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分子生物学细胞。2000年9月；11(9): 3137–3153.
数字对象标识：10.1091桶/桶11.9.3137
预防性维修识别码：项目经理14981
PMID：10982406

Syntaxin 7定位于晚期内膜小室，相关带有Vamp 8，并且是后期内切体-溶酶体融合所必需的

芭芭拉·穆洛克,* 切兹·史密斯,† 古德伦·伊尔克,* 尼古拉斯·A·布莱特,* 玛格丽特·林泽,‡ 艾玛·J·帕金森,§ 道格·A·布鲁克斯,§ 罗伯特·G·帕顿,‡ 大卫·E·詹姆斯,‖ J.保罗·卢西奥,*和罗伯特·C·派珀†
休·R.B.佩勒姆，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

来自细胞表面或反式-高尔基体网络通过一系列内胚体隔室。内吞途径的最后一步是晚期内体与溶酶体的融合。这个过程已经体外重组，已证明需要NSF、α和γSNAP和基于Rab GDI抑制的Rab GTPase。在酿酒酵母，融合事件溶酶体样空泡由联合蛋白Vam3p介导局限于液泡膜。为了识别控制溶酶体融合事件的分子机制，我们搜索Vam3p的哺乳动物同源物。其中一位候选人是syntaxin 7。这里我们显示syntaxin 7在晚期集中内体和溶酶体。免疫共沉淀实验表明syntaxin 7与内胚体v-SNARE Vamp 8相关，后者部分与syntaxin 7共定位。重要的是，我们证明了这一点syntaxin 7是晚期内体融合所必需的与体外溶酶体结合，形成杂交细胞器。一起，这些数据确定了SNARE复合体的后期功能动物细胞的内吞系统。

简介

不循环到质膜或这个反式-高尔基网络最终交付给溶酶体。作为蛋白质降解的主要场所之一，溶酶体也是吞噬物质和自噬蛋白。有足够的数据支持以下观点所有这些途径都汇聚在晚期内吞区室中与溶酶体融合(福特等。, 1996;梅尔曼，1996;Storrie和Desjardins，1996年;明亮等。, 1997).然而，关于介导的分子机制知之甚少这个融合过程。

晚期内体和溶酶体之间的融合过程体内和体外检测。该过程的特点是具有中间性质的杂交细胞器的形成两个隔间，意味着物质继续从这里流出杂交是最终重组致密溶酶体所必需的(明亮等。, 1997;马洛克等。, 1998;卢齐奥等。, 2000;普赖尔等。, 2000). 另一种选择假设晚期内体通过以下方式将其货物转移到溶酶体简略的“kiss-and-run”场景(Storrie和Desjardins，1996). 这两种模型不同于溶酶体的概念来自内吞小室的“成熟”依赖于高度特异性与已有溶酶体的融合事件(梅尔曼，1996年). 上一个研究已确定一些分子参与了内切体和溶酶体融合，如NSF和Rab GDI敏感性GTP酶。然而，更好地理解这一整体过程将需要对介导的蛋白质进行更详细的表征这个特定的聚变事件(Mullock公司等。, 1998).

在过去几年中，SNARE假说提供了一个贯穿多个融合事件的强制机制模型分泌和内吞途径(罗斯曼和沃伦，1994年;罗斯曼和Wieland，1996年)，由SNARE的特定组合介导体内不同的融合事件(贝内特，1995年). SNARE蛋白质形成一个非常稳定的线圈域并行阵列，形成一个四螺旋束；人们认为，这个综合体的形成可能提供一些驱动囊泡融合的能量(汉森et（等）阿尔。, 1997;波里埃等。, 1998;萨顿et（等）阿尔。, 1998;韦伯等。, 1998). 因为v-SNARE在运输囊泡和靶细胞中发现了t-SNARE蛋白细胞器，将v-和t-SNARE分类为R可能更有用-和Q-SNARE，根据其结构组成(法绍尔等。, 1998;萨顿等。, 1998).尽管核心复合物的化学计量比可能因SNARE蛋白质的特殊集合(卡尔等。, 1999;非德国人等。, 1999)一般来说，v-SNARE有助于排列的束内部的关键精氨酸残留谷氨酰胺残基由来自t-SNARE形成核心复合体(萨顿等。, 1998).然而，SNARE介导的运输步骤尚不清楚的是哪些步骤是由最近描述的SNARE蛋白以及调节这些蛋白特异性的因素步骤，尤其是整个内吞途径，其中囊泡转运不太确定。

在酿酒酵母，液泡过程哺乳动物细胞的生物发生与溶酶体生物发生类似(布赖恩特和史蒂文斯，1998年). 许多作用于哺乳动物分泌途径上的离散贩运步骤与酵母t-SNARE表现出最大程度的一致性类似步骤中的功能（即Sed5p与syntaxin最相似5和Sso1p/Sso2p与突触蛋白1-4最相似）(阿尔托et（等）阿尔。, 1993;班菲尔德等。, 1994;罗伊et（等）阿尔。, 1998). 类似的相似之处可能会出现在内吞途径。酵母syntaxin Vam3p定位于酵母液泡，是输送液泡蛋白所必需的遵循多种膜贩运途径(达尔索et（等）阿尔。, 1997;派珀等。, 1997;瓦达等。,1997). 同型液泡融合需要Vam3p(尼科尔斯et（等）阿尔。, 1997;非德国人等。, 1998)，内体融合腔室和带有液泡的普遍自噬细胞器(达尔索等。, 1997)以及新型交通工具的融合携带膜蛋白碱性磷酸酶的中间体液泡(派珀等。, 1997;重新加热等。,1999). 最近，在拟南芥很可能会有类似的情况酵母Vam3p的功能，考虑到其在植物中的定位液泡。由于Vam3p在多种融合中的突出作用在液泡事件中，我们试图从哺乳动物中鉴定t-SNARE可能在功能上对应于Vam3p的单元格。为此，我们已鉴定哺乳动物syntaxin7与酿酒酵母和拟南芥Vam3蛋白。Syntaxin 7（Syn7）最初被提议参与交通来自反式-高尔基网络以内吞系统为基础关于其与Pep12p的序列相似性(王等。, 1997);Syn7与早期内体标记的部分共定位提示在早期内吞系统融合事件中的作用(Wong（王）等。，1998年b). 然而，我们的研究表明Syn7集中在晚期内体和溶酶体中，可在有吸血鬼8号的综合体。重要的是，我们发现Syn7对于晚期内体与溶酶体的体外融合含量测定。这些数据表明，Syn7在在溶酶体生物发生的最后步骤中起关键作用。

材料和方法

材料

DNA操作中使用的酶来自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州贝弗利）、伯林格·曼海姆生物化学公司（印第安纳波利斯）、，贝塞斯达研究实验室（马里兰州盖瑟斯堡）或美国生物化学（俄亥俄州克利夫兰）。放射性材料采购自新英格兰核电站（马萨诸塞州波士顿）和硝化纤维膜来自Micron Separations Inc.（马萨诸塞州韦斯特堡）。所有组织培养试剂来自Life Technologies（马里兰州盖瑟斯堡）。Bicinchonic acid蛋白质试剂来自Pierce（Rockford，IL）。谷胱甘肽-琼脂糖珠来自法玛西亚（瑞典乌普萨拉）。固定的金黄色葡萄球菌购买细胞（IgG Sorb）来自酶中心（马萨诸塞州瓦尔登）。所有其他化学品均为高纯度商业级。俄勒冈州绿-德克萨斯州红-共轭生物素化山羊抗兔和抗鼠二级抗体抗兔抗体和Alexa 488结合链霉亲和素从Molecular Probes（俄勒冈州尤金）购买。FITC-和德克萨斯州红色结合驴抗兔和抗羊二级抗体从Jackson Laboratories（宾夕法尼亚州西格罗夫）购买。HRP结合山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）和ECL检测试剂盒来自Amersham（伊利诺伊州阿灵顿高地）。

