Transl Oncol公司。2022年11月；25: 101515.
环状RNA 0010117通过调节miRNA-6779-5p/SPEN轴促进侵袭性胶质母细胞瘤行为
,一 ,一 ,a、，b条 ,一 ,a、，⁎和c、，⁎
周新辉
一南昌大学第一附属医院神经外科
b条中国南昌大学医学院
单旭
c（c）中国江西省南昌市永外街17号南昌大学第一附属医院病理科，邮编330006
一南昌大学第一附属医院神经外科
b条中国南昌大学医学院
c（c）中国江西省南昌市永外街17号南昌大学第一附属医院病理科，邮编330006
2022年5月18日收到；2022年7月31日修订；接受2022年8月5日。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
亮点
•
Circ-0010117在胶质母细胞瘤中下调。
•
Circ-0010117通过miRNA-6779-5p调节胶质母细胞瘤的侵袭性。
•
SPEN有助于调节胶质母细胞瘤中的miRNA-6779-5p。
•
上调的Circ-0010117被抑制体内人脑胶质母细胞瘤异种移植瘤的生长。
关键词：胶质母细胞瘤，约-0010117，miR-6779-5p，SPEN
摘要
非编码RNA（Noncoding RNAs，ncRNAs）在癌症生物学中发挥着重要作用，为癌症干预提供了潜在靶点。作为一类新的内源性非编码RNA，环状RNA（circRNAs）最近在细胞发育和功能中被发现，某些类型的病理反应有助于癌症的进展，包括胶质母细胞瘤。然而，circRNAs与胶质母细胞瘤进展之间关系的潜在机制尚不清楚。方法：检测环状RNA 0010117（circ-0010117）的表达及其作用体外和体内定量RT-PCR和western blotting用于测量circRNA、miRNA、每个基因或相关蛋白的表达。通过细胞生物学实验检测circ-0010117在胶质母细胞瘤细胞系中的生物学功能。此外，还进行了生物信息学分析、荧光素酶报告子分析和功能互补分析，以研究目标基因。通过将异种细胞移植到裸鼠体内来评估肿瘤发生。在本研究中，我们发现与相应的癌旁组织相比，胶质母细胞瘤中的circ-0010117下调。随后，我们观察到，circ-0010117可以通过miR-6779-5p调节胶质母细胞瘤细胞的侵袭性。此外，SPEN被证实是miR-6779-5p的直接靶点，并参与了circ-0010117调控网络。此外，我们发现circ-00101 17的过度表达可以抑制裸鼠的肿瘤发生。我们的研究结果表明，环状RNA 0010117通过调节miRNA-6779-5p/SPEN轴促进胶质母细胞瘤的侵袭行为。我们的结果为使用circ-0010117作为胶质母细胞瘤的新潜在治疗靶点提供了理论依据。
关键词：胶质母细胞瘤，约-0010117，miR-6779-5p，SPEN
引言
胶质母细胞瘤是全球最常见的胶质源性原发性脑癌，也是全球神经系统肿瘤相关死亡的主要原因[1]尤其是恶性胶质母细胞瘤预后极差，对人类健康构成严重威胁。近年来，尽管在手术、化疗和分子靶向治疗方面取得了进展，但胶质母细胞瘤的发病率和死亡率仍然很低。鉴于诊断和治疗策略欠佳，更好地了解胶质母细胞瘤的发病机制对于推进和提供潜在的生物标记物驱动治疗至关重要。
非编码RNA（ncRNAs）是一类非蛋白翻译RNA，包括长度超过200个核苷酸的长非编码RNA，长度为20-22个核苷酸的小RNA，以及以共价闭合环为特征的环状RNA。与其他ncRNAs类似，circRNAs在多个组织中表达，具有很大的变异性。CircRNAs是一类特殊的非编码RNA，通过一种称为反向剪接的非经典剪接过程，起源于外显子、内含子、基因间区域或非翻译区域[2]重要的是，circRNAs参与多种肿瘤的发生并调节肿瘤的发展。据报道，环状RNA hsa_circ_0001785可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭体外和体内通过海绵状miR-942上调SOCS3（细胞因子信号抑制因子3）[3].环状RNA hsa_circ_0079929也已被证实可抑制肝细胞癌中的肿瘤生长[4]另一种新的环状RNA circENTPD7已被证实通过靶向ROS1（ROS原癌基因1）参与胶质母细胞瘤的进展[5]然而，circ-0010117在胶质母细胞瘤进展中的潜在重要功能作用尚不清楚。
在本研究中，我们首先研究了circ-0010117在人类胶质母细胞瘤组织中的表达。随后，我们研究了circ-0010117对人类胶质母细胞瘤细胞侵袭性的影响。此外，我们还探索了这些效应的分子机制。
材料和方法
人骨肉瘤临床标本
2021年11月至2022年1月，在南昌大学第一附属医院共收集到6对骨肉瘤及其癌旁组织。所有组织标本均在手术过程中切除，并直接在液氮中快速冷冻。本研究方案得到了南昌大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有书面知情同意书均来自接受手术切除的患者。
细胞培养
