血管系统的发育对于胚胎达到一定大小后的生长至关重要，以使血液流向快速发育的胚胎组织。在胚胎发生中，血管系统由两个不同的过程构成(1–三). 第一个是血管生成，它由血管母细胞形成一个初级毛细血管网络，而血管母细胞是中胚层的假定前体。成熟的血管结构是由第二个过程形成的，称为血管生成，这是内皮细胞从现有的毛细血管网络重塑为成熟的血管。内皮细胞和血细胞规格之间有密切关系(4–8). 卵黄囊血岛的卵黄囊造血开始于胚胎第（E）7.5天左右，位于中心的细胞产生血细胞，位于外围的细胞变平并形成血管内皮细胞。另一方面，在小鼠胚胎发生期E10.5左右的主动脉-中肾区域启动最终造血(9,10). 此外，在最终造血过程中，血细胞被认为来源于人类大动脉的内皮细胞，如背主动脉、脐动脉和卵黄动脉(11).
参与这些过程的转录因子在控制内皮细胞和造血细胞命运方面都很重要。很少有转录因子与血管生成或血管生成有关。Lmo2因其在造血中的作用而成为这种作用的候选者。低分子氧化合物通过与T细胞癌基因的同源性首次发现LMO1型(12)在某些T细胞白血病中，它也被染色体易位激活(12,13). 通常，Lmo2是原始和最终造血途径中的一种必需蛋白(14,15)似乎通过其LIM域锌指状结构介导多聚蛋白复合物(16,17). Lmo2蛋白与其他蛋白相互作用的能力导致鉴定出红细胞中的多聚蛋白复合物，包括Tal1/Scl、E47、Ldb1和GATA-1，以及Lmo2，Lmo2特异性结合到二分DNA序列(18). 鉴于Lmo2在造血中的各种作用，有人提出Lmo2作为桥接分子，促进形成不同的多聚体复合物，在造血阶段调节不同基因的转录(15,19,20).
为了评估Lmo2在血管发育的转录调控和随后的血细胞规格中的可能功能，已在用二氧化二铝-无胚胎干细胞。我们已经介绍了lacZ公司基因进入二氧化二铝同源重组ES细胞基因。胚胎干细胞来源的细胞在注射到胚泡后的命运通过从Lmo2型发起人。杂合性和纯合性缺失的比较二氧化二铝ES细胞命运，我们观察到Lmo2在小鼠胚胎发生期间在内皮细胞中表达，并且在没有Lmo2的情况下血管生成正常进行。然而二氧化二铝基因在构建成熟血管网络（血管生成）中起着关键作用，因为这一过程在嵌合体中没有发生，嵌合体中的二氧化二铝-空ES单元格。
材料和方法
同源重组。
建造Lmo2–lacZ目标向量如图所示。线性化靶向载体DNA（25μg）用于电穿孔转染CCB ES细胞。抗性克隆的选择是通过细胞在含有400μg/ml G418（GIBCO）或300μg/ml潮霉素B（Calbiochem）的培养基中生长来完成的。通过顺序杂交ES细胞DNA[通过标准过滤杂交（参考。21)如所述（参考。22)]靶区两侧的侧翼探头（参考。14; 参见图。图例），并通过使用内部探针确认靶片段的单一插入。
Lmo2–lacZ同源重组敲除融合基因。本研究中使用了两种构建物来创建Lmo2靶向ES细胞。用pKO5-lacZ-neo转染CCB ES细胞(A类)筛选杂交检测靶向事件。最初分析了几个目标克隆，并根据其在小鼠胚泡注射后产生持续高水平嵌合体的能力选择了一个克隆（命名为KZ26）。KZ26克隆+/-用于第二次转染pKO5hygro（tk），研究了三个克隆（克隆1、16和64），其中Lmo2的第二个等位基因被靶向产生KZ26−/-(二氧化二铝−/−）ES细胞。(A类)建造Lmo2–lacZ通过克隆4.5kb钝端基因实现融合基因打靶载体Sfi公司I片段Sfi公司I-lacZ-MC1neopA公司(38)变成了一个直截了当的人巴姆基因靶向载体pKO5（tk）的HI位点(14). 