DNA和质粒构建

进行DNA操作和DNA介导的转化通过常规程序(萨姆布鲁克等。, 1989). 爆炸通过默克/华盛顿大学表达序列标签进行搜索数据库揭示了几个推定的ORF，它们编码与至Vam3p(阿尔特舒尔等。, 1990). 我们放大了其中一个(H33185号)与寡核苷酸CCATTTCCAGAGTATCGGTGGC和TCTATGCTCTCAAAACATCTCC公司。该PCR片段用于探测小鼠如前所述的3T3-L1 cDNA文库(特勒姆等。,1997). 一个全长克隆被分离并测序以揭示ORF266个氨基酸（GenBank登录号AFO56323型). 顺序与DNASTAR（威斯康星州麦迪逊）进行对比分析MegAlign软件使用Clustal算法。

编码GST–Syn7融合蛋白的质粒pGSTSyn7a由PCR扩增Syn7 ORF的密码子2–242并亚克隆碎片进入巴姆HI–高生态pGEX-3X的RI位点使用寡核苷酸CACAGGATCGAGTTACCACTCCGGATTGG和CTCCAATTCTAAGTTCCTGGATTTGCGCTGA(史密斯和约翰逊，1988). 这个质粒pCWS002编码GST–Vamp 8蛋白转录-PCR扩增小鼠Vamp 8 ORF和将片段亚克隆到巴姆HI–高Xho公司地点使用寡核苷酸的pGEX-4T3CCGGGATCACATGGAGGCCAGTGG和CCGCTCGAGTTACATTCACATTCCA。如前所述，对整个RNA进行Northern分析使用整个cDNA作为探针或使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA探针作为内部探针控制(特勒姆等。, 1997).

一种表达血凝素（HA）的表达质粒（pRCP316）表位标记的Syn7是通过扩增小鼠的完整ORF获得的用寡核苷酸合成7ATGTATCCTTACGACGTACCAGATTACCATTAGCATACCATATGTCCTGACTATGCTCTACCGGGATTGGT和TCAGCCTTCAGTCCCATACGA，并将产生的片段亚克隆到pCDNA-V5–6XHIS（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）。两股结果构造被测序以确定方向和保真度放大。由此产生的质粒表达Syn7 ORF，之前有HA表位的两个串联重复序列（YPYDVPDYAG）。

编码氨基酸1–243的GST–syntaxin 13（Syn13）融合结构Rohan Teasdale博士（莫纳什医学院澳大利亚墨尔本中心）。

抗体

多克隆抗GST抗体及多克隆和单克隆针对GST-Syn7融合蛋白产生抗Syn7抗体由pGSTSyn7a编码。针对GST–由pCWS002编码的Vamp 8融合蛋白。

通过谷胱甘肽-琼脂糖纯化细菌融合蛋白如前所述，用25 mM谷胱甘肽洗脱(史密斯和约翰逊，1988). 两种兔多克隆抗体（#1和#2）和一种提高山羊抗Syn7多克隆抗体并纯化类似地。如前所述进行兔子免疫(罗伯茨等。, 1989). 免疫动物的血清经过一系列亲和纯化步骤以获得特定的GST和Syn7抗体。血清首先通过亲和凝胶柱（Affingel 10和Affingel 15，美国伯乐加利福尼亚州Hercules），GST已附加。抗-GST抗体在0.2 M甘氨酸中洗脱，pH 2.5，在PBS的三个变化中进行透析然后将耗尽的抗GST抗体应用于另一个AffigelGST–Syn7融合蛋白所连接的柱。抗体在0.2 M甘氨酸中洗脱，pH 2.5，并在三个变化中透析PBS公司。制备兔抗Syn7#2 IgG的单价Fab片段根据Coulter和Harris（1983年）然后亲和力被净化完整的抗体。纯化Vamp 8特异性抗体类似地。一种抗血清是针对阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-MPR）是一种格温·古尔德博士（苏格兰格拉斯哥格拉斯哥大学）的礼物，第二次如前所述(里维斯等。,1996). 亲和纯化的抗Rab7兔多克隆抗体是一种Marino Zerial的礼物（德国海德堡EMBL）。单克隆抗体转铁蛋白受体购自Zymed Laboratories（SanFrancisco，CA）和Chemicon（mAb 1451；Temecula，CA）。单克隆抗yntaxin 6和抗早期内体相关蛋白1（EEA1）抗体购自转导实验室（列克星敦，肯塔基州）。HA表位单克隆抗体购自BAbCO（加州伯克利）。多克隆抗突触素6抗体通过亲和纯化GST–syntaxin 6亲和柱，如前所述(特勒姆等。, 1997). 大鼠lgp120的单克隆抗体如下所述以前(格里马尔迪等。, 1987;里维斯等。,1996). 针对大鼠lgp120的兔多克隆抗体是来自加藤敬太郎、田中义武和Himeno Masaru（九州日本福冈大学）(古野等。, 1989).针对GST–Syn13融合蛋白产生抗Syn13抗体或者是Marino Zerial的礼物。兔EEA1多克隆抗体如前所述使用(亩等。1995).针对GST–Syn13融合蛋白产生抗Syn13抗体（抗血清4972）或是Marino Zerial赠送的礼物。

为了生产单克隆抗Syn7抗体Syn7.1C3，杂交瘤细胞系的产生和特征描述如下以前(布鲁克斯等。, 1997). 阳性克隆为通过ELISA和通过筛选GST–Syn13和GST融合蛋白。杂交瘤培养上清液在0.1-ml蛋白G盒（Pharmacia），用0.1M洗脱不2人事军官4，pH 2.5，到1001 M Na的微升2高性能操作4，pH值9.0，然后针对PBS的三个变化进行透析。

细胞培养

Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞与正常大鼠肾（NRK）细胞在37°C、5%的气氛中生长一氧化碳2DMEM补充10%FCS，2 mM我-谷氨酰胺、100 U/l青霉素、100 mg/l链霉素和0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液。细胞生长到接近在150mm培养皿中汇合用于膜制备和冷冻切片免疫电子显微镜或盖玻片免疫荧光显微镜。

按照说明培养WIF-B细胞(伊尔克等。, 1993)经过一些修改。简单地说，细胞是在凯西奥培养的补充改良Ham’s F12培养基（GIBCO/BRL，纽约州格兰德岛）含10μM次黄嘌呤、0.04μM氨基蝶呤、1.6μM胸苷、，和3.5%FCS（Hyclone、Logan、UT）。在实验中，细胞被电镀在0.8–1.2×10的玻璃盖玻片上6细胞/厘米2并进行培养，直到达到最大极化（电镀后10-14天）。

在转染研究中，细胞生长到50%融合在无菌PBS中清洗三次根据制造商的说明（寿命技术）在无血清DMEM中放置10小时。转染用含有10%FCS的DMEM替换培养基，细胞被允许再培养48小时。然后将细胞在1mg/ml的geneticin中培养10d后，菌落分离并筛选HA表位标记的Syn7的表达。

细胞分离

制备了全细胞提取物和全膜组分在−85°C下解剖和储存的大鼠组织。组织在含有PMSF、leupeptin和α-对甲苯基-我-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐在4°C下，然后用聚四氟乙烯/玻璃均匀化25–30次多恩斯。1500×克旋转2分钟上清液部分溶解在Laemmli样品缓冲液中全细胞提取物。

富含晚期内体的杂交大鼠肝脏组分的分离如前所述进行细胞器或溶酶体(马洛克等。, 1998). 简言之，内体/溶酶体杂交细胞器在20%Nycodenz/20%Ficoll梯度界面。电子密度从制备的45%/20%Nycodenz步骤中收集溶酶体梯度。晚期内体是从制备的1–22%中分离出来的菲科尔梯度。

