新出现的用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的物理转染方法综述

DNA格式

DNA载体需要转录和翻译才能进行基因编辑。通常，人类的转录速率为每秒6-70个核苷酸，翻译速率约为每秒5个氨基酸^28,29DNA进入细胞核并被转录成gRNA和编码Cas9蛋白的mRNA。Cas9 mRNA被翻译成细胞质中的蛋白质，与gRNA结合，然后返回细胞核进行基因编辑。Cas9蛋白通常在转染后5小时内可检测到，24-48小时后达到峰值，有时需要数周才能恢复到基本水平³⁰。由于Cas9蛋白的半衰期较长，DNA格式更适合需要较长持续时间的实验。然而，Cas9基因的长时间表达也可能导致意外的靶外效应。此外，由于Cas9蛋白需要在细胞核中转录，质粒DNA可能会并入基因组。质粒DNA比下面讨论的mRNA或RNP格式大，这在某些转染方法中可能存在问题²³此外，质粒DNA需要gRNA和Cas9表达的兼容启动子。虽然其他格式的使用越来越频繁，但质粒DNA由于其稳定性和可扩展性尚未过时。此外，商业载体通常包括荧光生物标记物，可用于概念验证实验。

mRNA格式

mRNA格式不需要转录，而是在gRNA和Cas9定位到细胞核之前直接在细胞质中翻译。与质粒DNA相比，mRNA更具时间效率³¹Cas9核酸酶在转染后1小时表达，在5-7小时内达到峰值³⁰mRNA格式是需要较短持续时间的实验的首选，这也限制了离靶效应。

化学转染

化学转染使用化学载体，如脂质囊泡和基于聚合物的化学物质，将货物引入靶细胞⁴³化学载体作为一种运载工具，封装基因编辑质粒DNA和mRNA^44,45金纳米粒子、碳纳米管和石墨烯等无机结构在输送核酸方面也显示出良好的效果^46-48化学转染也能传递蛋白质和其他生物分子。赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）发布了一种基于脂质的化学转染试剂，该试剂经过优化，可输送Cas9 RNP复合物⁴⁹与病毒转导不同，当使用化学载体时，货物的大小通常不受关注。脂质包裹物通过内吞作用进入细胞。脂质囊泡有助于内吞，并保护货物免受细胞质中的酶降解。当使用脂质体感染时，货物只到达细胞质，这对需要到达细胞核才能发挥作用的货物（如质粒DNA）来说是不幸的。化学转染对免疫细胞和干细胞等难以转染的细胞通常无效。这些类型细胞的化学方法要么不能运送货物，要么导致细胞过度死亡^50-52最近，还报道了基于无载体化学物质的方法。达斯托尔福等。证明了渗透细胞增多症和丙氨酸甜菜碱（iTOP）诱导的转导用于将Cas9 RNP复合物有效传递到多种细胞中，包括小鼠胚胎神经干细胞和树突状细胞⁵³溶解技术利用含有乙醇的溶液作为渗透剂，将蛋白质和mRNA传递到间充质干细胞和Jurkat细胞中⁵⁴其他评论文章讨论了这类新的转染方法^55,56.

物理转染

物理转染不依赖载体的使用^57-59因此，与病毒载体不同，货物大小几乎没有限制，与化学载体不同，限速步骤不取决于细胞内吞作用。图​图11表明物理转染可以利用电、热和机械力的能量。施加的力会破坏细胞膜，使货物扩散到细胞内，在某些情况下，有助于货物本身的主动输送。例如，电穿孔用电场冲击细胞，导致膜穿孔和向带电货物（如质粒DNA）漂移力。

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图1

负责CRISPR转染的物理力。CRISPR/Cas9系统可以作为质粒DNA、mRNA或RNP传递。CRISPR传递的驱动力包括电场、声波、激光/热力和磁力等外场。直接的身体接触，如微量注射和传递收缩也可以介导CRISPR的传递。