在得到的克隆中，KO5-lacZ-neo是二氧化二铝（外显子2）与lacZ公司通过一个12-bp的连接序列。描述了pKO5-lacZ-neo图上所示的潮霉素靶向载体pKO5hygro（tk）和用于评估基因靶向性的探针(14). 将pKO5-lacZ-neo瞄准二氧化二铝产生6-kb囊探针A的I片段（与9-kb种系带相比）和9.5-kb巴姆探针B的HI带（与12kb的种系带相比）。探针C是一个新探针，用于验证目标载体的单个插入。将pKO5hygro（tk）靶向二氧化二铝产生10.8-kb囊I带探头A和13.8-kb巴姆带探头B.S的HI波段，囊我；B、，巴姆你好。(B类)用探针A（3′侧）、探针B（5′侧）和探针C（内部）的Southern过滤器杂交检测ES克隆DNA中的同源重组。显示了具有代表性的+/+（野生型）和+/-（新靶向）克隆的杂交。Wt，野生型杂交带。(C)识别三个独立的双靶点二氧化二铝通过与探针A的过滤杂交获得−/−克隆（克隆1、16和64）。使用探针B和内部潮霉素探针（数据未显示）验证这些第二个靶向等位基因的完整性。
嵌合小鼠的生产和种系传递。
将ES细胞显微注射到C57/BL6囊胚中，并转移到CBA/C57/BL 6受体。对于胚胎研究，注射日期指定为E2.5。目标等位基因的种系传递通过Southern过滤器与尾部DNA杂交证实。纯合子的胚胎致死表型二氧化二铝通过杂合+/-携带者小鼠的杂交和检测产生的胚胎，确认KZ26种系传递等位基因为零−/−胚胎。该程序表明，KZ26Lmo2–lacZnull突变的行为与前面描述的相同Lmo2型突变(14).
整体安装5-溴-4-氯-3-吲哚β-d日-半乳糖苷（X-Gal）染色。
每个阶段的胚胎都从子宫中切除，所有的母体蜕膜组织都被切除。对整个胚胎进行β-半乳糖苷酶活性的X-Gal染色（由Lmo2–lacZ基因表达）。23和24在组织学研究中，胚胎在X-Gal染色后固定在10%（vol/vol）缓冲福尔马林中，并嵌入石蜡中。切片安装在载玻片上，并用曙红进行复染。
结果
的结构lmo2–lacZ通过同源重组在ES细胞中的融合基因。
图。A类显示了的结构Lmo2–lacZ融合基因lacZ公司并入的第2外显子二氧化二铝。使用选择了ES克隆lacZ公司基因敲除二氧化二铝等位基因（图。A类，KZ26+/−ES细胞），该克隆被Lmo2-hygromycin载体再次感染，以产生具有第二靶向性的ES细胞二氧化二铝等位基因（KZ26−/−；研究了三个独立克隆：克隆1、16和64）。β-半乳糖苷酶的表达受二氧化二铝这些ES细胞或其衍生物中的基因体内将ES细胞注射到囊胚中并产生胚胎后。此外二氧化二铝+/使用−ES细胞（KZ26）获得目标等位基因的生殖系传递，以给予KZ26杂合小鼠。
Lmo2在内皮中表达。
我们使用β-半乳糖苷酶来跟踪二氧化二铝-在发育中的胚胎中表达ES细胞。最初，我们使用KZ26杂合小鼠研究E8.5到E14.5的β-半乳糖苷酶表达模式。在这些胚胎阶段，我们发现X-Gal染色主要在全身血管系统的内皮细胞中。E11.5中，在肢芽的顶端外胚层嵴下方也发现了X-Gal染色，这是一种称为进展区的间充质组织。该组织是无血管区和新生血管萌芽区。其他部位是尾芽和海马。图。 A类和B类图E10.5和E12.5二氧化二铝+/−胚胎。在组织切片中可以看到肢芽中β-半乳糖苷酶的表达（图。D类). 组织切片显示血管内皮的X-Gal染色（图。C). 这些β-半乳糖苷酶表达数据与RNA观察到的Lmo2表达模式相一致就地杂交(25–28)表明内皮细胞中β-半乳糖苷酶的表达也是Lmo2型胚胎发生中的启动子活性。
