MiR-137-介导的LGR4号机组和RANKL公司脂肪间充质干细胞的成骨分化调控

摘要

介绍

人脂肪间充质干细胞（hASCs）作为一种理想的干细胞来源，由于其易获得性、多潜能和低免疫原性，在骨组织工程中得到了广泛应用(迪内斯库等人。, 2021). 微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类大小介于19-25个核苷酸之间的非编码小RNA，在转录后调节蛋白编码基因，并在多种生物活动中发挥关键作用，包括hASC的增殖和成骨分化(Ranganathan和Sivasankar，2014年;风扇等人。, 2021). 已经证明miR-137在各种恶性肿瘤中起着关键的调节作用(锂等人。, 2017;线路接口单元等人。, 2017;秦等人。, 2017;罗等人。, 2018;张等人。, 2018)和神经发育(Silber公司等人。, 2008;斯祖尔瓦赫等人。, 2010;塔伦蒂诺等人。, 2010;太阳等人。, 2011;江等人。,2013). 但到目前为止，只有少数研究探讨了miR-137对成骨的影响(郑等人。, 2019;香港等人。, 2020;妈妈等人。, 2020;于等人。, 2020;风扇等人。, 2021)miR-137的成骨调节机制尚不完全清楚，特别是考虑到不同细胞类型的不同生物学特性。

基因富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(LGR4号机组)与多种生物过程有关，如骨矿化和重塑、先天免疫反应、肠干细胞代谢和能量代谢(周等人。, 2017). 一些研究证实了LGR4号机组前列腺癌细胞中的miR-137(张等人。, 2020)、U-2和MC3T3细胞(刘和徐，2018). 然而，是否LGR4号机组是hASCs中miR-137的靶点，需要确定。此外，LGR4号机组被发现参与骨形成的调节，其抑制导致多个间充质干细胞谱系的骨形成受损(张等人。, 2017;周等人。, 2017;太阳等人。, 2019). 基于这些发现，我们推测miR-137可以通过以下途径调节hASC的成骨分化LGR4型.

基因产物核因子κB配体受体激活剂(RANKL公司)通过蛋白水解裂解或选择性剪接结合或分泌(陈等人。，2018年a). 与核因子-κB受体激活剂（RANK）结合后，RANKL激活与破骨细胞增殖和分化相关的下游信号通路(波义耳等人。, 2003). 此外，RANKL能积极调节血管平滑肌细胞的成骨分化(达文波特等人。, 2016)同时负调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化(陈等人。，2018年b;埃兰戈等人。, 2019)表明RANKL可能对hASCs的成骨分化有影响。

最近的研究表明，LGR4是RANKL的一种新受体，通过与RANK竞争结合RANKL而负向调节破骨细胞分化(罗等人。, 2016;雷内马等人。, 2016). 但是沉默LGR4号机组血管平滑肌细胞可以防止甲状旁腺激素（PTH）诱导的血管钙化，而不会改变RANKL公司和OPG公司表达式(卡里略-洛佩斯等人。, 2021). 然而，到目前为止，LGR4-RNAKL的相互作用如何影响hASCs的成骨分化尚不清楚。因此，我们提出miR-137通过介导LGR4和RANKL之间的相互作用来调节hASC的成骨。

在本研究中，我们确认LGR4号机组是hASCs中miR-137的靶基因LGR4号机组和RANKL公司参与miR-137的成骨控制。揭示miR-137调控成骨的表观遗传机制对于miRNA靶向治疗骨缺损具有重要价值，LGR4-RANKL在成骨分化中的作用的发现对未来骨疾病的临床治疗具有指导意义。

材料和方法

细胞培养与成骨诱导

从三个不同供体收集的hASC在ScienceCell研究实验室（加利福尼亚州卡尔斯巴德）获得，并在含有Dulbecco改良Eagle’s培养基（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Fisher Scientific）、10%（v/v）胎牛血清（中国上海ExCell Bio）和1%（v/v）的增殖培养基（PM）中培养青霉素/链霉素（赛默飞世尔科学公司）。为了诱导hASCs成骨，细胞在成骨培养基（OM）中培养，该培养基由PM、100 nM地塞米松（西格玛奥德里奇，密苏里州圣路易斯）、10 mMβ-甘油磷酸（西格马奥德里奇）和0.2 mM L-抗坏血酸（西格玛奥德里希）组成。hASC在37°C和5%CO下培养₂以及100%的湿度。所有的在体外细胞实验采用第三代（P3）hASCs，并至少重复三次。