尽管物理转染具有优势，但也有局限性。体内物理转染对人类应用来说仍然太具侵入性，尽管特殊情况需要进一步探索⁶⁰DNA疫苗的传递技术与基因编辑相同，已被物理转染体内用基因枪注射和电穿孔法将其注入小鼠体内^61-65DNA疫苗只需要皮内或肌肉内注射，这与许多基因治疗通常具有侵袭性的遗传病不同⁶⁶.对于基因编辑，体内电穿孔已经证明遗传物质可以进入小鼠的视网膜和表皮组织^67,68类似地，硅纳米针可以将编码血管内皮生长因子的质粒DNA传递到小鼠肌肉中，促进组织新生血管^69,70然而，由于其侵入性，体内转染通常涉及传递载体。

尽管CRISPR提供了治疗诸如肌营养不良和血友病等遗传疾病的解决方案^71,72，其体内政府提出了一些安全问题。CRISPR的有效性还伴随着脱靶效应，这些效应可能会导致不必要的突变。目前正在努力确保货物到达目标细胞并控制CRISPR的剂量体内.当体内基因编辑的临床应用可能在生物医学界引起激烈争论，在体外和体外基因编辑仍然是生物医学研究中不可替代的技术。

物理方法也有助于在体外输送到难转染细胞。许多重要的生物医学研究都要求难以转染原代细胞，如神经元、干细胞和免疫细胞。编辑这些单元格在体外是研究未知人类基因功能的有效方法⁷³.

除了在体外基因组编辑，物理转染优于体外应用⁷⁴.体外基因组编辑对于涉及细胞治疗的临床工作尤其有益。例如，癌症免疫治疗利用基因组编辑的T淋巴细胞识别和攻击肿瘤细胞。目前，有几个正在进行的临床试验使用体外依赖病毒转染进行基因改造的工程细胞。预计成本相当高，需要很长时间才能产生足够的细胞用于治疗。最近，通过物理转染工程化T细胞的临床试验表明，高通量基因组编辑可提高癌症免疫治疗的效率⁷⁵.徐等。报道了一个案例研究体外CRISPR编辑的通过电穿孔的干细胞治疗⁷⁶尽管患者体内的目标基因受到了轻微破坏，但编辑后的细胞仍能存活19个月以上，患者没有出现进一步的并发症。Stadtmauer的另一项研究等。报道了三例难治性癌症患者采用多重T细胞基因编辑进行细胞治疗的一期临床试验⁷⁷通过电穿孔，他们传递Cas9 RNP来破坏内源性T细胞受体（TCR）和程序性细胞死亡蛋白（PD-1）。患者T细胞也被慢病毒载体转导，以表达肿瘤特异性TCR，用于肿瘤靶向。所有患者的工程化T细胞在9个月内保持稳定。一名患者的肿瘤大小也显著减小。表​表44总结了最近完成的和正在进行的利用物理转染工程靶细胞的临床试验。

考虑到物理转染的好处在体外和体外应用，这里我们讨论了新的物理转染技术用于基因组编辑，该技术依赖于膜破坏和渗透。我们强调微型化和微/纳米技术在新兴的基因组编辑物理方法中的作用⁷⁸此外，我们还评估了该技术的编辑效率及其潜在缺陷。

机械转染

机械转染或机械转染使用机械力，如与固体结构的物理接触或来自周围流体的剪切力，在细胞膜中产生孔。这些小孔允许靶物质扩散到胞浆中。在一些技术中，如微量注射，含有目标物质的缓冲液直接注入细胞内空间。

微注射是机械转染的一个传统例子，其中基因通过微米大小的毛细管注入细胞^79,80使用微量注射将遗传物质直接注射到细胞核中，可实现快速基因表达。微注射适用于单细胞应用，如生殖系编辑。通过微量注射传递CRISPR加快了具有所需表型的模型生物的创建。通过将靶向肌肉生长抑制素编码基因和Cas9 mRNA的gRNA注射到绵羊合子的细胞液中，构建出肌肉生长抑制基因敲除的绵羊⁸¹微量注射CRISPR对包括沙蝇、斑马鱼、小鼠和猪在内的多种物种都有效^82-85虽然微注射效率很高，但它的吞吐量很低，需要一名经验丰富的技术人员仔细进行注射，以便细胞保持存活。