U251和U87细胞系（中国武汉procell）通常用作胶质母细胞瘤的实验模型。细胞培养在添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco，Waltham，MA，USA）、丙酮酸（1mM；西格玛-奥德里奇，中国上海）、非必需氨基酸（0.1 mM；西格玛-奥里奇，中国中国上海在含5%CO的增湿大气中237°C时。
定量RT-PCR
使用mirVana从组织样品和细胞中分离出总RNATM公司miRNA分离试剂盒（Ambion，Austin，TX，USA），根据制造商的说明。使用SYBR green在7500 Fast Real-Time PCR系统（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德应用生物系统公司）中进行RT-qPCR分析。采用qRT-PCR检测Circ-0010117、microRNA-6779-5p（miR-669-5p）和SPEN。如前所述，U6被用作circ-0010117和miR-669-5p的内部参考[6]β-肌动蛋白被用作SPEN的内部控制。所有引物均来自Sangon Biotech（中国上海）。如前所述，计算circRNA、miRNA或每个基因相对于内部对照的数量[7]。
circ-0010117的RNA干扰
靶向circRNA-0010117序列连接区的Circ-0010117 siRNAs（siRNA-#1、siRNA-#2和siRNA-#3）可从GeneCopoeia（美国马里兰州罗克维尔）购得。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）转染siRNA。shcirc-0010117也可从GeneCopoeia（马里兰州罗克维尔）购得。
对于circ-0010117过表达质粒（circ-00101 17），将该序列克隆到GV248中。利用pLCDH-ciR（Geneseed，广州，中国）的主干构建circ-0010117过表达质粒。扩增了circ-0010117的线性序列和侧翼circ-00101 17诱导序列，并将其亚克隆到pLCDH-ciR的EcoRI和BamHI位点。
MiR-6779-5p/SPEN过度表达和抑制
对于SPEN过度表达体外，我们使用了SPEN载体构建（OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD）。U251和U87细胞接种在6孔板中（美国马萨诸塞州剑桥市科宁）（2×105细胞/孔）。将2μg SPEN载体或载体对照物（OriGene Technologies）用Lipofectamine 3000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和Opti-MEM（Gibco）转染细胞4小时。然后，我们用完整的介质替换Opti-MEM。48小时后，收集细胞进行下一次测定。MiR-6779-5p模拟机可从生命技术中商用。按照制造商的说明，使用RNAiMAX试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）转染miRNA模拟物。miRNA载体控制（NC模拟）用作载体控制。shSPEN和miR-6779-5p抑制剂也可从GeneCoppoyme（Rockville，MD）商购。
细胞计数试剂盒-8（CCK8）分析
采用CCK-8分析评估U251和U87细胞的增殖。对于CCK-8分析，模拟和感染细胞（1×105细胞/孔）在转染24小时后接种到96孔板（Corning，Cambridge，MA，USA）中，并培养24小时、48小时和72小时。根据制造商的协议，使用CCK-8（日本熊本Dojindo实验室）在指定时间测量450 nm处的吸光度。
集落形成分析
对于菌落形成分析，我们在微波中熔化1.4%（v/v）琼脂糖（中国上海西格玛奥尔德里奇），并将其冷却至室温。然后，我们将等体积的1.4%融化的琼脂糖和完整的细胞培养基混合。然后，将2 ml 0.7%（v/v）低熔点琼脂添加到6孔板的每个孔中（康宁，剑桥，马萨诸塞州，美国），并留着让琼脂凝固。电池（5×10三细胞/孔）在完整培养基中与1.4%琼脂糖混合，并在1～3周时将其涂布在凝固层顶部形成菌落。每3天喂细胞一次完整的培养基。
菌落需要至少由50个细胞组成[8]克隆用4%多聚甲醛固定30分钟，并用0.1%结晶紫染色（Millipore，Billerica，MA，USA）。人工计数可见菌落。
细胞凋亡测定
流式细胞术检测细胞凋亡。U251和U87细胞用胰蛋白酶（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）消化并用PBS洗涤。用10%FBS封闭后，用5μl FITC膜联蛋白V和1μl碘化丙啶（Becton Dickinson，Heidelberg，Germany）对细胞进行染色，并在室温下黑暗中培养15分钟。然后，进行流式细胞术（德国达姆施塔特生命科技公司）。然后用CellQuest软件（BD Biosciences，San Jose，CA）对细胞进行分析。比较每种情况下死亡细胞和凋亡细胞的相对比例。
