ala，指示值来自Rossier等人（1999）.

^b条数据来自图中所示的流入跨模拟实验5.

对于LAT2-4F2hc公司，最大跨刺激为～9倍我-Ile和我-Ala，Gly略低。这表明卵母细胞内的氨基酸库支持～11%的V（V）_最大值与其他两种氨基酸相比，这种结合的甘氨酸在允许转运蛋白从具有细胞内结合位点的构象转变为具有细胞外结合位点的构型方面可能效率较低。衍生的细胞内表观亲和力高于LAT1-4F2hc公司等级顺序如下：Gly>我-Ile>我-Ala（表（表一我).

总之，L系统转运蛋白底物氨基酸的细胞内表观亲和力远低于细胞外侧的表观亲和力。

讨论

两个方向均无促进扩散

表达LAT1-4F2的卵母细胞缺乏可测量的氨基酸流出hc公司或LAT2-4F2hc公司在缺乏细胞外氨基酸的情况下，即使将大量氨基酸注射到卵母细胞中，也证实了L型转运蛋白不能为氨基酸流出提供促进的扩散途径（图2). 就交替存取模型而言，这意味着在没有配体的情况下，转运体不会（以可测量的速度）从具有细胞外结合位点的构象转变为具有细胞内结合位点的构型。从目前的结果可以推断，反过来也适用，即在没有细胞内配体的情况下，转运蛋白不会（以可测量的速率）从细胞内结合位点构象转变为面向细胞外的结合位点构象。这确实可以从注射的外排底物施加高水平的摄取反式刺激的事实中推断出来，该摄取反式刺激遵循简单的Michaelis–Menten动力学（图4和和5）5)流出与流入相匹配（图2和和3）。三). 然而，尚未正式排除可能发生小规模超零流入（促进扩散）的可能性。由于这种内流只占生理氨基酸浓度下观察到的转运的很小一部分，因此不会发挥任何功能作用。因此，我们可以得出结论，内流和外流之间存在紧密的双向耦合（强制性交换），不允许任何与生理相关的促进氨基酸扩散，无论是内流还是外流。这意味着系统L转运体不能介导净载体氨基酸转移，其功能是补充/延伸位于同一膜中的单向转运体的作用（图6).

流入和流出选择性相似，但表观亲合性不对称

LAT1-和LAT2-4F2选择性范围的比较hc公司细胞外氨基酸（100µM）的摄取，以及细胞内氨基酸跨刺激的选择性范围（每个卵母细胞1 nmol，对应于～2.5 mM）（图4B和C）显示出高度相似性，表明流入底物通常也是流出底物。然而，转运体细胞内侧的明显亲和力（明显K（K）_米= 10^–3–10^–1M）似乎通常比细胞外侧低两到三个数量级（明显K（K）_米= 10^–5–10^–3)（请参见我-Ile和我-表中的Ala表I）。我). 一个特殊的病例是Gly，它用于上皮LAT2-4F2hc公司显示类似的外观K（K）_米细胞内外侧的值（分别为4.2和2.6 mM；表表I我).

了解LAT1-和LAT2-4F2的流入和流出特性hc公司现在我们可以在细胞生长和跨细胞转运的背景下对这些转运蛋白的功能进行一些预测。在这方面，测试系统L-转运体对细胞内底物的低表观亲和力是否独立于细胞类型和/或调节，或是否受到其他未表达的基因产物的调节/调节作用，将是一件有趣的事情爪蟾卵母细胞。

细胞外氨基酸的饱和浓度

在正常条件下，细胞外氨基酸浓度足以使L系统转运蛋白的活性几乎饱和。事实上，我们已经估计了生理性细胞外氨基酸混合物对LAT1-和LAT2-4F2的“底物活性”hc公司基于公布的外观K（K）_米这些转运蛋白的各种氨基酸值及其正常血浆浓度（参见计算材料和方法）(Divino Filho等人，1997年;Fauci等人，1998年;Mastroberadino等人，1998年;Rossier等人，1999年;Segawa等人，1999年). 对于LAT2-4F2hc公司，利用可用数据计算的“底物活性”(Rossier等人，1999年;Segawa等人，1999年)等于20倍K（K）_米值。根据Michaelis–Menten动力学，这种“底物活性”将导致约95%的转运V（V）_最大值对于LAT1-4F2hc公司，可用的表观亲和力数据不太完整(Mastroberardino等人，1998年)，但表明“底物活性”至少是K（K）_米从而导致运输率超过V（V）_最大值因此，在这两种情况下，转运蛋白的活性基本上不受细胞外氨基酸浓度的控制，因此，控制稳定的细胞外氨基酸的浓度不可能是这些转运蛋白的生理作用。