利用微纳米技术开发了用于基因编辑的机械穿孔平台。沙雷等。使细胞通过微加工硅收缩，为细胞内输送创造临时孔隙⁸⁶。将输送材料和细胞混合在一起，并流经微流体通道，如所示图​图22一收缩宽度通常约为电池直径的一半，而长度则在5至30µm之间变化。秦的研究小组使用由缩窄宽度为4µm的金刚石形聚二甲基硅氧烷（PDMS）柱制成的膜变形装置，证明了CRISPR进入哺乳动物细胞的过程(图​图22B类)⁸⁸在微流体装置内，细胞通过10个相同的收缩。根据这项研究，尖锐的收缩角度比圆形柱的弯曲收缩更好地保持细胞活力。此外，机械变形有效地将质粒DNA转染到传统上难以转染的细胞中，如淋巴瘤和干细胞。通过收缩使细胞传递增强的绿色荧光蛋白（EGFP）报告质粒至约30%和50%的SU-DHL-1淋巴瘤细胞和AB 2.2。小鼠胚胎干细胞。阳性对照FuGENE HD脂质转染试剂仅将EGFP质粒传递至约5%的SU-DHL-1细胞和10%的AB 2.2细胞。细胞。此外，机械转染AB 2.2。与对照组相比，干细胞的Oct4表达出现了不可察觉的变化，这表明该方法保留了细胞的干细胞。细胞膜变形法明显优于传统的化学转染法。

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图2

机械转染平台使细胞膜变形。答：。细胞挤压装置。经美国国家科学院院刊许可复制⁸⁶版权所有2013。B。硅制尖角收缩的工作流程示意图和SEM图像，比例尺：30µm。经牛津大学出版社许可复制⁸⁷版权所有2017。C、。细胞通过收缩物时变形的图像。经美国科学促进会许可复制⁸⁸抄送BY-NC 4.0。D。TRansmembrane Internalization Assisted by Membrane Filtering（TRIAMF）method for CRISPR转染的建立。经Springer Nature许可复制⁸⁹抄送4.0。

秦的研究小组还通过使用相同的微流体收缩平台将CRISPR传递给MDA-MB-231和SU-DHL-1细胞，成功地敲除了EGFP⁸⁸Cas9质粒和单一gRNA靶向EGFP的传递导致约90%的MDA-MB-231细胞和约70%的SU-DHL-1细胞中EGFP被敲除。然而，细胞通过设备三次，以提高输送效率，这可能会降低细胞活力（<50%）。此外，该研究没有评估缓冲液中的质粒浓度、产量、细胞损失或细胞浓度。

除了质粒DNA传递外，膜变形技术还可以传递RNP复合物。韩寒的研究等。评估RNP浓度对编辑效率的影响⁹⁰用靶向EGFP序列的RNP机械转染EGFP表达的SK-BR-3细胞。数据显示，RNP浓度的增加与编辑效率呈正相关，编辑效率在2µM RNP时达到最大敲除效率。为了确定该平台的适用性，将靶向p38丝裂原活化蛋白激酶的RNP递送到人类乳腺癌细胞（MDA-MB-231和SUM-159）中和原始人类T细胞。这些细胞的编辑效率（定义为突变频率）分别为43%、47%和33%。该研究还比较了CRISPR编码质粒和RNP的编辑性能。两种格式的索引率相似，约为40%。然而，非靶向突变率不同：质粒转染导致4.7%的突变率，而RNP转染仅占0.8%。