伤口划痕分析
首先用shcirc-0010117或circ-00101 17或其相关对照转染U251和U87细胞24小时。如前所述进行伤口划痕试验[9],[10],[11],[12]然后，将细胞接种到12孔板（5×105细胞/孔），培养24h，达到～90%的融合。使用10μl移液管尖端绘制划痕线。用PBS清洗细胞3次，以去除刮伤的细胞。然后，在含有0.5%FBS的培养基中培养细胞。在37°C下培养细胞，并使用光学显微镜在0和48小时拍摄图像（日本东京奥林巴斯公司）。
细胞侵袭
使用带有24孔胶原基细胞侵袭检测试剂盒（美国马萨诸塞州贝德福德市米利波）的博伊登室检测法进行跨孔检测。首先用shcirc-0010117或circ-00101 17或其相关对照转染U251和U87细胞24小时。然后，200μl无血清培养基含有5×105单元格已添加到过滤器中。然后，将750μl完整的细胞培养基添加到底室中，其中FBS用作化学引诱剂。培养指定时间后，用棉签擦洗非侵入性细胞。粘附在膜外部的细胞被固定并用Cristal Violet溶液染色（Millipore，Billerica，MA，USA）。使用奥林巴斯光学显微镜（Olympus Corporation，Tokyo，Japan）观察侵袭细胞。
双荧光素酶报告分析
其3'-UTR和突变株miR-6779-5p的circ-0010117结合位点可在GeneCopoeia（马里兰州罗克维尔）买到。U251和U87细胞接种在6孔板（美国马萨诸塞州剑桥市科宁）中，密度为2.5×105具有完全培养基的细胞/孔。用1µg circ-0010117 3'-UTR（circ0010117-WT）或突变荧光素酶报告子构建物（circ001 0117-Mut）与20 nM miRNA模拟物或NC模拟物（使用Lipofectamine 2000（加利福尼亚州卡尔斯巴德，美国）与Opti-MEM（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，吉布科）共转染细胞48小时。使用GeneCopoeia的双荧光素酶报告分析试剂进行荧光素酶分析。数据表示为萤火虫荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性的比率。
蛋白质印迹
使用T-PER组织蛋白提取试剂（Thermo-Pierce，Rockford，IL，USA）和1%的Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Thermo Pierse，Rock福德，IL，US）从含有和不含circ-0010117的细胞中提取总蛋白。然后，将提取的蛋白质装入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（8-12%分离凝胶，5%浓缩凝胶）上。将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上（Millipore，Bedford，MA，USA）进行抗体检测。在室温下，将PVDF膜在含有0.1%吐温-20洗涤剂（TBST）的Tris缓冲盐水中的5%脱脂牛奶中封闭1h。在室温下用TBST清洗膜3次，每次10 min，并在4℃下与一级抗体（抗结核菌素cas-3、全cas-3、cas-8、cas-9、BCL-2、BAX、P53和JNK1）孵育过夜。β-肌动蛋白作为内部控制（Abcam，剑桥，马萨诸塞州，美国）。然后，在室温下用TBST清洗膜3次，每次10分钟，并用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG二级抗体孵育（Thermo Pierce，Rockford，IL，USA）在室温下清洗1小时。在室温下用TBST清洗膜3次，每次10分钟后，使用ECL western印迹检测试剂（SuperSignal®West Dura Extended Duration基板，Thermo Pierce，美国伊利诺伊州罗克福德市）对蛋白质进行可视化。通过ImageJ（NIH，Bethesda，MD，USA）定量分析目标蛋白的相对表达。
小鼠异种移植试验
雌性裸鼠（BALB/c，SPF级，体重16–20 g，4周龄）购自上海凌畅生物科技有限公司（中国上海）。转染细胞用胰蛋白酶消化并用PBS洗涤两次。细胞在含有100µL PBS和100µLMatrigel底物的200µL溶液中重新悬浮，最终密度为2×107细胞/0.2 mL。将4周龄雌性BALB/c裸鼠皮下注射2×107肿瘤细胞。注射肿瘤细胞后第35天处死小鼠，并测量肿瘤体积。
统计分析
使用GraphPad Prism进行统计分析，所有数据均以三次试验的平均值±标准偏差（SD）表示。组间差异通过非配对t检验进行分析。A类第页值<0.05被认为是显著的。
结果
Circ-0010117在胶质母细胞瘤中下调