β-半乳糖苷酶染色法二氧化二铝+/−杂合胚胎。目标ES克隆KZ26（有一个空二氧化二铝等位基因）注入囊胚；获得嵌合小鼠，获得Lmo2空等位基因的种系传递。杂合KZ26小鼠与C57/BL6小鼠杂交，在E10.5和E12.5获得胚胎。这些胚胎用X-Gal染色作为β-半乳糖苷酶活性的底物。蓝色染色表示β-半乳糖苷酶区域由Lmo2–lacZ基因表达。(A类)E10.5胚胎。全身主要血管壁和毛细血管可见X-Gal染色。(B类)E12.5胚胎。除了血管系统的β-半乳糖苷酶染色外，在肢芽和尾端也发现了显著的染色。(C)E12.5胚胎的组织切片经β-半乳糖苷酶染色并用曙红复染。在曙红染色的组织背景中可以观察到血管内皮细胞。(D类)E12.5胚胎肢芽的组织切片经β-半乳糖苷酶染色并用曙红复染。肢芽顶端外胚层脊下方的区域β-半乳糖苷酶阳性。
二氧化二铝-E11后，空白ES细胞不能参与大血管内皮细胞的形成。
作为一种跟踪ES细胞命运的方法Lmo2–lacZ融合基因并研究纯合无效突变的结果，我们比较了从KZ26+/-和−/-ES细胞注射到胚泡中得到的嵌合胚胎的β-半乳糖苷酶染色模式（图。). 这项研究得出了一些结果。在E9.5，+/-和−/-嵌合体小鼠之间没有明显差异（数据未显示）。当用注射KZ26+/-或−/-的X-Gal染色相同大小的E11.5胚胎时（图。 A类和B类β-半乳糖苷酶在内皮细胞染色方面存在显著差异。KZ26+/−E11.5嵌合胚胎的染色模式与杂合胚胎非常相似（图。). 另一方面，E11.5−/−嵌合体胚胎几乎没有ES-衍生细胞对血管系统的贡献（图。B类)尽管ES细胞对肢芽和海马的贡献仍然存在。X-Gal染色观察到周围分散的内皮细胞，但没有发现二氧化二铝−/−ES细胞转化为主要血管内皮细胞。在E12.5对KZ26+/-和−/-胚胎进行的检查表明了这一观察结果的一致性。图。C显示KZ26+/-嵌合体胚胎，内皮细胞广泛染色，此外，肢体芽和海马染色。相比之下，来自克隆1的E12.5 KZ26−/−胚胎（图。D类)，克隆16（图。E类)，或克隆64（图。F类)没有内皮细胞染色，但每一个都有可比较的肢芽、尾和海马染色。E12.5内皮细胞染色的缺乏与E11.5−/−嵌合体胚胎的缺乏相似（图。B类).
KZ26+/-和KZ26−/-嵌合体胚胎的全山X-Gal染色的比较。带有一个（KZ26+/-）或两个（KZ 26−/-）的ES细胞二氧化二铝将空等位基因注入C57/BL6囊胚并转移给受体雌性。在指定的胚胎期，切除胚胎并用X-Gal对其进行全山染色，以测试由以下因素引起的β-半乳糖苷酶活性：Lmo2–lacZ基因表达。(A类)E11.5 KZ26+/-嵌合胚胎，其染色模式与杂合KZ26小鼠的染色模式相似。(B类)E11.5来源于KZ26−/−克隆1的KZ26–/−嵌合体胚胎。在这个胚胎中，海马体和肢芽中可以看到ES细胞的贡献（蓝色），很少内皮细胞被染成蓝色（即ES细胞来源的内皮细胞）。(C)E12.5 KZ26+/-嵌合胚。与E11.5 KZ26+/-胚胎一样，染色模式与杂合KZ26小鼠的染色模式非常相似。(D–F型)E12.5三个独立的−/−克隆的KZ26−/–嵌合胚胎。(D类)注射KZ26−/−克隆1获得的胚胎。(E类)克隆16的胚胎。(F类)来自克隆64的胚胎。在E11.5后的KZ26−/−嵌合胚胎中，−/−ES细胞在主要血管的内皮细胞中没有贡献，而在海马体、肢芽和尾部保持表达。血管内皮中ES的选择性缺失表明Lmo2蛋白在血管网络成熟（血管生成）中起着重要作用。