慢病毒转染

GenePharma（中国苏州）合成并包装了含有绿色荧光蛋白（GFP）标记质粒载体的重组慢病毒。阴性对照（NC）、miR‐137过表达（miR-137）、miR-137-敲除（抗-miR‐37）、，LGR4号机组shRNA（抗-LGR4型)和RANKL公司shRNA（抗-RANKL公司)分别用于产生相应的慢病毒。如前所述，hASC被各自的慢病毒转染(妈妈等人。, 2020;风扇等人。, 2021). 将细胞浸入带有5 mg/mL聚brene（Sigma-Aldrich）的病毒上清液（感染倍数=100）中24 h后，然后用1μg/mL嘌呤霉素（Sigma Aldrich）筛选细胞并在新鲜PM中培养。转染率是通过在倒置荧光显微镜（TE2000-U，尼康，日本东京）下计数GFP标记细胞的数量和总细胞来计算的。hASCs转染抗-LGR4号机组慢病毒接种在96个平板（1×10）中⁴细胞/孔）并用RANKL公司在检查成骨能力之前，浓度为5μg/ml的抑制剂（denosumab；Amgen，Thousand Oaks，CA）。

碱性磷酸酶（ALP）染色和定量

转染的hASC以2×10的密度接种⁵细胞/孔置于24孔板中，在PM或OM中培养7天。ALP染色按照BCIP/NBT染色试剂盒（Beyotime，中国上海）的说明进行。至于碱性磷酸酶活性的定量，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）和1%Triton X-100（中国北京索拉比奥）冲洗三次，然后刮入微Q水中，进行三次冻融循环。通过使用皮尔斯BCA蛋白检测试剂盒（赛默飞世尔科学公司），在562 nm处读取总蛋白，并根据制造商的协议使用牛血清白蛋白标准曲线进行计算。最后，使用碱性磷酸酶检测试剂盒（中国江苏省南京市建城市）在520 nm处检测ALP活性，并在归一化总蛋白浓度后进行计算。

矿化分析

14天后检测hASCs的细胞外矿化水平在体外用PM或OM培养。用95%乙醇固定30分钟后，在室温下将细胞浸泡在1%茜素红s（ARS）染色液（pH 4.2；Sigma-Aldrich）中30分钟。为了量化基质钙化的程度，ARS染色板分别用100 mM西吡氯铵（Sigma-Aldrich）溶解持续1 h，然后使用EnSpire多模式平板读取器（马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默）在562 nm处检测吸光度。最后，在归一化总蛋白浓度后计算ARS相对强度。

定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

hASCs的总RNA在TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA）中裂解，互补DNA使用逆转录系统合成（日本东京Takara）。分别使用miScript SYBR Green PCR试剂盒（德国法兰克福Qiagen）和FastStart通用SYBR Greenmaster（ROX）（印第安纳波利斯罗氏）在7500实时PCR检测系统（加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）上检测miR-137和基因转录物的定量。相应地，计算miR-137和mRNA的表达水平相对于6号机组小核糖核酸和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司). 第2个^-ΔΔCt方法分析fold变化。引物序列如下：6号机组（正向，5'-CTCCTCGGCAGCACA-3'；反向，5'-AACCTCTCACGAATTTGCGT-3'），GAPDH公司（正向，5'-GGAGCGAGATCCCTCCCAAAAAT-3'；反向，5'-GGCTGTGTCACTTCATCATGG-3'），miR-137，LGR4号机组（向前，5'-CTTTTTTGCCATTTCCTA-3'；向后，5'-CTAGTGAGTTTAATAGCACTAA-3'），RANKL公司（向前，5'-GCAGTGGAGATGTTAG-3'；反向，5'-TTAGCTGCAAGTTTCCC-3'），OPG公司（向前，5'-CATGAGGTTCTGCACAGCTTC-3'；反向，5'-ACAGCCCAGTGACACATTCTAGTA-3'）和runt-related转录因子2(RUNX2（运行2）)（正向，5'-TGTTACTGTCATGGCGGGTA-3'；反向，5'-TTCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA-3'）。

