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国际J抗菌剂。2020年5月；55(5): 105960.
2020年4月3日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.ijantimicag.2020.105960
预防性维修识别码：项目管理委员会7128678
PMID：32251731

结构和分子模型研究揭示了氯喹和羟基氯喹对抗SARS-CoV-2感染的新作用机制

雅克·范蒂尼，a、，b、，⁎ 科拉利·迪斯卡拉，c（c） 亨利·查希尼安，a、，b条和努瓦拉·亚希a、，b条
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

集锦

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    SARS‐CoV‐2引发的新冠肺炎疫情引发了全球卫生紧急情况。
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    有希望的结果表明，氯喹可以阻止SARS‐CoV‐2的传播。
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    硅内研究证实了氯喹的抗病毒特性。
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    阐明了氯喹的新作用机制。
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    羟基氯喹比氯喹更有效。

关键词：冠状病毒、大流行、SARS-CoV-2、神经节苷脂、穗蛋白、氯喹

摘要

最近出现的新型致病性SARS-冠状病毒2（SARS-CoV-2）是导致全球大流行的原因。鉴于全球卫生紧急情况，药物重新定位是毫不拖延地为感染患者设计有效治疗的最可靠选择。病毒复制周期的第一步[即通过尖峰（S）病毒蛋白介导附着在呼吸细胞表面]提供了几个潜在的治疗靶点。S蛋白使用血管紧张素转换酶-2（ACE-2）受体进入，也使用与宿主细胞表面神经节苷脂相关的唾液酸。采用结构和分子模拟相结合的方法，本研究表明，氯喹（CLQ）是目前正在研究的SARS-CoV-2治疗药物之一，与唾液酸和神经节苷脂具有高亲和力。在SARS-CoV-2 S蛋白N末端结构域的尖端发现了一种新型神经节苷脂结合域。该结构域（111–158）在世界各地的临床分离株中完全保守，可以改善病毒对脂筏的附着，并促进与ACE-2受体的接触。该研究表明，在存在CLQ[或其更活性的衍生物羟基氯喹（CLQ-OH）]的情况下，病毒S蛋白不再能够结合神经节苷脂。CLQ和CLQ-OH这种新作用机制的确定支持使用这些重新定位的药物治疗SARS-CoV-2感染患者。本研究中使用的电子方法也可用于在临床评估之前评估广泛的重新定位和/或创新候选药物的效率。

关键词：冠状病毒、大流行、SARS-CoV-2、神经节苷脂、穗蛋白、氯喹

1 介绍

最近出现的新型致病性SARS-冠状病毒2（SARS-CoV-2）导致了全球大流行[1]，并且迫切需要鉴定活性抗病毒药物。鉴于全球卫生紧急情况，药物重新定位是为感染患者设计有效治疗的最可靠选择[2，3]一些药物已经过测试，其中氯喹（CLQ）是一种著名的抗疟药物，是最有希望的药物之一，因为在最近的临床研究中，氯喹在治疗新冠肺炎相关肺炎方面显示出明显的疗效[4]然而，CLQ对SARS-CoV-2的作用机制尚不清楚，因为该药物似乎具有广泛的潜在抗病毒作用[5]因此，尽管CLQ被经典地认为是通过提高内吞体pH值来抑制内吞途径[6]，其作为抗病毒化合物的详细分子作用机制尚不清楚[3，5]有趣的是，CLQ已被证明干扰血管紧张素转换酶-2（ACE-2）的末端糖基化[7]作为SARS-CoV的质膜受体[8]和SARS-CoV-2[9]CLQ可以在冠状病毒复制周期的几个步骤中发挥作用[7]这些数据表明，CLQ可以通过直接作用于宿主细胞表面分子来阻止病毒粘附，这是一种有趣且尚未探索的可能性。