在本研究中，我们首先用qRT-PCR测定了6对胶质母细胞瘤和相应的癌旁组织中circ-0010117的mRNA表达水平。与正常组织相比，Circ-0010117 mRNA水平显著下调(P（P） < 0.05,A） ●●●●。随后，我们检测了U251和U87细胞中circ-0010117的表达。靶向circ-0010117的合成干扰寡核苷酸显著降低了U251和U87细胞系中circ-00101 17的表达(B和C）。Circ-0010117的过度表达强烈增加了U251和U87细胞系中Circ-001017的表达(D） ●●●●。
Circ-0010117在胶质母细胞瘤中下调。（A） 用qRT-PCR检测肿瘤旁组织和肿瘤组织中的Circ-0010117 mRNA水平*P（P）与癌旁组织相比<0.05。Circ-0010117在U251（B）和U87（C）细胞中的表达*P（P）<0.05 vs.NC。（D）靶向circ-0010117的合成干扰寡核苷酸显著降低了U251和U87细胞系中circ-00101 17的表达*P（P）与对照组相比<0.05。
Circ-0010117调节胶质母细胞瘤的侵袭性
与对照组相比，U251和U87细胞株中circ-0010117的沉默显著增强了细胞增殖(A和B）。然而，在U251和U87细胞系中circ-0010117的过度表达显著抑制了细胞增殖(C和D）。接下来，我们试图确定circ-0010117的改变是否会影响U251和U87的克隆性。如所示E–H，circ-0010117沉默显著增强了MSTO-211H细胞的锚定依赖性生长(E和F）。此外，circ-0010117的过度表达强烈降低了U251和U87细胞的锚定依赖性生长(G和H）。因此，circ-0010117可以调节胶质母细胞瘤细胞的生长活动。
Circ-0010117调节胶质母细胞瘤的侵袭性。采用CCK-8法检测shcirc-0010117对U251（A）和U87（B）细胞增殖的影响*P（P）<0.05 vs.NC。通过CCK-8分析检测circ-0010117过度表达对U251（C）和U87（D）细胞增殖的影响*P（P）<0.05 vs.NC。通过集落形成试验检测shcirc-0010117对U251和U87细胞（E，F）集落形成的影响*P（P）<0.05 vs.NC。通过集落形成试验检测到circ-0010117过度表达对U251和U87细胞（G，H）集落形成的影响*P（P）与NC相比<0.05。shcirc-0010117对U251和U87细胞伤口愈合的影响（I）*P（P）<0.05 vs.NC。circ-0010117过度表达对U251和U87细胞伤口愈合的影响（J）*P（P）<0.05 vs.NC。通过transwell分析检测shcirc-0010117对U251和U87细胞（K）侵袭的影响*P（P）<0.05 vs.NC。通过transwell分析检测circ-0010117过度表达对U251和U87细胞（L）侵袭的影响*P（P）<0.05 vs.NC。流式细胞术检测shcirc-0010117对U251和U87细胞（M）凋亡的影响*P（P）<0.05 vs.NC。流式细胞术检测circ-0010117过度表达对U251和U87细胞（N）凋亡的影响*P（P）与NC相比<0.05。
增强的迁移和侵袭是转移级联的另一个关键特征。为了评估circ-0010117对MPM细胞迁移和侵袭的影响，分别进行了伤口划痕和穿孔实验。如所示一、 与对照组相比，沉默circ-0010117后U251和U87细胞的缝隙闭合率显著提高。然而，与对照组相比，在U251和U87细胞中过度表达circ-0010117后，缝隙闭合率显著降低(J） ●●●●。
同样，与对照组相比，通过transwell实验在U251和U87细胞中观察到circ-0010117沉默的细胞侵袭性显著增加(K） ●●●●。相反，与对照组相比，我们观察到过度表达circ-0010117的U251和U87细胞的细胞侵袭性显著降低(五十） ●●●●。我们还通过流式细胞术通过circ-0010117调节来评估细胞凋亡的改变。在circ-0010117沉默后，U251和U87细胞的凋亡细胞百分比降低(M） 。对于过度表达circ-0010117的U251和U87细胞，显示凋亡的细胞百分比显著增加(N） ●●●●。这些结果表明，circ-0010117调节胶质母细胞瘤的侵袭性。
Circ-0010117通过miRNA-6779-5p调节攻击性
揭示circ-0010117参与胶质母细胞瘤恶性表型的相关机制。我们寻找了circ-0010117的潜在调控机制。接下来，我们询问miRNAs是否在调节与胶质母细胞瘤恶性表型相关的circ-0010117中发挥重要作用。我们发现miR-6779-5p显著降低U251和U87细胞中circ-0010117 WT的荧光素酶活性，但不降低Mut的活性(A） ●●●●。接下来，我们研究了抑制或过度表达miR-6779-5p在U251和U87细胞中的作用，其中circ-0010117沉默或circ-00101过度表达。抑制或过度表达miR-677-5p后，证实miR-6779-5p的表达水平(B） ●●●●。