免疫荧光

对MDCK细胞进行免疫荧光检测生长在玻璃盖玻片上，直到50%融合。细胞被固定25°C，在PBS中的2%多聚甲醛中放置20分钟，并渗透在含有50mM甘氨酸的0.2%Triton X-100中培养15分钟。细胞是在含有2%驴血清的PBS中清洗，并标记初级抗体在25°C下持续1小时。培养后，细胞在PBS中清洗三次5分钟，然后培养30分钟结合二级抗体在含有1%驴血清。对于使用兔抗Syn7抗体与小鼠单克隆抗体结合，俄勒冈州绿色结合山羊抗兔和德克萨斯州红色结合山羊使用抗小鼠次级抗体。对于双标签山羊抗Syn7抗体联合使用的实验用兔多克隆抗体、FITC-偶联驴抗羊和德克萨斯州红结合驴抗兔二级抗体已使用。培养后，细胞在PBS中清洗三次5分钟后，将盖玻片安装在滑轨上培养基（50%甘油/1%N个-PBS中的没食子酸丙酯）。

作为免疫荧光标记特异性的测试，平行抗体溶液，含有1:300稀释的兔子或山羊含5%驴血清的PBS中的抗Syn7一级抗体无添加培养或300μg/ml纯化GST-Syn13融合蛋白或300μg/ml GST–Syn7融合蛋白在室温下用于2 h。然后使用抗体溶液标记平行物MDCK细胞盖玻片。使用设置曝光和相同的规格化设置。

用于转染NRK细胞的免疫荧光定位在盖玻片上生长直到50%汇合。细胞洗涤三次25°C下在PBS中放置2次，然后在100%甲醇中固定20分钟−20°C。然后用一级和二级抗体标记细胞如上所述。

将生长在盖玻片上的极化WIF-B细胞固定2分钟（3%）0.2%存在下PBS中的多聚甲醛/0.05%戊二醛37°C下的偏亚硫酸氢钠，用PBS冲洗，并与0.5%硼氢化钠在室温下放置10分钟。细胞是在PBS中的1%BSA/0.1%皂苷中孵育30分钟，然后孵育用稀释在0.5%BSA/0.25%中的一级抗体维持1小时PBS中的皂苷。兔抗Syn13抗血清（编号4972，1:200）含有300μg/ml GST（在添加至单元格）。纯化小鼠IgG至Syn7和亲和纯化抗Vamp 8使用浓度为10μg/ml；小鼠腹水至lgp120和mAb 1451至转铁蛋白受体分别以1:400和1:50稀释；兔lgp120抗血清稀释1:300。用PBS清洗后，用FITC-或Cy3-偶联物培养细胞30分钟二级抗体（分别为10和4μg/ml）。细胞是安装在Prolong Antifade（分子探针）中。

照片由滨松（日本静冈）ORCA拍摄安装在奥林巴斯（日本东京）BX-60配有60×油物镜（数字孔径1.4）的显微镜。在所述实例中，收集了4μm z系列，z步长为0.1μm（共40个截面），带Ludl（纽约州霍桑）每个荧光灯的z步进器。然后对图像堆栈进行处理约束迭代反褶积算法(阿加德et（等）阿尔。, 1989)使用Microtome软件（Vaytek、Fairfield、，IA）和经验确定的点扩散函数蓝色、绿色和红色荧光0.2μm微球（分子探头）。来自每个堆栈（1μm厚）的10幅图像的配对集通过进行最大点投影，然后覆盖使用Adobe Photoshop（Adobe Systems、Mountain View、，加利福尼亚州）。或者，使用莱卡牌手表（雄鹿队Milton Keynes，英国）TCS SP系统蔡司（纽约州桑伍德）LSM510激光扫描显微镜，或美国伯乐激光扫描系统，全部配备63×Plan-Apo物镜（数字孔径1.4）。图像以1024×1024像素的分辨率采集。土砖图像处理使用Photoshop软件。

分离MDCK膜和大鼠的免疫金电镜观察肝膜

固定前的膜制备0–4°C，使用上述程序(马丁等。, 1996). MDCK细胞在HES中清洗三次缓冲液（20 mM HEPES，250 mM蔗糖，1 mM EDTA，pH 7.4），在HES中刮取含有蛋白酶抑制剂的缓冲液（5 ml）（10μg/ml leupeptin，10μg/ml抑肽酶，250μM PMSF），并通过10次均质22号针头。通过以下方法获得核后上清液9600×离心克（SS-34转子，索瓦尔仪器，德国威明顿）；然后将其铺在1.5 M蔗糖上缓冲液（含20 mM HEPES，pH 7.4和1 mM EDTA）并离心154000×克（SW-41转子，贝克曼仪器，Fullerton，CA）1 h恢复1.5 M蔗糖垫并立即固定在最终浓度为2%的多聚甲醛，储存于4°C。

将Formvar涂层的碳稳定格栅分层到10μl液滴上多聚甲醛固定细胞内膜10分钟。网格依次在0.02M甘氨酸/PBS上孵育（四次）0.1%BSA/PBS。然后用5-μl滴液培养格栅30分钟在1%BSA/PBS中稀释1:50的一级抗体初级抗体培养，网格在0.1%BSA/PBS中清洗（四次），然后用5μl的与蛋白A结合的胶体金（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州华盛顿堡）稀释为0.1%BSA/PBS在PBS中洗涤（四次），并用1%戊二醛固定5分钟。进行双重标记时，按顺序清洗格栅在20 mM甘氨酸/PBS中（四次），然后恢复到0.1%BSA/PBS步骤；然后孵育第二个一级抗体，然后通过与第二个蛋白a–金结合物孵育和戊二醛固定。然后用超纯水清洗格栅H（H）2O（七次）并用铀酰染色醋酸盐：甲基纤维素（1:9；4%乙酸铀酰于0.15 M草酸中酸性，pH 7–8，2%甲基纤维素）在冰上放置10分钟。网格为使用透射电子进行干燥和可视化显微镜。双标记中一级抗体孵育的顺序交替进行实验以确定特定抗原是否受到戊二醛处理的影响。我们没有观察到任何影响戊二醛固定在所用抗原上，因为相同的水平观察到的标记（每个结构的金粒子数）戊二醛治疗前后的所有抗体。这个省略第二项检查双重标记的特异性一级抗体和确认第二金的缺失结合。随机字段根据金颗粒和标记结构的形态。具体用于表中的分析​表1，1,我们量化了每个独特的膜结构。这也适用于结构标记为Rab7、CI-MPR、EEA1和Vamp8。计算百分比然后，我们量化了结构的百分比Syn7标记阳性，其中一个也阳性其他标记，反之亦然。

表1

免疫电子显微镜结果的定量MDCK细胞制备的亚细胞组分

比较已计算结构黄金数量颗粒/结构为Syn7标记的结构百分比被标记为指示的标记结构百分比标记为Syn7标记的指示标记
突触蛋白72377.13228
欧洲经济区12.2
突触蛋白71698.15149
VAMP 3（VAMP 3）2.3
突触蛋白72634.18784
CI-MPR公司3.9
突触蛋白72663.58482
VAMP公司83.6

晚期内体、杂种和溶酶体的免疫电子显微镜按照前面的描述执行分数(马洛克et（等）阿尔。, 1998)使用兔抗Syn7或抗Vamp 8抗体的稀释度为1:50，随后是结合到15-nm胶体金（美国大学细胞生物学系乌得勒支、乌得勒支特、荷兰）。阿西亚洛胎球蛋白（ASF）–晚期内体和杂种的亲和素含量按顺序排列如前所述，用8-nm胶体金进行免疫标记(马洛克等。, 1998). 抗Syn7标记和防迷走神经膜上每微米8个标签细胞器是用格子的交叉点进行的叠加法(格里菲斯，1993年). 晚期内体和杂种由其ASF–avidin的含量定义，以及溶酶体制剂通过其电子致密形态进行评分。