人类冠状病毒的一个重要特征是，除了其蛋白膜受体外，它们还依赖于唾液酸糖蛋白和神经节苷脂，它们是呼吸道的主要附着因子[10].本研究结合了结构和分子建模方法[11]研究CLQ与唾液酸之间的潜在相互作用。在SARS-CoV-2棘突（S）糖蛋白的N末端结构域（NTD）中发现了神经节苷脂结合位点，并且CLQ被证明是病毒复制周期第一步发生的S–神经节苷酯相互作用的潜在阻断剂（即通过S蛋白介导附着到呼吸细胞表面）。此外，比较了CLQ及其衍生物羟基氯喹（CLQ-OH）对SARS-CoV-2的抗病毒潜力。总的来说，这项研究发现CLQ和CLQ-OH可能用于对抗致病性人类冠状病毒[3]，[4]，[5]，[6]，包括SARS-CoV-2[12].

2 材料和方法

如前所述，使用Hyperchem和Molegro Molecular查看器进行硅酸铟分析[11，13，14]GM1的初始坐标由CHARMM-GUI糖脂建模器获得(http://www.charmmgui.org/？doc=input/glycolipid网站;[15])它利用常见糖苷扭转角值的内部坐标信息，使神经节苷脂垂直于膜，并利用圆柱约束势执行朗之万动力学，以保持整个GM1分子，尤其是膜包埋神经酰胺部分呈圆柱状。在下一步中，神经节苷脂被放入一个含有1128个水分子的周期性溶剂盒中。该系统进行了六次能量最小化，在使用最陡下降梯度的运行和使用Polak–Ribière共轭梯度的运行之间切换，直到收敛到机器精度。随后，神经节苷脂与从pdb文件#6VSB获得的SARS-CoV-2 S蛋白的NTD结构域合并[16]初始条件对应于使用Polak–Ribière算法获得的最小化结构。随后，使用针对碳水化合物优化的CHARMM36力场将对接配合物提交到分子动力学的迭代循环中[17].使用Molegro的配体能量检查器功能从稳定络合物计算相互作用能量[13].

N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）由Hyperchem数据库生成。9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸（9-O-SIA）从pdb文件6Q06中检索[18]CLQ是N-（7-氯喹啉-4-基）-N，N-二乙基戊烷-1,4-二胺。它的三维anl结构是从pdb文件#4V2O中检索到的[19]CLQ-OH是（RS）-2-[{4-[（7-氯喹啉-4-基）氨基]戊基}（乙基）氨基]乙醇。CLQ-OH通过CLQ与Hyperchem的羟基化生成。CLQ和CLQ-OH都被能量最小化，并与水分子合并，如下所述。

三。 结果

3.1. 水中CLQ和CLQ-OH的结构和构象分析

CLQ和CLQ-OH的化学结构如所示图1（a、b）。这两个分子之间的唯一区别是CLQ-OH中存在末端羟基。该OH基团对药物的构象和水溶性有显著影响。CLQ-OH可以采用多种构象，最稳定的构象是图1（c） ●●●●。当浸入31.5°的周期箱中时2用1042个水分子，系统在平衡状态下达到了估计的相互作用能-92 kJ.mol−1，其中56个水分子溶解CLQ-OH图1（d） ●●●●。相反，由于分子内疏水作用，CLQ似乎比CLQ-OH更浓缩图1（e） ●●●●。在平衡状态下，CLQ被58个相互作用能为-79 kJ.mol的水分子包围−1 图1（f） 。

图1

氯喹和羟基氯喹的化学结构。（a） CLQ公司。（b） CLQ-OH公司。（c） CLQ-OH扩展构象。（d） 水中的CLQ-OH。（e） CLQ的典型缩合构象。（f） 水中CLQ。（c–f）中的分子以管状或球形呈现（碳，绿色；氮，蓝色；氧，红色；氢，白色）。在（c）和（e）中，CLQ和CLQ-OH的氯原子用箭头表示。