LAT1生理作用的含义

因为它们是必需的交换物，所以L型转运蛋白不会改变膜两侧的总氨基酸浓度比，而是作用于氨基酸的比例分布。如上所述，它们对细胞内和细胞外底物氨基酸的选择性范围相似。例如，普遍存在的转运蛋白LAT1-4F2hc公司从外部主要接受大的中性氨基酸，特别是我-苯丙氨酸，我-泰尔，我-卢，我-伊利，我-他的，我-Trp和我-Val和我-会议。LAT1-4F2对这些不同氨基酸的相对转运速率hc公司取决于其“底物活性”，即其局部浓度与表观浓度之比K（K）_米.因为表面上K（K）_米这些不同氨基酸的摄取值以及它们的正常细胞外浓度在类似的浓度范围内，我们预计这些氨基酸将以类似的速率被转运到细胞中。的比率我-缬氨酸转运预计也会相似，因为细胞外的K（K）_米这种氨基酸的高浓度被其较高的细胞外浓度所补偿。

注射到卵母细胞中用于反式刺激实验的氨基酸量如图所示4B和C远远低于表面K（K）_米因此在激活曲线的线性范围内（见图5). 因此，我们可以认为图中所示的各种注射氨基酸的相对跨刺激效应4B大致与细胞内的表观亲和力成正比（1/K（K）_米)假设各种氨基酸显示相似V（V）_最大值由于上述所有典型的系统L底物都产生类似的跨刺激，我们可以得出结论，它们通过LAT1-4F2的流出率hc公司主要由它们各自的细胞内浓度决定。

在以下情况下爪蟾卵母细胞内内源性氨基酸的低浓度限制了通过LAT1-4F2的转运速率hc公司低至～2.5%V（V）_最大值（参见图中的40倍跨模拟5). 公布的细胞内氨基酸浓度(Divino Filho等人，1997年)提示在其他细胞类型中，细胞内氨基酸“底物活性”可能比卵母细胞中的高，但仍低于通过LAT1-4F2半最大激活流出所需的活性hc公司因此，内流、代谢或蛋白质合成/降解引起的细胞内氨基酸浓度的变化会相应地改变系统L的交换活性。例如，如果次级活性氨基酸转运系统A被诱导并导入氨基酸，则细胞内小氨基酸的浓度以及我-他的和我-已见人数增加(Reimer等人，2000年;Sugawara等人，2000a,b条;Varoqui等人，2000年;Albers等人，2001年). 作为LAT1-4F2外排底物的累积氨基酸hc公司（例如。我-他的和我-Met）可通过LAT1-4F2进行交换hc公司与其他底物作用，使细胞内的氨基酸浓度达到平衡（图6B） ●●●●。换句话说，LAT1-4F2hc公司当它与活性系统A在同一膜中表达时，可以将氨基酸吸收的选择性范围扩大到大的中性氨基酸。因此，可以想象，在某些情况下，系统L的表达可能会起作用，通过控制必需氨基酸（如我-最近的转染实验表明Leu(坎贝尔和汤普森，2001年). 这种转运蛋白的表达可能在细胞增殖中发挥重要作用的另一个迹象是，它在许多肿瘤和增殖组织中表达(Campbell等人，2000年).