超薄冷冻切片的电子显微镜

MDCK细胞固定在0.1%磷酸盐中的8%多聚甲醛中缓冲液，pH 7.35，在25°C下放置1小时。然后用0.2清洗M磷酸盐缓冲液，从培养皿中刮取，在微型离心机10000 rpm。将细胞重悬于温明胶（10%在磷酸盐缓冲液中），并在微型离心机中以最大速度排斥。冷却后，明胶包埋细胞渗透聚乙烯吡咯烷酮-蔗糖在4°C下过夜，然后加工如前所述的冰冻切片(帕顿等。,1997). 标记超薄冰冻切片（60–80 nm），染色，并查看(JEOL公司1010，显微镜和昆士兰大学微观分析）技术(帕顿等。, 1997)使用金结合蛋白A。

晚期内切体-溶酶体融合分析

体内装载亲和素–ASF的大鼠肝脏晚期内体体内装载共轭和大鼠肝溶酶体125I标记生物素化聚合物免疫球蛋白A(125I-bpIgA）再次悬浮分别在猪脑细胞液中，如所述马洛克et（等）阿尔。(1998).将总体积为200μl的抗体添加到每个膜悬浮液的最终体积为700μl。15之后冰面上的最小值，100μl经抗体处理的内体样品和溶酶体用于标准的晚期内体-溶酶体融合在37°C下，以240μl的最终体积进行10分钟的分析(Mullock公司等。, 1998).

免疫沉淀

MDCK细胞在HES缓冲液中清洗三次，在HES中刮除含有蛋白酶抑制剂的缓冲液（5 ml）（10μg/ml leupeptin，10μg/ml抑肽酶，250μM PMSF），并通过10次均质22号针头。通过以下方法获得核后上清液以5000倍离心匀浆克持续5分钟。一个将含有2%Triton X-100的PBS体积添加到核后上清液，然后以100000×克在4°C（TLA-45转子，贝克曼仪器）下保持40分钟然后分离上清液（蛋白质浓度，100μg/ml）添加抗Syn7或抗GST抗体，并在冰上培养6 h。然后添加50微升50%的IgG Sorb浆液然后在冰上孵育45分钟。免疫沉淀是通过离心分离，并用含有0.1%Triton®声波风廓线仪X-100。

结果

Syn7与Vam3p类似，并广泛表达

在对默克/华盛顿大学进行BLAST搜索后表达序列标签数据库，几个候选哺乳动物同源物鉴定了酵母液泡合成蛋白Vam3p。一个表示描述候选cDNA的序列标签（GenBank登录号H33185号)PCR扩增并用于筛选小鼠cDNA文库我们发现了一个编码266氨基酸的克隆Syn7的人类和大鼠序列的高度一致性称为TSL-5(Bock和Scheller，1997年;魏姆斯等。,1997;Wong（王）等。，1998年b). 非哺乳动物合成蛋白，Syn7显示了Vam3p和Pep12p同源物来自拟南芥、AtVam3和AtPep12，分别(达席尔瓦-康塞卡奥等。1997;佐藤et（等）阿尔。1997;桑德福特等。1998). 总的来说，Syn7显示与哺乳动物Syn13的同源性最高（50%），Syn13是一种限制性合成蛋白主要是早期内体，表明这些亚型可能具有内吞途径中的相关功能(普雷克里斯等。,1998;麦克布莱德等。, 1999). 与此一致的是观察到拟南芥AtVam3共享65%的身份使用AtPep12p。此外，在酵母中，Pep12p和Vam3p也占据内吞系统，尽管它们确实有不同的功能角色，这些角色之一的高级表达突触蛋白可以部分替代另一种功能(达尔索等。, 1997;Gotte和Gallwitz，1997年). 因此，通过仅进行序列比较，似乎Syn7和Syn13表示一对类似的合成蛋白，它们在AtVam3和AtPep12的内吞系统拟南芥正如Vam3和Pep12p酿酒酵母.鉴于此Pep12p和Syn13已被证明在融合事件中对我们决定测试Syn7是否像Vam3p一样参与晚期内体/溶酶体系统的融合事件(贝切勒et（等）阿尔。1996;麦克布莱德等。, 1999).

作为分析的第一步，我们生产了兔子和山羊使用GST融合的亲和纯化多克隆抗体包含Syn7的整个细胞溶质尾部的蛋白质。多克隆抗Syn7抗体识别出一个单一的～38-kDa蛋白，该蛋白是在所有检查的组织中表达（图​（图1）。1). 大脑中Syn7水平最高肾。这些水平与这些组织。Syn7和Syn13之间的相似性水平提出了抗Syn7抗体可能与Syn13发生交叉反应。为了确保抗体的特异性，我们发现兔多克隆抗Syn7的预培养抗体或山羊抗Syn7抗体与GST-Syn7融合蛋白质，但不是GST–Syn13融合蛋白被废除免疫印迹反应性。在免疫定位实验（见下文）。Syn7的单克隆抗体（Syn7.1C3）在MDCK中也生成并识别出一个单一的～38-kDa蛋白细胞。通过ELISA对Syn7.1C3进行表征，发现其与GST–Syn7融合蛋白，但不与GST–Sync13融合蛋白质。

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Syn7的表达。（A） 总膜分数由大鼠大脑（B）、肝脏（L）、肾脏（K）、脾脏（S）、睾丸制成（T） 和MDCK（M）细胞。将等分样品（10μg蛋白质）置于SDS-PAGE和亲和纯化的免疫印迹兔抗Sync7多克隆抗体（兔抗Sync7#1）。总计MDCK细胞膜部分（10μg蛋白质）为亲和纯化山羊抗Syn7免疫印迹Syn7的多克隆抗体（B）或单独的兔抗体（兔反同步7#2）（C）。（D） 总膜分数（10μg蛋白质/车道）来自稳定转染HA的NRK细胞克隆（NRK-K2）对表位标记的Syn7进行免疫印迹分析单克隆抗HA抗体或兔抗Syn7#1。（E–J）兔子培育抗Syn7#1（E–G）或山羊抗Syn7抗体（H–J）不添加（E和H）、300μg/ml GST–Syn13（F和I）或300μg/ml GST–Syn7（g和J），然后标记MDCK细胞。图像是从单个焦平面采集并归一化以进行控制。（K–M）亚流利的MDCK细胞用Alexa标记Syn7488–结合二级抗体（top）与德克萨斯州特异性TfR（K）、EEA1（L）或CI-MPR（M）抗体红色结合二级抗体（底部）。Syn7标记为兔抗Syn7#1（K或L）或山羊抗Syn7抗体（M） ●●●●。通过收集4μm厚的z序列对细胞进行成像（步长，0.1μm）并在之前对序列进行计算反褶积组装表示1-μm厚的最大点投影平面。箭头指向两个标记为正的结构，和箭头指向只有一个为正的结构标记。N、 核心。棒材，E–J为15μm；K–m为5μm。

Syn7被定位于晚期内体/溶酶体结构免疫荧光

为了促进我们对Syn7的本地化研究，我们调查了高水平内源性Syn7的培养中的各种细胞类型表达式。如图所示​图1A，1A、 MDCK中发现高水平细胞。因此，我们启动了免疫荧光定位研究在MDCK细胞中同时使用兔子和山羊亲和纯化的抗Syn7多克隆抗体（图​（图1，1，E–M）。收件人为了确保免疫标记程序的特异性，我们标记了MDCK存在GST–Syn7融合蛋白或GST–Syn13融合蛋白。标签图案或当GST-Syn13融合蛋白在初级抗体孵育期间被纳入；然而，标签随着GST–Syn7融合的加入，被彻底废除蛋白质（图​（图1，1，E–J）。在一系列双重标记实验中（图​（图1，1MDCK细胞中的Syn7标记出现在细胞内核周区最突出的结构在细胞中也有发现。Syn7之间几乎没有重叠和突触合蛋白6，a反式-高尔基网络标记(博克et（等）阿尔。, 1997). Syn7的标记模式与早期内体标记EEA1，通常是浓缩的对MDCK细胞内吞体进行分选(亩等。, 1995;斯滕马克等。, 1996). 与Syn7标签有些重叠转铁蛋白受体双标记实验观察（TfR），循环内吞系统的更通用标记。然而，与TfR共定位的程度很低，因为在TfR阴性中观察到大量标记结构。相比之下，我们发现了最高水平的共定位具有CI-MPR，它集中在MDCK的晚期内体中单元格(格里菲斯等。, 1988).