这些CLQ和CLQ-OH的水溶性构象被用作研究这些药物与唾液酸和神经节苷脂相互作用的初始条件。

3.2. 唾液酸作为CLQ和CLQ-OH的分子靶点

Neu5Ac是在人类糖蛋白和神经节苷脂中发现的主要唾液酸。当CLQ与Neu5Ac合并时，两个分子之间发生准瞬时拟合，这两个分子在水中的整体形状是几何互补的图2（a） ●●●●。这在CLQ–Neu5Ac复合体的混合表面/球和杆表现中尤为明显图2（a、b）。这种相互作用是由Neu5Ac羧酸基团的负电荷和CLQ的两个阳离子电荷之一（pKa 10.2）的定位驱动的图2（c） ●●●●。该配合物的相互作用能估计为-47 kJ.mol−1冠状病毒优先与9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸（9-O-SIA）相互作用[10]这项研究使用了类似的分子模型方法来评估CLQ是否也能与这种特定唾液酸相互作用。CLQ和9-O-SIA之间获得了良好的拟合图2（d–f），相互作用能为-45 kJ.mol−1在这种情况下，唾液酸的羧酸基团与CLQ含氮环的阳离子基团相互作用（pKa 8.1）图2（d） ●●●●。通过OH-π和范德瓦尔斯相互作用进一步稳定了配合物。

图2

氯喹（CLQ）与唾液酸相互作用的分子模拟。（a，b）CLQ–唾液酸（Neu5Ac）复合物的表面表征。图中显示了该建筑群的两个相反视图。注意溶解在水中的CLQ的L形构象（蓝色）和Neu5Ac（红色）之间的几何互补性。（c） Neu5Ac通过CH-π和与CLQ（+）的一个阳离子基团的静电相互作用的组合与CLQ结合。（d） CLQ与N-乙酰基-9-O-乙酰基神经氨酸（9-O-SIA）结合的分子模型。从右到左，虚线表示一系列范德瓦尔斯、OH-π和与CLQ（+）的两个阳离子基团的静电接触。（e，f）CLQ–9-O-SIA复合体的表面表示。

接下来，对CLQ-OH进行测试，以评估其是否可以作为CLQ与9-O-SIA结合(图3). 使用CLQ-OH获得的络合物与使用CLQ获得的络合物非常相似[比较图3（a、b）与图2（e，f），尽管在模拟过程中发生了一些构象调整。有趣的是，CLQ-OH的OH基团通过氢键的建立加强了CLQ与唾液酸的结合图3（c、d）。总的来说，这种氢键补偿了构象重排引起的轻微能量损失，络合物的相互作用能量估计为-46 kJ.mol−1，非常接近CLQ的值（-45 kJ.mol−1).

图3

羟基氯喹（CLQ-OH）与唾液酸相互作用的分子模型。（a，b）与N-乙酰基-9-O-乙酰基神经氨酸（9-O-SIA）结合的CLQ-OH的表面表征。图中显示了该建筑群的两个相反视图。注意CLQ-OH（蓝色）和9-O-SIA（红色）之间的几何互补性。（c，d）CLQ-OH与9-O-SIA结合的分子机制：静电相互作用和氢键的结合。