高水平的血管结构紊乱和生长迟缓二氧化二铝-Chimeras为空。
小鼠血管内皮重塑开始于E10.5左右。在这一关键阶段研究了Lmo2突变的无效效应。将KZ26−/−克隆1注射到囊胚中，在E10.5从一窝幼崽中获得胚胎，并用X-Gal进行整体染色。对七个胚胎的染色模式进行了比较（图。 B–H型)带有E10.5 KZ26+/-嵌合体（图。A类). 在−/−嵌合体中，存在显著的尺寸变化，这与ES细胞对内皮细胞的贡献程度成反比（根据X-Gal染色判断）。具有高X-Gal染色的小鼠（即二氧化二铝−/−ES-derived cells（ES-derivered cells）比同一窝中贡献低的细胞小（图。). 正常大小二氧化二铝−/−胚胎基本上没有内皮细胞染色，尽管它们保留了肢芽和尾部染色。在那些X-Gal高染色的小白鼠中，没有组织良好的血管系统（图。 J和K（K）)这表明，当−/−ES细胞嵌合率较高时，由于缺乏Lmo2，内皮重塑失败；因此，这些胚胎注定会死亡（见下表). 如果胚胎中嵌合体相对较低，它们就会存活下来，可能是因为囊胚衍生的细胞可以在重塑过程中取代ES-衍生的细胞。
E10.5中血管系统的生长迟缓和紊乱二氧化二铝−/−嵌合体胚胎。通过注射KZ26+/−ES细胞生成嵌合胚胎(A类)或KZ26−/−ES细胞（克隆1）(B–J类)在E10.5时获得胚胎。胚胎接受全山X-Gal染色。图中显示的胚胎B–J类都是小伙伴。大小和X-Gal染色的差异表明ES细胞贡献的大小和水平之间存在反向关系，因为较高嵌合体（即β-半乳糖苷酶染色水平较高的嵌合体）生长迟缓。(A类)E10.5 KZ26+/−嵌合胚胎。这张照片是一个有代表性的胚胎，同窝的配偶之间没有明显的尺寸差异。(B–J类)KZ26−/−嵌合体胚胎的一系列全山X-Gal染色。发件人A类到H（H），放大率相同。(J)胚胎的放大图（≈×1.7）如所示D类显示了高嵌合体−/−胚胎血管系统的主要紊乱。与KZ26+/-胚胎不同，未发现成熟血管(A类). 图中所示的−/−嵌合体胚胎的组织切片D类X-Gal染色，曙红复染。
表1
| 胚胎日 | 子宫囊（A） | 胚胎（B） | B类/A类, % | LacZ阳性（C） | C/B类, % | 每个克隆的胚胎数
|
|---|
| −/−克隆1 | −/−克隆16 | −/−克隆64 |
|---|
| KZ26（+/-）嵌合体小鼠 |
| 公式9.5 | 30 | 30 | 100 | 15 | 50 |
| E10.5级 | 18 | 18 | 100 | 13 | 72 |
| 图11.5 | 15 | 15 | 100 | 11 | 73 |
| 图12.5 | 15 | 15 | 100 | 10 | 67 |
| KZ26（−/−）嵌合体小鼠 |
| 公式9.5 | 12 | 12 | 100 | 10 | 83 | 10 | 2 | 第 |
| E10.5级 | 134 | 117 | 87 | 85 | 73 | 38 | 22 | 57 |
| 图11.5 | 92 | 29 | 32 | 7 | 24 | 12 | 17 | 第 |
| 图12.5 | 71 | 22 | 31 | 5 | 23 | 16 | 0 | 6 |
| 图14.5 | * | 20 | | 8 | 40 | 13 | 7 | 第 |