Circ-0010117通过miRNA-6779-5p调节攻击性。MiR-6779-5p显著降低了U251（A）和U87（B）细胞中circ-0010117 WT的萤光素酶活性，但不降低Mut的活性*P（P）<0.05与NC模拟。（B） 抑制或过度表达miR-677-5p后，确认miR-6779-5p的表达水平*P（P）与NC抑制剂或NC模拟物相比，<0.05。（C） 用CCK-8检测shcirc-0010117和miR-6779-5p抑制剂对U251和U87细胞增殖的影响*P（P）<0.05 vs.NC。（D）通过CCK-8分析检测circ-0010117和miR-6779-5p过度表达对U251和U87细胞增殖的影响*P（P）<0.05 vs.NC。（E）通过跨阱分析检测shcirc-0010117和miR-6779-5p抑制剂对U251和U87细胞侵袭的影响*P（P）<0.05 vs.NC。（F）通过跨阱分析检测circ-0010117和miR-6779-5p过度表达对U251和U87细胞侵袭的影响*P（P）（G）流式细胞术检测shcirc-0010117和miR-6779-5p抑制剂对U251和U87细胞凋亡的影响*P（P）<0.05 vs.NC。（H）流式细胞术检测circ-0010117和miR-6779-5p过度表达对U251和U87细胞凋亡的影响*P（P）与NC相比<0.05。
将Shcirc-0010117和miR-6779-5p抑制剂转染到U251和U87细胞中，以抑制circ-00101 17和miR6779-5p的表达。miR-6779-5p抑制剂对U251和U87细胞的作用与CCK-8检测到的circ-0010117对细胞增殖的作用一致(C） ●●●●。相反，将circ-0010117和miR-6779-5p模拟物转染到U251和U87细胞中，以过表达circ-0010117和miR-6779-5p。我们发现miR-6779-5p过度表达增强了U251和U87细胞的增殖，从而逆转了circ-0010117过度表达对细胞增殖的影响(D） ●●●●。
在侵袭和凋亡方面也发现了类似的结果。miR-6779-5p抑制剂对U251和U87细胞的作用与circ-0010117对细胞侵袭和凋亡的影响一致，后者通过transwell分析和流式细胞术检测(E和G）。此外，我们发现miR-6779-5p过表达增强了U251和U87细胞的侵袭和凋亡，从而逆转了circ-0010117过表达对过度表达circ-00101 17和miR-6779-5p细胞侵袭和凋亡的影响(F和H）。
SPEN有助于miRNA-6779-5p调节
探讨circ-0010117和miR-6779-5p对胶质母细胞瘤恶性表型的调控机制。我们随后确定了miR-6779-5p的潜在靶点。我们发现miR-6779-5p显著降低了U251和U87细胞中SPEN WT的荧光素酶活性，但不降低Mut的活性(A） ●●●●。在U251和U87细胞中，miR-6779-5p抑制后SPEN mRNA水平也显著降低(B） 但miR-6779-5p过度表达后显著增加(C） ●●●●。
SPEN有助于miRNA-6779-5p调控。MiR-6779-5p显著降低了U251（A）和U87（B）细胞中SPEN WT的荧光素酶活性，但不降低Mut的荧光素酶活性*P（P）<0.05与NC模拟。（B） SPEN表达水平在过度表达（C）或抑制（D）miR-677-5p后得到确认*P（P）与NC模拟物或NC抑制剂相比，<0.05。（D） 通过CCK-8分析检测miR-6779-5p和SPEN过度表达对U251和U87细胞增殖的影响（左）。通过CCK-8分析检测miR-6779-5p抑制剂和shSPEN对U251和U87细胞增殖的影响（右）*P（P）与NC模拟物或NC抑制剂相比，<0.05。（E） 用跨阱法检测miR-6779-5p抑制剂和shSPEN对U251和U87细胞侵袭的影响*P（P）与NC抑制剂相比，<0.05。（F） 用跨阱分析检测miR-6779-5p和SPEN过度表达对U251和U87细胞侵袭的影响*P（P）<0.05与NC模拟。（G） 用流式细胞术检测miR-6779-5p抑制剂和shSPEN对U251和U87细胞凋亡的影响*P（P）与NC抑制剂相比，<0.05。（H） 流式细胞术检测miR-6779-5p和SPEN过表达对U251和U87细胞凋亡的影响*P（P）<0.05与NC模拟。
将miR-6779-5p模拟物和SPEN过表达质粒转染到U251和U87细胞中，以增加miR-6779-5p和SPEN的表达。SPEN在U251和U87细胞中的过度表达逆转了CCK-8检测到的miR-6779-5p过度表达对细胞增殖的影响(D） ●●●●。我们还用miR-6779-5p抑制剂和shSPEN转染U251和U87细胞，以敲低miR-6779-5p和SPEN。如所示D、 SPEN敲除阻断miR-6779-5p抑制对细胞增殖抑制的作用。
与细胞增殖一致，SPEN敲除逆转了miR-6997-5p沉默对U251和U87细胞侵袭和凋亡的影响(E和G）。然而，SPEN过表达抑制了miR-6779-5p过表达引起的U251和U87细胞侵袭和凋亡(F和H）。