蛋白质印迹

总蛋白用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（Sigma‐Aldrich）和2%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）进行裂解。蛋白质浓度由Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定。装载等量的蛋白质样品（50μg），并通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，MA）。用5%脱脂干乳（BioRuler，Danbury，CT）封闭膜，然后在4°C下用针对GAPDH（Cell Signaling Technology，Beverly，MA；5174S）、LGR4（Abcam，Cambridge，UK；ab75501）、RANKL（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Texas；sc-377079）、OPG（Santa Cruz Bitechnology；sc-11383）的一级抗体（1:1000）培养过夜和RUNX2（细胞信号技术；12556）。在室温下与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二级抗体（1:10000）孵育1小时后，通过皮尔斯ECL加western印迹底物（Thermo Fisher Scientific）观察蛋白质带。使用ImageJ软件（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）分析条带的光密度，并使用GAPDH作为内部对照测量蛋白质的相对表达。

双荧光素酶报告分析

中目标区域的对齐LGR4号机组通过PicTar预测软件进行预测。的3′非翻译区（3′UTR）LGR4号机组mRNA，包括miR-137的可能结合位点，通过PCR扩增并克隆到pEZX‐MT06载体（中国广州GeneCopoeia）中，以产生野生型LGR4号机组(LGR4号机组‐WT）荧光素酶报告质粒。突变型报告载体LGR4号机组(LGR4号机组‐MT）通过使用定点突变试剂盒（SBS Genetech，中国北京）形成。如前所述(风扇等人。, 2016,2021;妈妈等人。, 2020)，荧光素酶检测通过联合转染LGR4号机组-WT或LGR4号机组-MT质粒，NC或miR-137模拟物和脂质体3000（Invitrogen）。转染后48小时，通过双荧光素酶报告分析系统（Promega，Madison，WI）检测荧光素瘤酶活性，并将其归一化为雷尼利亚荧光素酶活性。

统计分析

数据显示为三个单独实验的平均值±标准偏差（SD），并使用SPSS统计20.0软件（IBM，Armonk，NY）进行分析。学生的t吨-分别采用检验或单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验来比较两组或多组的差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

MiR-137在hASCs的成骨分化中起负面作用在体外

为了检测hASCs成骨诱导过程中信号网络模型中关键因子的表达情况，我们检测了miR-137、，LGR4号机组和RANKL公司在不同的时间点（0d、3d、7d和14d）。我们观察到miR-137和RANKL公司随着hASCs的成骨作用而减少，而LGR4号机组增加(图1). 为了证实miR-137在成骨过程中的作用，用慢病毒结构转染hASCs，用于NC和过度表达或下调miR-137，转染率超过90%(图S1A). qRT-PCR分析显示，miR-137过表达组中miR137的表达量增加了10倍以上，而miR-137-敲除组中miR-137的表达量减少了约90%(图S1B). 在PM或OM培养7天后，转染hASC的ALP活性检测显示miR-137过度表达减弱了ALP活性，但miR-137的敲除增强了ALP的活性(图S2 A和B类). 同样，在PM或OM中培养14天后，转染hASC的ARS试验表明，miR-137过度表达降低了细胞外基质的矿化水平，而抑制miR-137显著促进钙化结节的形成(图S2C和天). 这些数据证实miR-137对hASC的成骨作用具有负调节作用在体外.