由于MDCK细胞中Syn7与CI-MPR重叠，我们检查了Syn7与lgp120，a的关系晚期内体和溶酶体的成熟标记(刘易斯et（等）阿尔。, 1985). 我们可获得的lgp120抗体没有与MDCK细胞发生交叉反应，因为我们随后想使用大鼠肝脏无细胞晚期内体-溶酶体融合系统选择检测WIF-B细胞中的Syn7。WIF-B是一种肝细胞系具有极化肝细胞的许多特征，包括顶端胆管膜的形成(伊尔克等。, 1993;柄等。, 1994). 我们还拍了进一步的步骤，以确保我们的标记程序的特异性使用抗Syn7细胞溶质结构域的单克隆抗体（语法7.1C3）。该单克隆抗体还识别MDCK中的单个38-kDa蛋白细胞膜组分，抗体的结合为与GST–Syn7融合蛋白特别竞争，但不与GST–Syn13融合蛋白。图​图22显示Syn7集中在WIF-B的核周区域细胞，远离细胞的外围，在那里早期内体通常位于。lgp120的双重标记显示高水平空泡结构中的共定域。相比之下，Syn13显示与lgp120几乎没有共定位，但与TfR有广泛重叠，与之前的分析一致，表明Syn13早期繁殖内吞体及其催化早期内吞体同型融合(普雷克里斯等。, 1998;麦克布莱德等。, 1999).

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Syn7和Syn13在WIF-B细胞中的分布共焦显微镜。极化WIF-B细胞被固定并渗透然后用Syn7和lgp120（A）、Syn13的抗体进行双重标记和lgp120（B），或Syn13和TfR（C）。小鼠单克隆抗体用于标记Syn7（A）、lgp120（B）和TfR（C）与兔多克隆抗体标记lgp120（A）和Syn13（B和C）。FITC-结合抗体小鼠IgG（A，Syn7；B，lgp120；C，TfR）和Cy3-结合抗体将兔IgG（A，lgp120；B和C，Syn13）作为次要抗体抗体。A和B中的光学部分穿过细胞，而C中的部分稍微靠近基底显示更多的外周内体。箭头指向以下结构两个标记为正值，箭头指向以下结构只有一个标记为阳性。注意Syn7与lgp120阳性结构，即溶酶体（A）和具有TfR的Syn13，即早期内体（C），而Syn13之间几乎没有重叠和lgp120（B）。BC，胆管样间隙；N、 核心。酒吧，10微米。

尽管在上述MDCK和WIF-B细胞的研究中，我们使用了与Syn13无交叉反应的多克隆和单克隆抗体或其他分子量不同于Syn7的突触蛋白（图​（图1），1)，我们无法完全消除抗体在我们的免疫荧光中与另一种蛋白质发生交叉反应研究。因此，我们选择将表位标记版本的在Syn7中，我们将两个HA表位插入起始密码子。用于插入标记的站点已与在这些情况下，并没有导致syntaxin的错位(班菲尔德等。, 1994;阿德瓦尼等。, 1998;卡尔等。, 1999). 要分析表位标记的Syn7的分布，我们在内吞系统的各个隔间可以是在形态学上是有区别的，其中定位和溶酶体的生物发生已被广泛描述(明亮等。, 1997). 稳定的克隆NRK细胞系（NRK-K2）为用编码HA标记的质粒（pRCP316）转染后分离Syn7和随后的G418-耐药细胞筛选。蛋白质印迹对NRK-K2细胞全细胞提取物的分析表明HA-tagged Syn7被表达为一个单一物种分子量～3 kDa大于内源性Syn7（图​（图1D）。1D） ●●●●。用抗Syn7抗体免疫印迹相同提取物表明表位标记的Syn7的水平远远低于内源性Syn7（图​（图1D）。1D） ●●●●。如图所示​图3，三，HA-Syn7大量分布细胞核周围的细胞内结构与lgp120重叠。相反，很少观察到重叠HA-Syn7和TfR之间（发现于一个大管子内网络）。此外，HA-Syn7的标记与EEA1和Syn13，两者都存在于点状结构中遍及细胞质。表位标记Syn7的观察与lgp120共定位与内源性MDCK和WIF-B细胞中的Syn7。

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表位标记的Syn7在NRK细胞中的定位共焦显微镜。稳定转染NRK细胞表达HA表位标记的Syn7（NRK-K2细胞）被标记为HA，使用单克隆抗HA抗体（A、C和D，左侧）或兔抗HA多克隆抗体（B，左）与兔多克隆抗体结合Syn13（A，中间）抗体、TfR（B，中间）小鼠单克隆抗体、兔lgp120（C，中间）多克隆抗体或兔多克隆抗体EEA1抗体（D，中间）。E显示带有anti-lgp120的标签兔多克隆抗体（左）与抗EEA1单克隆抗体（中）。通过共聚焦从0.5μm焦平面采集图像显微镜检查。注意，Syn7分布的变化导致选择不同的焦平面来显示表位标记的Syn7与每个标记蛋白相关。绿色/红色合并图片显示在右侧。棒材，10μm。

Syn7通过免疫电子定位于晚期内切体和溶酶体显微镜

免疫荧光法研究Syn7与lgp120的共定位WIF-B和NRK细胞表明Syn7的显著比例为定位于晚期内体和溶酶体。然而Syn7的较低级别通过免疫荧光与含TfR的区室一致（图​（图1K）1K） 在MDCK细胞中，一些Syn7也可能占据早期的内体隔室。为了进一步描述Syn7在MDCK细胞中的细胞内定位，我们检测了超薄冰冻切片和免疫金电子显微镜分离膜。在细胞的核周区域观察到Syn7的特异性标记与多泡内体相关的细胞（图​（图4A）。4A） ●●●●。此外，标签通常观察到与这些多泡内体。然而，尽管只使用了温和的固定剂多聚甲醛，冷冻切片上的标签总是低。事实证明，这对于说服双重标记是有问题的实验，所以我们采用了以前用于分析的程序GLUT-4–含有小泡(马丁等。, 1996). A类从MDCK细胞制备核后上清液，固定于多聚甲醛，吸附在Formvar涂层格栅上，并用对Syn7、CI-MPR、Rab7和Vamp 3（cellubrevin）的抗体。特定在大的、电子致密的多泡上观察到Syn7的标记结构（图​（图4，4，B–D）类似于这些结构在冰冻切片上标记。大部分结构Syn7标记阳性也显示晚期内体标记标记CI-MPR(格里菲斯等。, 1988). 相比之下，只有对Syn7阳性的结构的小部分显示EEA1标签（表​（表1），1)，大多数EEA1标签是仅限于小型透光电子结构，证实了Syn7和EEA1的大部分占据不同的隔间。