类似的推理也适用于血脑屏障，其中LAT1已被证明在内皮细胞的管腔膜和对管腔膜上表达(Boado等人，1999年;Duelli等人，2000年;Kageyama等人，2000年;Matsuo等人，2000年). 因此，LAT1-4F2的作用hc公司最有可能的是两个膜上氨基酸分布的平衡，而其他转运蛋白决定了实际的氨基酸净流量。

就胎盘而言，情况更为复杂，因为LAT1的分布明显不对称，有人建议LAT1富集于刷状缘膜（母体侧），而LAT2和y⁺LAT1表达于基底膜（胎儿侧），类似于其在小肠和近端肾小管的基底外侧定位(库多和博伊德，2000年,2001;Jansson，2001年;里奇和泰勒，2001年). LAT1在胎盘合胞体滋养层母细胞侧衬刷状缘膜中的作用可能类似于其在生长细胞中的作用，即将通过单向转运体从母体血液中摄取的氨基酸的选择性范围扩展到大的中性氨基酸。

上皮屏障和胎盘LAT2-4F2hc功能的生理意义

从其定位于氨基酸转运上皮的基底外侧膜，如小肠和肾脏近端小管，以及可能定位于胎盘合胞体滋养层细胞的基底膜，可以清楚地看出LAT2-4F2hc公司在跨细胞氨基酸转运中发挥作用（图6A） ●●●●。与LAT1-4F2相比hc公司这种转运体对内流和外流具有选择性范围，略微扩展到较小的中性氨基酸(Pineda等人，1999年;Rossier等人，1999年;Segawa等人，1999年)（图4B和C）。事实上，相同的内源性氨基酸库爪蟾卵母细胞支持较高的LAT2-4F2活性hc公司（11%）比LAT1-4F2hc公司（2.5%）当然部分是由于更广泛的选择性范围，但也似乎是由于细胞内的表观亲和力较高（表我). 我们认为LAT1-4F2的这些不同的细胞内表观亲和力碳氢化合物和LAT2-4F2碳氢化合物可能有利于大的中性氨基酸的矢量跨细胞流动。

一个有趣的方面是Gly对LAT2-4F2细胞内结合位点相对较高的表观亲和力hc公司这表明LAT2-4F2的重要作用hc公司这种小氨基酸的跨细胞转运和分泌的载体性。相反，我-Leu似乎是LAT2-4F2的不良外排底物hc公司相对于它对流入的高度表观亲和力。因此，如果有一个平行的流出途径我-Leu，这种氨基酸可以作为循环物种，通过LAT2-4F2驱动其他中性氨基酸的基底外侧流出hc公司.其中一种流出基质肯定是我-Cys在我们的跨刺激分析中最有效（图4B） ●●●●。鉴于以下事实，这很有趣我-Cys在很大程度上进入肾脏近端小管细胞我-胱氨酸通过顶端异二聚体二元酸转运蛋白b^0,+AT-rBAT在胱氨酸尿症中有缺陷(Chairoungdua等人，1999年;Feliubadalo等人，1999年;Pfeiffer等人，1999a). 因此，研究LAT2-4F2的功能障碍是否hc公司也会导致尿量增加我-赛斯。

总之，LAT1-和LAT2-4F2hc公司提高跨膜氨基酸向大分子中性氨基酸的选择性范围。两者都是必需的交换物，表现出相对较低的细胞内表观底物亲和力，这与其较高的细胞外亲和力形成对比；因此，它们通过相应地调节其交换活性来响应细胞内氨基酸浓度的变化。我们认为LAT1-和LAT2-4F2的差异动力学和选择性特性hc公司支持它们在氨基酸吸收和流出方面分别作为“选择性范围增强剂”的作用。

材料和方法

cRNA合成

含有小时4F2层碳氢化合物（矢量pSport）(Teixeira等人，1987年),小时LAT1（pcDNA1/Amp-pSP64T）(Mastroberardino等人，1998年)和米LAT2（pSD5easy）(Rossier等人，1999年)使用限制位置进行线性化Hin公司dIII，生态RV或Bgl公司二、分别是。根据标准协议，分别用T7和SP6 RNA聚合酶（Promega）合成cRNA。

非洲爪蟾卵母细胞

卵母细胞在室温下用胶原酶A在Ca中处理2–3小时²⁺-含有82.5 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl的游离缓冲液₂和10 mM HEPES pH 7.4，然后在含有96 mM NaCl、2 mM KCl和1 mM MgCl的ND96缓冲液中保持16°C₂，1.8 mM氯化钙₂和5 mM HEPES，pH值7.4。