这些数据表明二氧化二铝-在大约E10.5–E11.5后，使ES细胞无效以促进内皮细胞。通过将KZ26−/−克隆注射到囊胚中，对大量胎仔的胚胎进行分析，证实了这些观察结果的一致性。表中总结了这些数据尽管用杂合ES细胞KZ26制成的嵌合胚胎在从E9.5到E12.5的所有阶段都均匀存活（表)KZ26−/−嵌合体仅在E9.5时存活率为100%。此后，随着lacZ阳性嵌合体比例的降低，存活率逐渐降低。总共分析了188个−/−嵌合体胚胎，E10.5和E11.5之间的存活率和X-Gal阳性率存在较大差距。在+/-嵌合小鼠中没有这种关系。如果胚胎具有高比例的二氧化二铝−/−ES-cell衍生物，因为它们无法形成成熟的血管系统。有可能二氧化二铝内皮细胞在E10.5后选择性凋亡。
讨论
血管生成需要Lmo2 LIM-Only蛋白。
血管生成和血管生成是需要独立信号和可能独立转录活性的独立过程。几种酪氨酸激酶型细胞表面受体已被证明在内皮细胞上特异性表达，它们在血管生成或血管生成中起着重要作用(三,29). 这些信号通路可能负责激活不同血管形成通路中的转录因子表达。确定性造血发育对Lmo2的需求(15)提示该因子可能参与内皮细胞分化。此处提供的数据通过显示选择性无能力二氧化二铝-大约E10.5后，使ES细胞为血管内皮细胞贡献。然而，血管生成的初始过程似乎并不需要Lmo2，因此Lmo2仅在血管生成的血管形成中是必需的。这些发现表明，现在必须考虑Lmo2的至少两种不同功能，即在血管生成和造血中。Lmo2的这些假定作用可能在造血干细胞规范化之前或在造血干电池的增殖和/或进一步分化中发挥。如果造血干细胞的起源发生在大动脉内皮的主动脉-中肾区，Lmo2在血管生成中的作用（在造血干细胞规范之前）也可以解释最终造血的作用（尽管它不能解释卵黄囊造血的作用）。的表达式二氧化二铝然而，在造血祖细胞中，也表明特定的作用可能与不同的造血谱系有关。
血管形成中含有Lmo2的复合物。
Lmo2蛋白包含两个LIM结构域，为蛋白质相互作用提供表面(30). 在能够与Lmo2相互作用的蛋白质中，有基本的螺旋-环-螺旋T细胞产物癌基因Tal1/Scl(16,17). 这种蛋白在内皮细胞中表达(31)并在造血方面发挥作用(32–35)与Lmo2的观察结果类似(14,15). 因此，有趣的是，对塔尔1基因显示该基因在卵黄囊血管生成中起作用(36). Lmo2与Tal1结合，与E47结合，形成DNA-结合元件(18). Lmo2在特定胚胎学功能中的功能可能的解释是，Lmo2分子将不同组的DNA-结合蛋白与Tal1-E47结合在一起，在不同的发育细胞类型中创建不同的二分DNA-绑定复合物。Lmo2复合体的多元主义概念(15,18,19)与鸡尾酒会造血模型相似(37).
有趣的是，Lmo2在胚胎血管生成中表达，但似乎在中胚层的分化中没有作用。这可能是因为Lmo2可以在血管生成阶段催化形成多聚物复合物，可能与Tal1、E47和Ldb1形成多聚体复合物，但这种复合物在发育阶段无法发挥作用，可能是因为缺乏其他相互作用的伙伴。随着分化的进行，可能会表达新的转录因子（可能由血管生成生长因子激活），这些转录因子可能有助于形成Lmo2相关复合物，从而产生DNA结合复合物，控制血管生成所需的靶基因表达。这些假定复合物组成的变化是一个有趣的研究领域，不同的含Lmo2复合物调节（正或负）的靶基因也是如此。
最后，Lmo2在胚胎血管生成中的作用与成人血管生成有关。血管生成在许多临床条件下都很重要，例如肿瘤新生血管、烧伤恢复、伤口愈合和糖尿病视网膜病变。Lmo2在成年小鼠（Y.Y.和T.H.R.，未发表的观察结果）和人类（M.McCormack和T.H.R，未发表观察结果）的内皮细胞中表达，TAL1也在内皮细胞中表示(31). 因此，这些核因子对血管生成的调节在人类血管生成相关疾病的治疗中具有潜在的应用价值。