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免疫金电镜定位MDCK细胞中的Syn7。（A） 超薄冰冻切片标记有随后，针对Syn7（抗Syn7#1）的特异性亲和纯化抗体通过15-nm蛋白质A–金。观察到特定标签（箭头）多泡相关细胞的核周区内体（e）。（B–D）细胞内MDCK膜用多聚甲醛并吸附到Formvar涂层格栅上。膜是然后依次对Syn7（15-nm蛋白质A–金；S7）进行双重标记和CI-MPR（20-nm蛋白质A–金；MPR）（B）；Syn7（20-nm蛋白质A——黄金；S7）和Rab7（10-nm蛋白质A–金；R7）（C）；或Syn7（10-nm蛋白A–金；S7）和EEA1（15-nm蛋白质A–金）（D）。酒吧，300纳米

我们还检测了Syn7在晚期内体和从大鼠肝脏分离的溶酶体（图​（图5，5，A和C）不仅要确认我们在lgp120阳性结构中观察到Syn7的定位肝细胞WIF-B细胞系，也因为我们使用了无细胞利用膜进行晚期内体-溶酶体融合反应来源于肝细胞（见下文）。此外，我们检查了Syn7在体外形成的杂交细胞器中的分布晚期内体-溶酶体融合试验（图​（图5B）。5B） ●●●●。基于我们之前的在全肝内吞ASF–亲和素的脉冲期研究中，我们从注射了ASF–杀戮前6分钟抗生物素，因为该程序会导致ASF–亲和素在多泡晚期内体中的富集(马洛克等。, 1994,1998). ASF-抗生物素在这些细胞中的定量结构显示有33个金颗粒/μm2与0.5金相比颗粒/μm2其他组织成分颗粒，从而定义了晚期内体结构。溶酶体和晚期通过以下方法在富集组分中鉴定了内体-溶酶体杂种它们的特征形态。如图所示​图5，5，晚期内体，杂种和溶酶体对Syn7显示出显著的标记溶酶体上的最高标记（图​（图5D）。5D） ●●●●。这些数据加在一起表明Syn7在晚期内体和溶酶体中富集。然而，这些数据并不排除低水平Syn7分布于早期内吞室。因此，我们开始旨在证实Syn7拟议作用的功能研究将融合事件介导至晚期内体。

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Syn7和Vamp 8的免疫金电子显微镜与大鼠肝脏晚期内体、溶酶体和杂种相关细胞器。Syn7（A–C）标记的免疫电子显微镜兔子抗Syn7#1的使用（15纳米金；大箭头），Vamp 8（E–G）标记（15-nm金；大箭头）和内化ASF-亲和素（A、B、E和G）（8纳米金；小箭头）与大鼠相关肝脏晚期内体（A和E）、杂交细胞器（B和F）和溶酶体组分（C和G）。晚期内体和杂交细胞器通过ASF-亲和素的含量鉴定。溶酶体通过其电子密度形态进行鉴定。条形，200 nm。（D和H）定量Syn7标记水平（D）和Vamp 8标记水平（H）在晚期内体的外周膜上（le；30μ，晚期内体-溶酶体融合后分离的混合细胞器无细胞融合系统（h；65μm评分），分离溶酶体在以下条件下与细胞质和ATP孵育后无细胞融合系统（ly；1000μm评分）。误差条表示细胞器数量的SEM评分。

Syn7抗体抑制晚期内切体与溶酶体

考虑到Syn7的分布，我们试图确定Syn7发挥了t-SNARE的作用，可以协调特定融合晚期内体和溶酶体之间的事件。以前的研究有建立了一个重建最后一个步骤的体外系统在溶酶体生物发生中，即晚期内体与溶酶体。此分析测量不同含有ASF–抗生物素或125I-bpIgA通过免疫沉淀亲和素和量化界限水平125I-bpIgA。标记的晚期内体是从允许摄取的大鼠肝脏中获得的ASF–亲和素6分钟，而标记溶酶体是通过允许吸收125I-bpIgA 30分钟融合已经证明这两个车厢之间需要ATP和细胞溶质，依赖于NSF和Rab蛋白(马洛克et（等）阿尔。, 1994,1998).

晚期内体和溶酶体组分均标记有抗Syn7抗体（图​（图5，5，A–C），因此均接受治疗融合反应前用抗Syn7抗体。我们发现4°C下对晚期内体和溶酶体进行15分钟的预培养亲和纯化的抗Syn7抗体显著抑制含量反应开始后这些隔间之间的混合合并组分并在37°C下培养。使用来自两种分离的兔抗Syn7的亲和纯化抗体抗血清（1号和2号），抑制作用是剂量依赖性的，并且对抗Syn7抗体（图​（图6A）。6A） ●●●●。CI-MPR细胞溶质尾的抗体同样没有作用浓度。在最初的实验中，我们使用了抗Syn7从我们免疫的第一只兔子（抗Syn7#1）中纯化。在使用最高浓度（80μg/ml）时，我们观察到45%的抑制作用融合。然而，增加抗体浓度希望实现完全抑制在技术上是困难的。因此，我们在其他动物身上检测抗体。其中一种抗体是山羊抗Syn7，导致一致性和特异性但其比抑制活性低于亲和纯化兔抗Syn7#1。另一种兔抗Syn7（反Syn7#2）被证明大约高出四倍特定抑制活性水平，仅在20μg/ml，在40μg/ml及以上完全抑制亲和纯化多克隆抗体制剂对免疫印迹法检测Syn7。也不是抗突触蛋白6抗体或以相同方式纯化的抗GST抗体或与GST–Syn7预孵育的抗Syn7抗体融合蛋白影响含量测定（图​（图6B）。6B） ●●●●。斯特里克阻挠与抗Syn7的抑制无关抗体，因为单价Fab片段由抑制性兔多克隆抗体（抗Syn7#2）也抑制在45μg/ml的浓度下，融合率>70%（图​（图6B）。6B） ●●●●。

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Syn7抗体特异性抑制晚期内体-溶酶体体外融合。（A） 滴定实验分析大鼠肝脏晚期内体和溶酶体的含量混合。影响Syn7#1亲和纯化兔抗体（闭合方块）和Syn7#2（闭合圈）和兔抗CI-MPR（开圆）是在治疗两种药物后测量的分别具有指定抗体浓度的组分在冰上放置15分钟，并在无细胞晚期内体-溶酶体融合试验。标准熔合（100%）定义为预孵育后获得的融合量仅缓冲液，即不添加抗体。数据包括以平均值±SEM表示六个独立样本的重复样本抗CI MPR的实验，抗Syn7#1的五个单独实验在20μg/ml时，对40μg/ml的抗Syn7#1进行四次单独实验，20μg/ml的抗Syn7#2的三个单独实验和两个80μg/ml的抗Syn7#1的单独实验。所有其他数据呈现的是重复样本的方法。（B） 几个数的总和用指示抗体干扰融合分析的实验在晚期内体和溶酶体之间。融合前，两者都较晚仅用缓冲液（对照）或40μg/ml的以下抗体：抗CI-MPR，亲和纯化CI-MPR细胞溶质尾部抗体；抗Syn7#1，血清中Syn7细胞溶质结构域的亲和纯化抗体#1; absbd anti-Syn7#1，之前与anti-Syn 7#1预孵育被GST–Syn7吸收（相当于40时分析中的抗Syn7#1μg/ml）；抗Syn7#2，细胞溶质亲和纯化抗体来自血清#2的Syn7结构域；亲和纯化的抗突触蛋白6抗突触蛋白6胞浆结构域抗体；和反GST，GST亲和纯化抗体（40μg/ml）。反同步7（Fab），Fab以45μg/ml的速度使用从抗Syn7#2抗体制备的片段。提供的数据是重复样品的平均值或±SEM的平均值三个或更多单独实验的案例。