氨基酸分析

卵母细胞注射5 ng溶解于33 nl水中的相应cRNA，然后在16°C的ND96缓冲液中培养18 h。如有指示，1 nmol我-然后将溶于33 nl水中的Phe注入卵母细胞。随后，将每种条件下的四个卵母细胞在ND96中清洗六次，并在100µl ND96±补充500µM中孵育4小时我-事务处理。为了量化卵母细胞内外氨基酸水平的变化，对孵化前后的卵母细胞和缓冲液以及孵化前最后一次清洗的缓冲液（零值）进行氨基酸分析。样品制备如下：卵母细胞在ND96中洗涤六次，并在120µl卵母细胞裂解缓冲液中溶解，该缓冲液含有50 mM Tris–HCl pH 8.0、120 mM NaCl和0.5%IGPAL CA-630（Sigma）。将裂解液涡旋20 s，在冰上短暂培养，并在4°C的Eppendorf离心机中在12000 r.p.m.下离心30 min。用5-磺基水杨酸（2.5 g/100 ml最终浓度）沉淀蛋白质。将样品涡流20 s，在冰上培养1 h，并在4°C、15000 r.p.m.下离心5 min。上清液用苯酚/氯仿/异戊醇萃取。为了分析细胞外缓冲液的氨基酸含量，采集了90µl的样品，并使用柠檬酸（0.1 M最终浓度）调整其pH值。使用Biochrom 20氨基酸分析仪（Pharmacia，Biotech）通过柱后衍生法使用o个-邻苯二甲醛作为检测试剂。

横向模拟我-[^三H] 苯丙氨酸内流

这个爪蟾卵母细胞的特性对于研究外源性表达氨基酸转运蛋白的细胞内动力学非常有用。首先，内源性转运（背景）非常低。第二，内源性中性和阳离子氨基酸的浓度相对较低，第三，卵母细胞很容易注射已知量的氨基酸底物，在实验过程中，氨基酸底物的水平基本保持稳定。对于反式刺激实验，卵母细胞注射相应的cRNA，并在18小时后注射给定量的指定氨基酸（溶于33nl的h₂O） ●●●●。在ND96中16°C下30分钟或4小时后，用ND96洗涤卵母细胞6次，每种条件下5-12个卵母细胞在22°C下预孵育2分钟。用添加了500µM的ND96替换缓冲液我-Phe和我-[^三H] Phe作为示踪剂。在3分钟的时间内测量吸收量，试点实验显示其传输速率恒定。用3 ml ND96冲洗卵母细胞五次，停止吸收。然后将卵母细胞分配到各个小瓶中，在2%十二烷基硫酸钠中溶解，并通过液体闪烁测定放射性。

底物活性和细胞内外表观钾的计算_米值

氨基酸混合物的“底物活性”在此定义为该混合物在膜的给定侧激活转运蛋白的能力。假设混合物中的每个氨基酸底物都是根据Michaelis–Menten动力学运输的，并且支持相同的底物活性，则“底物活性”可以计算如下V（V）_最大值。后一种假设基于Segawa等人（1999）并在我们的实验室中获得（L.Mastroberardino和C.Meier，未发表的数据），这表明V（V）_最大值不同氨基酸底物的内流值大多彼此非常相似。然后，底物活性由以下公式得出：

底物活性=[aa₁]/K（K）_米aa公司₁+【aa】₂]/K（K）_米aa公司₂+…+[aa_我]/K（K）_米aa公司_我(1)

其中[aa_n个]代表浓度和K（K）_米aa公司_n个混合物中每种底物氨基酸的表观亲和力。因此，如果氨基酸混合物对给定的转运蛋白显示底物活性为1（无量纲），则它支持半最大转运速率。

估计表面K（K）_米对于来自剂量依赖性实验的任何单个胞外或胞内氨基酸，使用Prism（版本3.02；GraphPad，加利福尼亚州圣地亚哥）根据Michaelis–Menten动力学将曲线拟合到数据。对于细胞外基质对氨基酸吸收的激活，所用的迈克利斯-曼滕方程为：

v（v）=V（V）_最大值×[aa]/（[aa]+K（K）_米) (2)