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图1-

hASCs成骨诱导过程中信号网络模型中关键因子的表达特征。（A） miR-137的qRT-PCR分析（0天、3天、7天和14天），LGR4型和RANKL公司hASCs成骨分化过程中的相对mRNA表达。（B） hASCs成骨分化过程中LGR4和RANKL蛋白表达的Western blotting分析（0天、3天、7天和14天）。所有实验均一式三份。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01。

MiR-137下调LGR4号机组在上调监管的同时RANKL公司成骨抑制期间

通过在hASC中过度表达或敲低miR-137，我们首先研究了miR-137-对LGR4号机组表达式。qRT-PCR（第3天、第7天和第14天）和western blotting（第7天）结果均表明LGR4号机组被miR-137过度表达抑制，但被miR-136敲除激活。然后我们进一步确定了miR-137对RANKL公司并发现miR-137正向调节RANKL公司在mRNA和蛋白质水平。作为关键的成骨相关基因OPG公司和RUNX2（运行2）miR-137的变化呈现相反的趋势(图2)这与miR-137对成骨的负面影响一致。这些结果表明miR-137可以抑制LGR4型但诱导RANKL公司成骨损伤。

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图2-

MiR-137下调LGR4号机组同时上调RANKL公司在成骨抑制期间。（A） qRT-PCR分析（第3天、第7天和第14天）LGR4号机组,RANKL公司,OPG公司和RUNX2（运行2）miR-137过表达或敲除的相对mRNA表达。（B） LGR4、RANKL、OPG和RUNX2蛋白表达与miR-137过表达或敲除的Western blotting分析（7天）。所有实验均一式三份。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01。

MiR-137直接靶向LGR4号机组以hASC为单位

确认是否LGR4型是miR-137的直接靶点，我们进行了双核糖核酸酶报告分析。miR-137在3′UTR中的假定靶位点LGR4号机组由PicTar软件预测(图3 ​A） 。A类). 如所示图3 ​B、，B类miR-137模拟物显著降低了荧光素酶的相对活性LGR4号机组-WT组在转染后48小时，而在LGR4号机组-MT组。这些发现支持miR-137可以靶向LGR4号机组并下调其在hASCs中的表达。

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图3-

MiR-137直接靶向LGR4号机组单位为hASC。（A） PicTar软件预测了miR-137在3′UTR中的结合位点LGR4号机组-WT（红色部分表示中的突变碱基LGR4号机组-MT）。（B） 荧光素酶相对活性分析LGR4号机组-WT和LGR4号机组-MT组转染后48h。所有实验均一式三份。数据表示为平均值±标准偏差。**P<0.01。

LGR4号机组通过激活抑制成骨作用RANKL公司

为了进一步澄清LGR4号机组在miR-137的成骨调节中，我们将NC和LGR4号机组击倒慢病毒并检测成骨潜能和RANKL公司表达式。第7天的ALP染色和定量显示LGR4号机组击倒降低了成骨能力，这表明LGR4号机组是hASCs成骨过程中的正调节因子(图4 ​A类A类和​和B）。B类). 确认有效消声后LGR4号机组，我们观察到LGR4号机组敲除显著提高了小鼠脑组织mRNA（3d、7d和14d）和蛋白质（7d）水平RANKL公司此外OPG公司和RUNX2（运行2）由…引起LGR4号机组击倒也证实了LGR4号机组成骨分化的抑制(图4 ​C类C类和​和D天).

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图4-

LGR4号机组通过激活抑制成骨作用RANKL公司.转染NC的hASC的ALP染色（A）和定量（B），LGR4号机组击倒慢病毒或同时用denosumab治疗(RANKL公司抑制剂）作用7天。（C） qRT-PCR分析（第3天、第7天和第14天）LGR4号机组,RANKL公司,OPG公司和RUNX2（运行2）相对mRNA表达LGR4号机组击倒或同时用denosumab处理。（D） LGR4、RANKL、OPG和RUNX2蛋白表达的Western blotting分析（7天）LGR4型击倒或同时用denosumab处理。所有实验均一式三份。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01。

验证是否LGR4号机组可以调节成骨依赖于RANKL公司，我们使用了denosumab(RANKL公司抑制剂）至LGR4号机组敲除组并检测了与我们假设的信号网络有关的成骨能力和基因表达(LGR4号机组,RANKL公司,OPG公司和RUNX2（运行2）). ALP活性和相关基因的表达都表明，狄诺沙单抗减轻甚至逆转了LGR4号机组hASC引起的击倒(图4). 综合起来，结果表明LGR4号机组通过以下途径击倒受损的成骨RANKL公司刺激和指示之间的负面关系LGR4号机组和RANKL公司在miR-137的成骨调节过程中。