3.3. 神经节苷脂的CLQ和CLQ-OH分子识别

在呼吸道中，唾液酸通常是糖蛋白和神经节苷脂的一部分。分子模拟方法用于评估CLQ和CLQ-OH是否能够识别其自然分子环境中的唾液酸单元。在这些模拟中，神经节苷脂GM1被选为人类质膜神经节苷酯的代表性示例。使用CLQ进行了第一系列模拟。当与神经节苷脂融合时，CLQ有两个不同的结合位点，均位于GM1的极性糖部分。第一个位点位于神经节苷脂糖类部分的顶端图4（a、b）。相互作用能估计为-47 kJ.mol−1CLQ保留了与分离唾液酸结合的水溶性构象的典型L形结构[比较图2（c） 和​和4（a）]。4（a） ]。从机械角度来看，GM1唾液酸的羧酸基团朝向CLQ的阳离子基团。CLQ环面对GM1的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）残基，建立OH-π相互作用和氢键图4（b） ●●●●。第二个位点位于一个较大的区域，包括神经酰胺-糖连接和糖部分图4（c） ●●●●。CLQ的氯原子朝向神经酰胺轴，使CLQ的含氮环堆积在第一糖残基的吡喃环上[即葡萄糖（Glc）]。两个伙伴的完美几何互补图4在这种情况下，（c，d）的相互作用能量特别高（-61 kJ.mol−1). 有趣的是，GM1上的两个CLQ结合位点之间没有重叠，因此神经节苷脂可以容纳两个CLQ-分子图4（e） ，达到-108 kJ.mol的全球相互作用能量−1CLQ-OH也出现了类似的情况，它与CLQ具有相同的结合位点图4（f） ●●●●。在这种情况下，通过稳定两个CLQ-OH分子之间建立的接触，相互作用的能量进一步增加，达到-120 kJ.mol−1总的来说，这些数据表明CLQ和CLQ-OH非常适合唾液酸，无论是分离的还是与神经节苷脂结合的唾液酸。

图4

氯喹（CLQ）和羟氯喹（CLQ-OH）与神经节苷脂GM1结合的分子模型模拟。GM1的表面静电电位表示对应神经酰胺的非极性膜包埋部分（白色区域），以及对应唾液酸糖类部分（红色区域）的胞外空间中突出的酸性部分。（a） CLQ结合到GM1的碳水化合物部分的顶端。（b） CLQ与神经节苷脂相互作用的分子机制。（c） 分子动力学模拟揭示了第二个相互作用位点。在这种情况下，CLQ的芳香环位于神经酰胺-糖结合处，而氮原子与神经节苷脂的酸性部分相互作用（未图示）。（d，e）GM1与一个（d）或两个（e）CLQ分子络合的表面视图（均为蓝色），说明GM1和CLQ分子的几何互补性。（f） 一个GM1分子也可以同时容纳两个不同的CLQ-OH分子，在轻微的重排后，由于CLQ-OH/CLQ-OH相互作用，使拟合度增加。为了提高清晰度，结合到GM1的CLQ-OH分子用两种不同的颜色表示（蓝色和绿色）。

3.4. SARS-CoV-2 S蛋白NTD的结构分析

本研究的下一步是确定SARS-CoV-2如何与质膜神经节苷脂相互作用，以及这种相互作用是否会受到CLQ和CLQ-OH的影响。SARS-CoV-2 S蛋白的整体结构[16]如所示图5（a–d）。它由一个三聚体的S蛋白组成，每个蛋白都含有两个远离病毒包膜的不同区域：受体结合区（RBD）和NTD。

图5

SARS-CoV-2棘（S）蛋白的结构特征。（a） 三元结构（每个S蛋白具有不同的表面颜色，即“蓝色”、“黄色”和“紫色”）。（b） 三聚体中“蓝色”S蛋白的带状表示（α-螺旋，红色；β-链，蓝色；线圈，灰色）。（c） 从三聚体中分离出的“蓝色”S蛋白的表面结构。（d） “蓝色”S蛋白的带状结构。（e） 放大“蓝色”S蛋白的N末端结构域（NTD）。（f，g）使用Hyperchem获得的最小NTD的分子模型[（f）中的带状表示，（g）中的表面渲染]。（h） 强调NTD的氨基酸残基可能属于潜在的神经节苷脂结合域。

据推断，如果RBD与ACE-2受体发生功能性相互作用，那么在S糖蛋白的其他细胞可进入域（即NTD）上寻找潜在的神经节苷脂结合位点将是一件有趣的事情。NTD含有大约290个氨基酸残基。NTD的尖端特别有趣，因为它显示了一个平面界面图5（f） 理想的定位是靶向富含神经节苷脂的质膜微域，如脂筏。