Circ-0010117上调抑制肿瘤生长体内
为了进一步评估circ-0010117的过度表达是否可以抑制肿瘤的形成体内，我们用U251细胞系接种稳定的过表达circ-0010117(A） 皮下注射至4周龄裸鼠。结果表明，当移植瘤细胞过度表达U251时，肿瘤的大小和重量显著降低(B–D）。
Circ-0010117上调抑制肿瘤生长体内试验。（A） circ-0010117在U251细胞系中稳定过度表达。（B） 皮下注射到4周龄裸鼠体内。结果表明，过度表达circ-0010117的肿瘤细胞移植后，肿瘤大小（B，C）和重量（D）显著降低*P（P）与对照组相比<0.05。（E） 通过western blotting检测circ-0010117过度表达对caspase途径的影响*P（P）与对照组相比<0.05。
为了研究circ-0010117过度表达影响caspase途径的分子机制，我们通过western blotting测定了参与该途径的每个成分(E） 。circ-0010117过表达增强了截短的cas-3、全cas-3、cas-8、cas-9、BAX、P53和JNK1(E） 。然而，BCL-2被circ-0010117过度表达抑制(E） 。因此，我们得出结论，circ-0010117的过度表达也通过caspase途径抑制肿瘤的发生体内。
讨论
目前，胶质母细胞瘤是世界范围内常见的恶性肿瘤[13]近年来，随着对胶质母细胞瘤生物标志物的研究，胶质母细胞肿瘤的靶向诊断、治疗和预后已取得初步成果，但对抗胶质母细胞癌仍需进一步研究。因此，识别胶质母细胞瘤中的关键生物标志物是治疗胶质母细胞癌的有效策略。
由于circRNAs在人类癌症中的关键作用，其在癌症进展中的作用受到了广泛关注。在本研究中，我们的目标是探讨circ-0010117在胶质母细胞瘤进展中的潜在重要作用。该检查证实，circ-0010117通过miRNA-6779-5p和SPEN参与了胶质母细胞瘤过程，表明circ-00101 17是胶质母细胞癌的新生物标记物。
CircRNAs是一类新的内源性非编码RNA，最近被认为是胶质母细胞瘤的重要调节因子。MiRNAs是一组19–22核苷酸非编码单链RNA分子，参与基因表达的序列特异性转录后调控[14]最近，新的证据证实，circRNAs可以通过circRNA-miRNA-mRNA轴调节抑癌或致癌基因的表达。例如，环状RNA circ-0001946已被验证为一种竞争性内源性RNA，通过调节miR-671-5p和CDR1来抑制胶质母细胞瘤的进展[15]环形RNA circMTO1通过miR-92/WWOX信号通路抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖[16]。由于它们在胶质母细胞瘤发展中的表达和功能仍不明确，我们筛选了胶质母细胞癌和匹配的非肿瘤肝组织之间差异表达的circRNAs，重点研究了circ-0010117减少在胶质瘤进展中的作用和潜在机制。在这项研究中，我们发现circ-0010117在胶质母细胞瘤中下调。此外，circ-0010117可以调节胶质母细胞瘤的侵袭性。本发明扩大了对circ-0010117在胶质母细胞瘤调节中的作用的认识，这可能有助于更好地阐明胶质母细胞癌的病理机制。
许多研究人员已经证明，circRNAs通过miRNAs调节疾病的进程[17]先前的研究人员发现许多miRNAs与胶质母细胞瘤有关；例如，miRNA-381抑制了胶质母细胞瘤中的EMT[18]据报道，miRNA-124-3p可抑制胶质母细胞瘤的生长[19]相反，miRNA-1908促进了胶质母细胞瘤[20]在这里，实验证明miRNA-6779-5p是circ-0010117的下游，因为它们已经确认了连接点。我们发现miRNA-6779-5p的水平明显上调，与胶质母细胞瘤中circ-0010117的水平形成对比。
分裂末端（SPEN）是一种ERα辅升压因子，我们已将其鉴定为ERα阳性乳腺癌细胞中的肿瘤抑制蛋白[21]据报道，SPEN在癌症进展中起着重要作用。例如，已发现SPEN在鼻咽癌中诱导miR-4652-3p靶向HIPK2[22]通过单倍体胚胎干细胞的正向遗传筛选，SPEN也被确定为Xist功能的关键因子[23]然而，尚不清楚SPEN是否参与circ-0010117和miR-6779-5p调控网络。在本研究中，我们发现SPEN是miR-6779-5p的直接靶点，SPEN参与miRNA-6779-5p调控网络。
结论
总之，我们确定circ-0010117通过miRNA-6779-5p和SPEN与胶质母细胞瘤的侵袭性有关。我们的结果为使用circ-0001946作为胶质母细胞瘤的新潜在治疗靶点提供了理论依据。
数据可用性
当前研究的所有数据都包含在文章中或作为补充信息上传。
基金
本研究得到江西省卫生厅科技项目（No:202210394）的资助。
道德批准和参与同意
实验方案经南昌大学第一附属医院伦理委员会批准。本文的全部或部分内容尚未在其他地方发表。所有作者均已阅读并批准该内容，并同意将其提交以供考虑在您的期刊上发表。这篇文章没有涉及道德/法律冲突。研究中的所有参与者均获得知情同意。