机械转染已成功用于CRISPR传递难以转染的细胞，如干细胞和免疫细胞，这些细胞通常用于体外细胞疗法^87,89-91.图​图22C类描述了一种2µm锐角收缩装置，用于转染人类造血干细胞（HSC）。RNP构建物旨在靶向C/EBPα基因，该基因与急性髓细胞白血病有关⁸⁷尽管未明确量化，但western blot分析显示2µM RNP显著抑制基因表达。转染HSC的另一种方法是使细胞流经膜过滤器，如图​图22D类 ⁸⁹。尽管这可能随细胞大小而变化，但用于细胞内输送的最有效膜过滤器的厚度为7µm，孔径为8µm。用CRISPR RNP转染干细胞，敲除尿液中的β2-微球蛋白标记物，以治疗血液疾病，如β地中海贫血和镰状细胞病。CRISPR RNP的最佳浓度为25µM，高达63%的细胞经过这种处理。对于免疫细胞转染，应用膜变形传递靶向T细胞活性负调节因子PD-1基因的CRISPR RNP复合物。在一项研究中，向T细胞输送2µM RNP复合物，实现35%PD-1表面表达敲除，36%细胞发生检测突变⁹⁰用细胞挤压平台证明了PD-1敲除的类似结果⁹¹在人类T细胞中使用100µg/mL（~0.625µM）RNP复合物和2 gRNAs对抗PD-1时，编辑效率最高可达55%。

电穿孔

利用电场刺激哺乳动物细胞，被称为电穿孔，可以有效地将核酸转移到细胞中⁹⁶应用电场将基因转移到细胞中的过程很复杂⁹⁷直接观察表明，电压升高会在细胞膜上造成不稳定性和小孔，小分子通过这些孔扩散⁹⁸对于质粒DNA电穿孔，DNA与细胞膜聚集并激活内吞作用⁹⁹引入的分子类型、施加的电压量、电脉冲的长度、缓冲溶液和使用的细胞类型是产生细胞膜可逆渗透性和有效货物输送的重要参数。

与脂质体转染一样，电穿孔由于其简单有效，是目前最具商业价值的基因转染方法之一。研究人员通常选择电穿孔，因为它对免疫细胞和干细胞等细胞更有效。然而，由于过热、pH值变化和离子失衡，一些电穿孔细胞可能会失去生存能力。运送的货物也会影响细胞健康。与小质粒相比，大质粒降低细胞活力¹⁰⁰此外，转染过程中使用的缓冲液会影响细胞活力。用于电穿孔的标准缓冲液，如磷酸盐缓冲盐（PBS）或Hank’s平衡盐溶液，可能会导致严重的细胞死亡¹⁰¹针对这一问题，制造商开发了昂贵的优化电穿孔缓冲液。一种优化的电穿孔缓冲液可以保持细胞活力，尽管它本身会导致一些细胞死亡⁸⁹.长时间接触另一种缓冲液会降低转染效率¹⁰²将电穿孔T细胞暴露于BioTechnology eXperimal Research缓冲液（BTX）中15分钟，mRNA转染效率降低20%。暴露于BTX缓冲液一小时可将转染效率降低至70%。不管它的许多问题如何，电穿孔对于转染通常难以转染的细胞是有用的。

电穿孔已将CRISPR系统应用于多种类型的细胞，并取得了不同程度的成功^103,104大量电穿孔可以以质粒、mRNA和RNP的形式传递CRISPR系统，用于靶序列的敲除和敲除^105-108多序列敲除也通过传递两个以上带有Cas9蛋白的gRNAs被证明¹⁰⁹CRISPR RNP复合体相对于质粒或mRNA更容易电穿孔，可能是因为它体积小、易于传递，并且基因编辑速度更快。使用常规电穿孔优化CRISPR RNP可以破坏原代T细胞中98%的靶基因¹¹⁰.

新的电穿孔工具能够创造性地应用CRISPR转染。3Dμ-电转染系统将3D打印与微流体相结合，用于转染就地HEK 293细胞在3D微环境中培养(图​图3三一)⁹²培养细胞的支架由肽水凝胶基质组成。尽管使用了高浓度的CRISPR/Cas9质粒（200μg/mL），但由于质粒尺寸大，多孔水凝胶中的分子传输有限，这限制了转染效率。类似就地在多孔2D细胞培养系统中证明了使用电穿孔的CRISPR转染（参见图​图3三B类)，尽管转染效率没有量化⁹³.