Syn7与内吞性v-（R）-SNARE Vamp 8的复合物

因为它是一个syntaxin（Q-SNARE），我们可以预测Syn7将与v-SNARE蛋白的一个子集（R-SNARE）特异性复合以介导与晚期内体和溶酶体的融合事件。因此，在为了确定Syn7的潜在v-SNARE合作伙伴，我们曾经再次利用了酵母合成蛋白Vam3p与假定的哺乳动物对应物，Syn7。威克纳和同事(尼科尔斯等。, 1997;非德语et（等）铝., 1998,1999)确定了Vam3p和v-SNARE Nyv1p在晚期内吞系统融合事件中的作用酵母，即液泡的同型融合。此外这些蛋白质的比例存在于一个复合物中，如下所示共免疫沉淀实验。因此，我们搜索了数据库对于与酵母表现出最高鉴定水平的v-SNARENyv1p。虽然在已知的哺乳动物v-SNARE，最近的亲属是Vamp 8局限于内吞室(阿德瓦尼等。, 1998;Wong（王）等。，1998年b). 因此，我们确定Vamp 8通过共免疫沉淀实验与Syn7相关。图​图7A7A显示了细胞溶质产生的亲和纯化抗Vamp 8抗体Vamp 8的域。如前所述，Vamp 8迁移为～17-kDa蛋白质，在内胚体隔室中富集(Wong（王）等。，1998年a). Syn7从Triton®声波风廓线仪免疫沉淀X-100–从MDCK细胞制备的可溶性部分，然后Vamp 8和Vamp 3的免疫印迹（cellubrevin）（图​（图7B）。7B） ●●●●。用山羊抗Syn7或兔抗Syn7#1抗体可定量恢复免疫沉淀中的Syn7。候选人Vamps的吸液试验表明10–20%的Vamp 8与Syn7相关，而没有发现可检测的Vamp3与免疫沉淀有关合成7。

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免疫荧光定位和Vamp 8与Syn7联合免疫沉淀。（A） 鞋面特异性8用MDCK的全细胞提取物证明抗体细胞SDS-PAGE和免疫印迹亲和纯化的兔抗Vamp8抗体。（B） 海卫一X-100–可溶部分由核后上清液制备从MDCK细胞中提取并与亲和纯化的兔抗Syn7抗体或兔抗GST抗体（左面板）或亲和纯化的山羊抗Syn7抗体和匹配的山羊抗GST抗体（右侧面板）。固定的金黄色葡萄球菌细胞然后添加，并清洗免疫沉淀物非还原性SDS-PAGE，并对Syn7、Vamp 8进行免疫印迹，和Vamp 3。五分之一的相应上清液来自免疫沉淀也被免疫印迹。对于兔抗Syn7#1抗体免疫沉淀山羊抗Syn7抗体用于免疫印迹分析。对于山羊抗Syn7抗体免疫沉淀兔抗Syn7#1抗体用于免疫印迹分析。SDS-PAGE在非还原条件下进行。（C） MDCK细胞标记有山羊抗Syn7（左）和兔抗Vamp 8（右）与FITC-结合的驴抗山羊和德克萨斯州红色结合驴抗兔二级抗体。匹配显示了反褶积4μm厚z系列的1μm厚平面（D） ●●●●。极化WIF-B细胞固定并渗透，双标记兔抗Vamp 8（左）和鼠抗lgp120（右），以及通过共焦显微镜成像。主要抗体之后是Cy3-和FITC-结合二级抗体。在C和D中，箭头指向两个标记均为正的结构，箭头表示仅包含一个标记的结构。BC中，胆管样间隙；N、 核心。棒材，10μm。

与我们在Vamp 8和Syn7，我们还观察到Vamp8和Syn7在MDCK细胞中的免疫荧光定位（图​（图7C）。7C） ●●●●。免疫电子证实了这种共定位MDCK膜的显微镜标记（表​（表1）。1). 尽管如此共定位，还有其他Vamp 8阳性结构与Syn7阳性的不同。一种可能性是Vamp 8仅限于早期内胚体隔室，且重叠Syn7和Vamp 8之间反映了早期Syn7的低水平内胚体隔室。确定是否有任何Vamp 8占用较晚内体或溶酶体，我们也通过双标记定位Vamp 8WIF-B细胞的免疫荧光（图​（图7D）7D） 通过免疫电子大鼠晚期内体和溶酶体分离组分的显微观察肝脏（图​（图5，5，E–G）。这些实验表明Vamp 8定位到lgp120阳性结构。有趣的是免疫电镜下，Vamp 8在晚期内体中富集，但溶酶体中的情况要少得多（图​（图5H）。5H） ●●●●。因此，尽管Vamp 8和Syn7局限于晚期内体/溶酶体室每个蛋白质在整个内吞过程中的分布是不同的系统。

讨论

我们努力描述Syn7的功能是出于希望找到酵母Vam3p的功能同源物在溶酶体生物发生的晚期发挥作用。我们提供两个支持Syn7在溶酶体生物发生中的作用的主要发现。首先，Syn7定位于晚期内体和溶酶体。第二，Syn7是晚期内体与溶酶体体外融合所必需的。

我们在这里确定的老鼠序列与人类的序列分别为93%和94%和大鼠Syn7。在动物界之外，哺乳动物Syn7与工厂Vam3p的一致性最高（～30%）同系物AtVam3p，与提议的酵母对应物类似局限于液泡(佐藤等。, 1997). 此外，Syn7在所有检查的组织中表达，与我们的作用一致假设它在内胚体系统中实现。通过免疫荧光显微镜、免疫电子显微镜和亚细胞分离分析发现，Syn7的显著水平出现在晚期内胚体和溶酶体，EEA1阳性腔室中更少。

作为Syn7的潜在合作伙伴v-SNARE，我们发现Vamp 8部分与Syn7共定位，Vamp 8的很大一部分是与洗涤剂可溶性免疫沉淀物中的Syn7相关由MDCK细胞制备的组分。Syn7和Vamp 8是否代表需要根据以下因素来解释活体内运行的SNARE对最近在体外进行的实验表明，v-（R）-SNARE可以以如下方式与许多不同的t-（Q）-SNARE形成复合物掩盖了他们可能催化的贩运活动的特殊性活体(杨等。, 1999). 与体外实验相比研究表明，我们在Vamp 8复合物中发现了大量的Syn7通过细胞提取物的免疫沉淀，表明这种复合物存在于体内。在带有v-SNARE的复合体中未观察到Syn7Vamp 3（cellubrevin），在MDCK细胞中显示较少的共定位使用Syn7而不是Vamp 8（表​（表1）1)以及之前已本地化的到内体(麦克马洪等。, 1993;奇尔科特et（等）阿尔。, 1995;达罗等。, 1996). 因此我们观察到的Syn7/Vamp 8复合物降低了Syn7和Vamp 8的关联是偶然的，因为它们通过同一个隔间运输，因为某些Vamp 3根据共沉淀程度预测，我们观察。由于Vamp 8和Syn7的特殊关联我们通过免疫荧光和免疫电镜研究，我们认为Vamp 8可能位于与Syn7进行功能交互的v-SNARE合作伙伴中的至少一个体内试验。这并不妨碍Vamp 8或Syn7与其他SNARE影响内吞过程中的各种融合事件系统。需要进一步实验来确定哪种运输方式步进这个假定的SNARE对控制，因为到目前为止我们已经失败了显示晚期内体和溶酶体之间融合的抑制单个抗Vamp 8兔的无细胞检测我们制备的抗血清。