CRediT作者贡献声明
杨宣勇：写作——原稿，写作——审查和编辑，方法。刘悦：写作——原稿，写作——审查和编辑。周新辉：数据管理、可视化。康晨：概念化、验证、监督。姜旭：可视化、数据管理。单旭：写作-初稿，写作-审查和编辑，方法，资金获取。
工具书类
1Bray F.、Ferlay J.、Soerjomataram I.、Siegel R.L.、Torre L.A.、Jemal A.2018年全球癌症统计数据：GLOBOCAN对185个国家36种癌症的全球发病率和死亡率的估计。加州癌症杂志临床。2018;68(6):394–424. doi:10.3322/caac.21492。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Wang M.，Yu F.，Wu W.，Zhang Y.，Chang W.，Ponnusamy M.，Wang K.，Li P.循环RNA：一种新型非编码RNA及其在抗病毒免疫中的潜在意义。国际生物学杂志。科学。2017;13（12） ：1497-1506。doi:10.7150/ijbs.22531。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。高D.、胡S.、郑X.、林W.、高J.、常K.、赵D.、王X.、周J.、卢S.、格里菲斯H.R.、刘J.SOD3由脂肪细胞分泌，缓解高脂饮食诱导的肥胖、炎症和胰岛素抵抗。抗氧化剂。氧化还原信号。2020;32(3):193–212. doi:10.1089/ars.2018.7628。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4郑浩，陈涛，李C.，徐C.，丁C.，陈J.，鞠S.，张Z.，梁Z.，崔Z.，赵J.一种环状RNA hsa_circ_0079929抑制肝细胞癌中的肿瘤生长。癌症管理。物件。2019;11:443–454. doi:10.2147/CMAR。第189338条。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5朱凤，程聪，秦华，王华，于华。一种新的环状RNA circENTPD7通过靶向ROS1促进胶质母细胞瘤的进展。癌症细胞国际。2020;20：118.网址：10.1186/s12935-020-01208-9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6夏伟，邱明，陈瑞，王顺，冷霞，王杰，徐勇，胡杰，董刚，徐鹏，尹瑞。环状RNA has_circ_0067934在食管鳞癌中上调并促进增殖。科学。代表。2016;6：35576.doi:10.1038/srep35576。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Livak K.J.、Schmittgen T.D.使用实时定量PCR和2（-Delta Delta C（T））方法分析相关基因表达数据。方法。2001;25(4):402–408. doi:10.1006/meth.2001.1262。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Franken N.A.、Rodermond H.M.、Stap J.、Haveman J.、van Bree C.细胞克隆测定体外。《国家协议》。2006;1(5):2315–2319. doi:10.1038/nprot.2006.339。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Arsic N.、Bendris N.、Peter M.、Begon-Pecia C.、Rebouissou C.、Gadea G.、Bouquier N.、Bibeau F.、Lemmers B.、Blanchard J.M.细胞周期蛋白A2的新功能：通过RhoA信号控制细胞侵袭。《细胞生物学杂志》。2012;196(1):147–162. doi:10.1083/jcb.201102085。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Chen L.M.、Wang W.、Lee J.C.、Chiu F.H.、Wu C.T.、Tai C.J.、Wan C.K.、Tai C.J.、Huang M.T.、Chang Y.J.血栓调节蛋白介导上皮性卵巢癌细胞的进展。肿瘤生物学。2013;34(6):3743–3751. doi:10.1007/s13277-013-0958-x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Espada J.、Matabuena M.、Salazar N.、Lucena S.、Kourani O.、Carrasco E.、Calvo M.、Rodriguez C.