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图3

新型电穿孔转染平台。答：。三维微流体电穿孔系统示意图。根据参考文献复制。⁹²经皇家化学学会许可。B。设计用于就地电穿孔微系统。经Springer Nature许可复制⁹³抄送4.0。C、。试管电穿孔用试管设计。经Springer Nature许可复制⁹⁴抄送4.0。D。纳米结构电穿孔系统（左）和相应的mRNA转染效率显示出比脂质转染（右）更高的均匀性（红色）。经美国科学促进会许可复制⁹⁵抄送BY-NC 4.0。

常规电穿孔通常会导致比色皿内的电场分布不均匀和气泡。为了应对这一挑战，徐等。通过加入电极对试管进行改进，以确保管形试管内没有液体/空气界面，图​图3三C类 ⁹⁴使用这种电穿孔管，连同0.5μM Cas9 RNP和0.85μM gRNA，在人类间充质干细胞、人类诱导的多能干细胞和人类原代T细胞中引入了高达90%的点突变。

微型化和纳米技术为解决传统电穿孔的缺点提供了切实可行的解决方案。加入纳米结构，例如纳米通道或纳米轨道，可以增强局部电场，从而降低工作电压并防止气泡的形成^95,111,112空间和剂量控制也可根据所用电极的类型和施加的电压进行调节。使用纳米颗粒电穿孔平台(图​图3三D类)，曹等。证明85%的mRNA转染效率和90%以上的细胞存活率⁹⁵与脂质体转染相比，该设备转染的mRNA更加均匀，如所示图​图3三D类纳米电穿孔装置将针对人类管家PPIB基因的gRNA和10µM GFP标记的Cas9蛋白引入HEK 293细胞。90%的细胞内化了GFP信号所确定的RNP复合物。同时，根据T7E1分析和Sanger测序，编辑效率分别为31%和33%。

在纳米电穿孔平台中，细胞和微/纳米结构之间的紧密界面是局部场增强发挥作用所必需的。使用光镊或介电泳效应对细胞进行空间控制有助于确保这一要求^112,113除了物理控制细胞位置外，纳米结构还可以涂上聚合物或蛋白质，以提高细胞粘附力¹⁰¹增加这些粘附分子的浓度会增加细胞粘附的强度。然而，如果浓度过高，则当施加电压时，由于细胞和表面之间的粘附力，细胞活力将降低。因此，必须优化粘附分子的浓度，以便在表面和细胞膜之间产生足够的吸引力，而不会导致过度细胞损伤。

为了创造微观和纳米结构，研究人员依赖于一种昂贵的基于光刻的方法。为了解决这个问题，曹等。开发了一种商用且价格合理的由水过滤膜制成的纳米孔电穿孔装置¹⁰¹使用该设备导致约25%的HeLa和Jurkat细胞的基因编辑，其中10µM RNP与看家基因PPIB相对应。在细胞培养基中转染后的细胞存活率约为95%。相比之下，使用PBS或细胞培养基作为缓冲液的体电穿孔导致细胞存活率低于55%。同时，通过脂质体感染，HeLa的细胞存活率下降到50%。

声学

声穿孔是一种利用声波使细胞膜瞬时渗透的方法¹¹⁴(图​图44). 声波阻碍细胞膜的机理类似于空化气泡的形成；具体来说，通过诱导冲击波和周围液体介质的流动^115,116通常，将微气泡引入介质中可以提高膜穿孔效率。在声场下，气泡根据压力膨胀或收缩。气泡在高压下破裂，产生冲击波。微泡和声穿孔的结合可以降低高效转染所需的声压¹¹⁷.