RANKL公司敲除通过诱导促进成骨LGR4号机组

为了进一步了解LGR4号机组和RANKL公司，我们撞倒了RANKL公司并测试了LGR4号机组并影响成骨能力。我们的结果表明RANKL公司敲除导致hASCs的成骨潜能增强，7天的ALP活性测定证明了这一点(图5 ​A类A类和​和B）。B类). 在检测mRNA（第3天、第7天和第14天）和蛋白质（第7天）水平的表达后，我们发现RANKL公司受到显著刺激LGR4号机组,OPG公司和RUNX2（运行2）(图5 ​C类C类和​和D）。天). 因此，我们验证了RANKL公司在里面LGR4号机组hASCs的成骨分化。此外，我们进一步调查了RANKL公司敲除对miR-137有影响，并观察到miR-1373的表达在第3天、第7天和第14天显著下降(图S3). 这些发现，再加上miR-137正调控的事实RANKL公司，提示miR-137和RANKL公司形成了正反馈电路。根据上述结果，我们彻底证实了miR-137诱导的细胞间负相互作用LGR4号机组和RANKL公司可以调节hASCs的成骨。

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图5-

RANKL公司敲除通过诱导促进成骨LGR4号机组ALP染色（A）和量化（B）转染NC或RANKL公司击倒慢病毒7天。（C） qRT-PCR分析（第3天、第7天和第14天）RANKL公司,LGR4号机组,OPG公司和RUNX2（运行2）相对mRNA表达RANKL公司击倒。（D） RANKL、LGR4、OPG和RUNX2蛋白表达的Western blotting分析（7天）RANKL公司击倒。所有实验均一式三份。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01。

讨论

据报道，MiR-137参与了多种癌症的进展(锂等人。, 2017;线路接口单元等人。, 2017; 秦等人。, 2017;罗等人。, 2018;张等人。, 2018)神经元的发育和成熟(Silber公司等人。, 2008;斯祖尔瓦赫等人。, 2010;塔伦蒂诺等人。, 2010;太阳等人。, 2011;江等人。, 2013)和骨代谢(郑等人。,2019;香港等人。, 2020;妈妈等人。, 2020;于等人。, 2020;风扇等人。, 2021). 但与前两个研究领域相比，miR-137调节的成骨分化尚不清楚。在我们之前的研究中，我们已经表明，信号网络由槽口1-HES1型,LSD1型和骨形态发生蛋白2-座椅模块组件miR-137促进hASCs成骨控制的途径(妈妈等人。, 2020;风扇等人。,2021). 然而，由于成骨分化是一个涉及众多信号分子的复杂生物过程，因此有必要充分了解miR-137在成骨方面的潜在机制，以便开发针对骨疾病的miRNA靶向治疗。在这项工作中，我们验证了LGR4号机组是hASC中miR-137的靶点，与LGR4号机组和RANKL公司由miR-137诱导的hASCs参与成骨分化。

首先，我们观察到miR-137和RANKL公司但表达增加LGR4号机组在hASCs成骨培养过程中。这些基因的不同表达谱表明它们对hASCs的成骨作用有潜在贡献。LGR4号机组据报道影响几种类型间充质干细胞的成骨分化。通过损害Wnt/β-catenin途径，抑制LGR4号机组抑制顶端乳头干细胞的增殖、迁移和牙/成骨分化(周等人。, 2017). 删除LGR4型通过抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化减少骨量，并通过骨髓间充质干细胞移植治疗延迟骨折愈合(太阳等人。, 2019). 在hASC中，LGR4号机组沉默抑制ERK信号的活性并阻断成骨(张等人。, 2017). 在重新验证miR-137对hASCs成骨分化的抑制作用后在体外，我们发现miR-137是LGR4号机组也。重要的是，双核糖核酸酶报告子分析确定miR-137直接与LGR4号机组到目前为止，只有两项研究报告了LGR4号机组前列腺癌细胞中的miR-137(张等人。, 2020)、U-2和MC3T3细胞(刘和徐，2018). 在hASC中，我们验证了这一点LGR4号机组也是hASCs中miR-137的靶基因。阐明miR-137调节的成骨作用是否依赖于直接抑制LGR4号机组，我们击倒了LGR4号机组并观察到ALP活性和成骨标志物(OPG公司和RUNX2（运行2）)表达受到抑制，而RANKL公司被诱导。这些发现表明，miR-137通过直接靶向作用可以减弱hASC的成骨作用LGR4号机组.