对于任何单一注射氨基酸引起的跨刺激内流，方程式（2）进行了修改，以解释这样一个事实，即注射没有氨基酸的卵母细胞显示出一个基线内流率，这是由于细胞内氨基酸库的存在。在每一个实验中，这个基线速率被用来标准化在不同量的注入氨基酸下测得的内流速率，从而得出相对传输速率(v（v）_第页,V（V）_{最大值，r})对应于相对跨模拟水平(T型_第页). 内源性氨基酸库表示为数量B类注射的氨基酸（nmol/卵母细胞）会反式刺激内流，其程度与内源性池相同（因此会产生T型_第页第页，共页）。引入相对运输费率和B类（以nmol/卵母细胞为单位）在方程（2）中产生：

T型_第页=V（V）_{最大值，r}×（[aa]+B类)/（（[aa]）+B类) +K（K）′_米) (3)

哪里K（K）′_米代表(K（K）_米–B类)并且在nmol/卵母细胞中表达，其中注射的氨基酸[aa]量也在nmol/卵母细胞内给出。现在可以进一步简化方程式（3），以适应未注射氨基酸的情况（[aa]=0），因此T型_第页=1（见上文），以便B类（nmol/卵母细胞）可表达如下：

B类=K（K）′_米/(V（V）_{最大值，r}– 1) (4)

将等式（4）代入等式（3）中，相对跨模拟变为：

T型_第页=V（V）_最大值×[（[aa]+(K（K）′_米/(V（V）_最大值–1））/（（[aa]+(K（K）′_米/(V（V）_最大值– 1))) +K（K）′_米)] (5)

利用该方程，用最小二乘法将曲线拟合到平均值（两个实验中的12个卵母细胞）。细胞内表观K（K）_米（M）然后根据导出的K（K）′_米和B类，取0.4µl作为细胞内氨基酸分布体积（见结果）：

K（K）_米= (K（K）′_米+B类)/0.4微升（6）

爪蟾卵母细胞注射氨基酸流出量

爪蟾卵母细胞注射5 ng溶于33 nl水中的cRNA，并在16°C的ND96缓冲液中孵育18 h。然后，将指示的放射性标记氨基酸溶解在33 nl水中注入卵母细胞。在注射前和流出测量之间，卵母细胞在ND96中16°C下保存4小时，以测试是否存在可能的泄漏，并绕过可能的容量调节效应。在此期间未观察到标记氨基酸的重复泄漏。然后用含有100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl的（+Na）缓冲液洗涤卵母细胞六次₂，1 mM氯化钙₂和10 mM HEPES pH值7.5，并在流出测量开始时再次进行三次。对于每组四个卵母细胞，用300µl补充有指定浓度氨基酸的（+Na）-缓冲液代替缓冲液。在孵育开始后的不同时间点（22°C）取三等分4µl缓冲液，通过液体闪烁测定放射性。单元格我-[^三H] Phe或我-[³⁵S] 在2%SDS中溶解卵母细胞后，通过液体闪烁测定Cys。计算化学计量比的绝对流出值时，考虑到注射和随后的预培养期间发生的放射性测量损失，总计为0.2-25%。

统计

数据表示为平均值±SE（氨基酸分析中的SD）。对照值之间的差异（卵母细胞表达4F2hc公司单独）和测试值（4F2hc公司+LAT1或LAT2）使用学生的t吨-测试（双尾，未配对）。使用ANOVA和Dunnett的多重比较测试评估可能促进扩散（流出）的上限。

致谢

作者感谢伊恩·福斯特进行了富有成果的讨论，塞斯·阿尔珀和伊恩·弗斯特阅读了手稿，克里斯蒂安·加斯尔创作了艺术品，伯恩德·古特支持并使用氨基酸分析仪。这项工作得到了瑞士国家科学基金会对F.V.的31-59141.99号拨款的支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团

细胞内底物激活系统L异二聚氨基酸交换器

斯特凡·克劳泽

弗朗索瓦·维里

摘要

介绍