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图4

细胞转染的声学方法。

利用微泡的支持作用，超声波转染编码Cas9和gRNA的质粒，敲除人子宫内膜癌（HEC）-1A细胞中的c-erbB2¹¹⁸将微泡悬浮液与10µg质粒混合，并加入细胞培养基中。转染后，C-erbB-2 mRNA表达下降至57%。

在没有微气泡的情况下，声波会在细胞外环境中产生强烈的流动，从而形成孔隙。将10 MHz的声表面波（SAW）应用于细胞以增强分子吸收¹¹⁹。与SAW不同，该频率的体声波会产生空化。使用SAW，HeLa细胞对siRNA-liposome复合物的转染效率为40%。同时，在没有SAW暴露的情况下，与siRNA-liposome复合物混合的细胞仅实现了20%的内化。在另一项研究中，超声级的更高频率导致细胞膜穿孔。开发了一种纳米机电谐振器，以产生1.6 GHz的声波，产生约200 nm的膜孔¹²⁰.

通过应用于HeLa和HEK 293细胞的高频体声波（150 MHz频率）证明了通过超声穿孔传递CRISPR质粒¹²¹该声转染系统引入了pCas9质粒，传递效率高达40%。转染效率取决于质粒大小和质粒浓度。高频超声换能器也可以敲入靶基因，尽管本研究中没有量化编辑效率。

磁传导

磁场诱导的细胞内传递，称为磁转染或磁感染，可在有或无磁性粒子的协助下发生¹²²高磁场脉冲使细胞膜渗透，主要是由于电磁加热^123-125.产生强磁场也会在目标样品体上产生电场。这种非接触强磁场对细胞渗透性的作用机制尚不清楚。目前，高磁场脉冲的透磁效率较低。

相反，当暴露于磁场中时，利用与靶分子结合的磁性纳米粒子可增强细胞内传递到靶细胞的能力¹²²商业磁感染试剂盒包含带正电荷的球形磁性纳米粒子，以便于与核酸形成复合物。最近，一种被称为纳米梨的锋利磁性粒子被开发出来，用于输送具有高空间分辨率的质粒¹²⁶.外部磁场将纳米梨精确引导至单细胞靶。

CRISPR使用磁性纳米粒子进行了传递。针对猪成纤维细胞H11位点编码Cas9和gRNA的质粒与聚乙烯亚胺包裹的磁性粒子结合¹²⁷在不同质粒浓度下，对猪胎儿成纤维细胞进行磁感应作用。当质粒浓度为375 ng/mL和750 ng/mL时，磁感染的编辑效率（量化为indel频率）分别为15%和27%。当质粒浓度增加对应较高的转染率时，质粒内化增加会显著降低细胞活力至40%。使用脂质体感染时，高质粒浓度也会导致细胞存活率下降。

磁力也有利于按需控制磁感染。在在体外模型表明，用磁场刺激磁性纳米颗粒可以促进颗粒在血脑屏障上的迁移¹²⁸通过血脑屏障后，通过交替磁场触发释放CRISPR质粒。体内通过将杆状病毒载体与磁性纳米粒子结合，证明了对磁感染的控制¹²⁹杆状病毒载体编码Cas9和gRNA，以击倒负责细胞增殖的Vegfr2基因。最初的测试是使用磁感应进行的在体外编辑小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6细胞中的Vegfr2。结果表明，磁性颗粒可诱导细胞内快速摄取，从而防止杆状病毒载体被免疫系统灭活。该技术能够以高达30%的效率切割Vegfr2基因。以下在体外测试，体内通过静脉注射颗粒-DNA复合物进行评估。肿瘤部位附近的磁场刺激鼓励磁性纳米粒子聚集，从而增加肿瘤细胞对质粒的内化。转染后，收集含有EGFP报告子的基因编辑细胞。这些单元格以30%的效率被成功编辑。此外，该系统成功地编辑了目标肿瘤细胞，最大indel率为4.7%。

我们感谢Nakul Sridhar对手稿的批判性阅读。作者通过科罗拉多大学博尔德分校的创业基金和研究与创新种子基金表示感谢。