、Reyes E.、Gonzalez S.、Juarranz A.Cryptomphalus aspersa软体动物卵提取物促进迁移，防止角质形成细胞和皮肤成纤维细胞的皮肤老化体外。国际J.Cosmet。科学。2015;37(1):41–55. doi:10.1111/ics.12167。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Lee S.J.、Kim W.J.和Moon S.K.。p38 MAPK信号通路在介导白介素-28A诱导的UMUC-3细胞迁移中的作用。国际分子医学杂志。2012;30(4):945–952. doi:10.3892/ijmm.2012.1064。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Omuro A.胶质母细胞瘤和其他恶性胶质瘤：临床综述。JAMA公司。2013;310(17):1842–1850. doi:10.1001/jama.2013.280319。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Ambros V.动物微小RNA的功能。自然。2004;431(7006):350–355. doi:10.1038/nature02871。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Li X.，Diao H.Circular RNA circ_0001946作为一种竞争性内源性RNA，通过调节miR-671-5p和CDR1抑制胶质母细胞瘤的进展。J.细胞。生理学。2019;234(8):13807–13819. doi:10.1002/jcp.28061。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Zhang X.，Zhong B.，Zhang W.，Wu J.，Wang Y.环状RNA CircMTO1通过miR-92/WWOX信号通路抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。医学科学。莫尼特。2019;25：6454–6461。doi:10.12659/MSM.918676。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Chang X.miRNA、lncRNA和circRNA：糖尿病视网膜病变发展中充满治疗前景的靶向分子。正面。内分泌学。2021;12（洛桑）[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Min RQ.MicroRNA-381通过靶向LEF1抑制胶质母细胞瘤细胞的转移和上皮-间质转化。欧洲药理学评论。科学。2020;24(12):6825–6833. doi:10.26355/eurrev_202006_21672。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19S蔡。miR-124-3p通过靶向RhoG抑制多形性胶质母细胞瘤的生存能力和运动能力。国际分子医学杂志。2021;47(5):69. doi:10.3892/ijmm.2021。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20X夏。MicroRNA-1908通过抑制PTEN肿瘤抑制途径发挥胶质母细胞瘤癌基因的作用。摩尔癌症。2015;14：154.网址：10.1186/s12943-015-0423-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Legare S.、Chabot C.、Basik M.SPEN，乳腺癌中初级纤毛形成和细胞迁移的新参与者。乳腺癌研究。2017;19(1):104. doi:10.1186/s13058-017-0897-3。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Li Y.、Lv Y.、Cheng C.、Huang Y.，Yang L.、He J.、Tao X.、Hu Y.和Ma Y。细胞死亡疾病。2020;11(7):509. doi:10.1038/s41419-020-2699-2。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Monfort A.、Di Minin G.、Postlmayr A.、Freimann R.、Arieti F.、Thore S.、Wutz A.通过单倍体胚胎干细胞的正向遗传筛选，将SPEN确定为存在功能的关键因素。单元格代表。2015;12(4):554–561. doi:10.1016/j.celrep.2015.06.067。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