考虑到Syn7的定位以及抗Syn7作用抗体和Fab片段与晚期内体融合体外溶酶体，我们认为Syn7参与融合事件在晚期内吞途径中。这与功能相反与Syn7和也局限于内吞途径。然而，Syn13是集中在早期内体中，与rab5和EEA1一起参与早期内体的融合(普雷克里斯等。, 1998;麦克布莱德等。, 1999). 到目前为止，Syn7还没有角色在早期内体融合中发现(麦克布莱德等。, 1999). 因此，Syn7和Syn13与它们假定的对应物Vam3p和Pep12p一样，是可能具有不同的、不重叠的功能。使用体外融合反应，测量内吞体和从大鼠肝脏分离的溶酶体(Mullock公司等。, 1994,1998)，我们能够证实Syn7可能具有在体内与溶酶体至少一次融合事件中的功能作用。从最近一段时间以来，还没有发现运输囊泡的携带者哺乳动物或酵母细胞中溶酶体的内体。在相反，已经表明这种转运反应是以大的多泡内涵体与预先存在的溶酶体(福特等。, 1996;梅尔曼，1996年;Storrie和Desjardins，1996年;马洛克等。1998). 在体外，这种融合反应导致产生形态独特的晚期内体-溶酶体杂交在体内观察(福特等。, 1996;明亮et（等）阿尔。, 1997;马洛克等。, 1998). 以前的研究有表明该融合反应依赖于NSF和α、γSNAP并且对外源性Rab GDI敏感，这是Rab GTPases的要求(马洛克等。, 1998). 这些这些发现与SNARE蛋白在这一过程中的参与是一致的融合反应，因为这一队列蛋白质共同作用促进融合(廉等。, 1994;索加德等。, 1994;Luapshin和Waters，1997年). 同步7似乎是融合步骤中的SNARE蛋白之一，因为针对Syn7细胞溶质尾部的抗体抑制了含量以剂量依赖的方式混合。内容的完全抑制使用抗Syn7#2观察到的混合与总量一致在无细胞试验中观察到的酵母液泡融合的抑制作用抗Vam3p的存在(尼科尔斯等。, 1997)

Wong及其同事（1998年b）报告Syn7已本地化到早期基于与TfR部分共定位的内体。尽管我们在MDCK细胞的TfR-阳性结构中发现低水平的Syn7，大多数我们观察到的标记与晚期标记一致内涵体和/或溶酶体。在Wong及其同事的研究中TfR在抗体内化后被标记为TfR的腔域，如果过多，也可能进入晚期内体和溶酶体，可能会模糊Syn7的检测在早期隔间。最近的研究普雷克里斯等。(1999)冷冻切片的免疫金标记表明Syn7仅限于早期萌芽的氯氰菊酯包被囊泡内体，其定位模式远比与TfR的重叠Wong（王）等。（1998年b）虽然在这些免疫电子中观察到标记显微镜研究是离散和具体的，可能性仍然存在只检测到细胞内Syn7分子的一个子集采用固定和标记方法。在我们的实验中，我们通过各种技术看到了Syn7更广泛的分布。在我们的免疫电子显微镜实验过程中，然而，我们产生了兔子抗体、山羊抗体和小鼠抗体用于冰冻切片免疫金标记的Syn7单克隆抗体。尽管我们观察到与晚期内体相关的特异性标记结构，我们无法提高免疫金的整体水平切片标记，表明许多Syn7表位尽管我们尝试了许多不同的方法抗体制剂。此外，当我们标记溶酶体部分时我们发现从大鼠肝脏中分离出来的标记效率增加当我们之前在胞质溶胶和ATP中孵育该部分时固定和冷冻切片。因此，高度受限的本地化在Prekeris和其他人的研究中发现Syn7的部分原因可能是选择性检测可能存在于特异性蛋白质复合物(普雷克里斯等。, 1999). 我们的结论Syn7分布于整个内吞途径并且集中在晚期内体和溶酶体中是基于多种免疫荧光和免疫电镜定位在MDCK细胞中进行的研究，NRK细胞表达表位标记的Syn7和肝细胞（例如大鼠肝脏和WIF-B细胞）其中Syn7主要与晚期内体标记共定位和溶酶体。通过电子显微镜，在多囊泡上发现Syn7也标记有CI-MPR和Rab7抗体的内体（图​（图4）4)或含有内化亲和素结合ASF的药物（图​（图5）。5).重要的是，我们还发现Syn7在限制从大鼠肝脏分离的溶酶体膜（图​（图5）5)甚至更高也从大鼠体内分离出的晚期内体的水平肝脏。与我们的本地化结果一致的是中村等。(2000)，他还发现Syn7本地化为与LAMP1（大鼠lgp120的小鼠同源物）。此外，这些作者提供了Syn7在晚期内吞途径中功能作用的证据通过检测Syn7细胞溶质结构域过度表达的影响诱发显性负效应。这导致了早期内吞物质向晚期内吞物质的转移内体。必须仔细解释这些结果，因为显性负性Syn7通过滴定Syn7-结合蛋白发挥作用这可能在其他地方发挥作用。此外，Syn7的可溶性片段可以是能够与不合适的SNARE合作伙伴杂乱无章地结合。我们的结果体外支持Syn7在晚期内体-溶酶体中的作用融合，准确地确定Syn7体内功能。在这方面，旨在分配Syn7的确切功能让人想起对Rab7的作用。使用过度活跃Rab7和生化体外融合实验表明Rab7及其酵母同源物Ypt7p在融合中的直接作用动物细胞和酵母细胞中的溶酶体和液泡(哈斯等。, 1995;布奇等。, 2000). 然而，转染细胞中显性阴性Rab7的分析支持结论Rab7/Ypt7p参与早期到晚期内体运输(按下等。, 1998). 这些结果可能意味着Rab7，或者在我们的例子中是Syn7，在后期工作于多个步骤内吞途径或可能意味着正常溶酶体的中断融合事件导致内吞早期的间接效应通路。至少，我们认为我们的结果证实了Syn7在晚期内体-溶酶体融合过程中的作用。

鉴于Syn7存在于晚期内体和溶酶体中问题是，Syn7是否作为t-SNARE在溶酶体膜或在晚期内体上。也许是最好的模型Syn7的功能以酵母Vam3p为例，如图所示调节酵母液泡的同型融合(尼科尔斯et（等）阿尔。, 1997). 这种融合反应依赖于NSF，Ypt7p（aRab7同源）、Vam3p和Nyv1p（v-SNARE）。最好的模式是Vam3p和v-SNARE Nyv1p不仅存在，而且具有功能活跃于两个融合伙伴(尼科尔斯等。, 1997;非德国人等。, 1998). 因此，Syn7可能在两种情况下都是有效的晚期内体和溶酶体，并催化来自多个细胞的融合事件汇聚于晚期内体/溶酶体的不同途径隔间。这与Vam3p，不仅催化内体与液泡的融合而且自噬囊泡与液泡融合并输送来自AP-3转运途径的转运中间产物源自高尔基人(Cowles公司等。, 1997;达尔索等。, 1997;派珀等。, 1997).

致谢

作者感谢朱迪·特勒姆在克隆Syn7 cDNA方面所做的努力；爱荷华大学中央显微镜实验室的工作人员，尼克·韦德和卡拉·布朗为获得单克隆抗体和syntaxin7多克隆抗体；Sally Gray负责技术援助；和Linda Pelleymounter执行免疫荧光研究。这项工作得到了美国心脏组织的资助美国国家卫生与医学研究协会（9730275N）委员会、医学研究委员会、SmithKline Beecham和澳大利亚研究委员会。这项工作也得到了人类的支持J.P.L.、D.E.J.和R.C.P.的前沿科学项目拨款分子和细胞生物学中心是一个特殊的研究中心澳大利亚研究委员会。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会