RANK-RANKL信号传导是破骨细胞增殖和分化的经典途径。除了对破骨细胞生成有影响外，RANKL还被发现参与成骨。RANKL通过上调人主动脉内皮细胞释放BMP2促进人主动脉平滑肌细胞的成骨活性(达文波特等人。, 2016). 而在BMSCs中，RANKL通过抑制成骨分化和促进破骨细胞分化来调节骨稳态(陈等人。，2018年b;埃兰戈等人。, 2019). 通过过度表达或敲低miR-137，我们发现RANKL公司miR-137正调控。为了进一步阐明RANKL公司在hASCs的成骨过程中，我们检测了ALP的相对活性和OPG公司和RUNX2（运行2）评估成骨能力RANKL公司击倒。我们的结果表明RANKL公司抑制显著增加了ALP活性和成骨相关基因的表达，这与上述结果一致，即miR-137基因敲除促进了成骨，而下调了RANKL公司因此，RANKL公司在hASCs成骨分化中起负调节作用。

根据上述结论LGR4号机组和RANKL公司分别对hASCs的成骨有正负效应，我们进一步研究了这两种蛋白之间的关系。最近，发现LGR4作为一种新的RANKL受体，与RANK竞争结合RANKL并激活Gαq/GS3K-β信号通路，从而阻断破骨细胞的生成(罗等人。, 2016). 此外，LGR4号机组是规范的转录目标RANKL公司-活化T细胞核因子1(NFATc1型)，表明了这一点LGR4号机组作为控制RANKL活动的反馈回路（Renema等人。, 2016). 然而，LGR4号机组沉默可以防止甲状旁腺素诱导的血管钙化，而不会改变RANKL公司和OPG公司VSMC中的表达(卡里略-洛佩斯等人。, 2021). 到目前为止，这是第一项评估LGR4号机组和RANKL公司在hASCs的成骨过程中。我们观察到RANKL公司通过LGR4号机组击倒，以及对RANKL公司减轻甚至逆转了LGR4号机组缺乏。因此，这些结果表明LGR4型敲除通过刺激抑制hASCs的成骨作用RANKL公司此外，RANKL公司击倒显著激活LGR4号机组和成骨分化，表明RANKL公司对…有负面影响LGR4号机组hASCs的成骨作用。有趣的是，RANKL公司沉默导致miR-137表达下降，表明RANKL公司对miR-137具有正反馈作用，并且miR-137RANKL公司击倒可能会进一步增强LGR4型刺激。miR-137的参与-RANKL公司正前馈回路可以部分解释LGR4号机组和RANKL公司尽管LGR4号机组和RANKL公司据报道为破骨细胞谱系(罗等人。, 2016;雷内马等人。, 2016). 此外，考虑到不同细胞系的生物学特性的多样性，我们推测其他信号可能参与调节LGR4号机组-RANKL公司需要进行串扰和进一步调查。

总之，我们的研究表明miR-137通过直接结合LGR4号机组并建立了一个分子机制模型，阐述了LGR4号机组-RANKL公司miR-137介导的负相互作用(图6). 这些发现为基于miRNA的骨代谢障碍治疗的未来提供了重要见解。

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图6-

一个涉及miR-137介导的负串扰的分子机制模型LGR4号机组和RANKL公司在hASCs成骨分化过程中。简言之，miR-137直接靶向LGR4号机组同时受到积极监管RANKL公司.值得注意的是LGR4型和RANKL公司miR-137可以协同增强。绿色实线表示正调控，红色虚线表示负调控。

鸣谢

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