对位于NTD尖端的平面界面的氨基酸序列进行分析，以确定是否存在共有神经节苷脂结合域[20]这些基序由三个必需氨基酸残基组成，例如（K，R）-Xn个-（F、Y、W）-Xn个-（K，R）。X轴n个插入片段，通常是四到五个残基，可能包含任何氨基酸，但通常是Gly、Pro和/或Ser残基。该算法的严格应用不允许在NTD的这个区域检测到任何潜在的神经节苷脂结合域。然而，在129–158片段中发现芳香族和碱性残基的有趣过度表达：129-KVCE公司F类问F类全国保卫人民大会F类LGV公司年H（H）KNN公司KS公司W公司MESE公司法国-158.这段30个氨基酸还含有Gly、Pro和/或Ser残基，这些残基通常存在于神经节苷脂结合基序中。这些观察结果支持了NTD尖端可以显示大的神经节苷脂附着界面的观点。

3.5. 神经节苷脂与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型S蛋白NTD的分子相互作用

包含NTD氨基酸残基100–175的结构基序的分子动力学模拟图5（f–h）与神经节苷脂GM1融合进一步支持了这一概念。如所示图6，该结构域的大平面区域与神经节苷脂突出的寡糖部分非常吻合。一些氨基酸残基似乎对这种相互作用至关重要，尤其是Phe-135、Asn-137和Arg-158(表1). 总的来说，该复合物涉及10个氨基酸残基，总相互作用能为-100 kJ.mol−1在这一阶段，观察到大约50%的界面参与了复合物，剩下的50%可用于与第二个GM1分子的相互作用。正如预期的那样，将第二个GM1分子与预先形成的GM1–NTD复合物合并，形成了一个由两个神经节苷脂组成的三分子复合物，呈典型的对称杯状结构，NTD可以将其界面神经节苷苷脂结合域插入其中(图7). 这种三分子复合物的形成是渐进的，首先是由第二个GM1分子触发的第一个神经节苷脂-NTD复合物的构象重排。新络合物的相互作用能持续增加37%，达到-137 kJ.mol的估计值−1在这一阶段，NTD与富含神经节苷脂的微结构域的连接涉及整个界面（即15个从Asp-111到Ser-162的表面可接触残基）。关键残基为Asp-111、Gln-134、Phe-135、Arg-158和Ser-161(表1).

图6

SARS-CoV-2棘突蛋白N末端结构域（NTD）与单个GM1神经节苷脂之间的分子复合物。NTD表示为与透明表面渲染（浅绿色）重叠的色带。复合体的两个对称视图如（a，b）所示。位于神经节苷脂结合域中心的氨基酸残基Q-134至D-138表示为绿色球体。神经节苷脂的糖类部分形成NTD尖端的降落面。

表1

与GM1分子接触的SARS‐CoV‐2刺突蛋白的每个氨基酸残基的相互作用能量。

氨基酸残基相互作用能（kJ.mol‐1）
第一步：一个GM1分子
阿斯普‐111−5.6
赖氨酸‐113−8.2
Gln‐134号−8.6
苯丙氨酸-135−20.1
赛斯-136−7.0
Asn‐137号−15.2
阿斯普‐138−6.4
阿根廷‐158−17.4
序列号161−9.7
序列号‐162−2.0
总计−100.2
第二步：两个GM1分子
阿斯普‐111−15.8
序列号-112−10.7
赖氨酸‐113−9.2
Gln‐134号−11.2
苯丙氨酸-135−10.5
赛斯-136−6.2
Asn‐137号−4.7
苯丙氨酸-140−5.2
Gly‐142号−5.6
葡‐156−9.0
苯丙氨酸-157−13.8
阿根廷‐158−19.8
泰尔-160−3.2
161系列−9.7
序列号‐162−2.0
总计−136.6磅
图7

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型刺突蛋白N末端结构域（NTD）和GM1二聚体之间的分子复合物。在（a）、（c）和（d）中，NTD表示为图4在（b）中，显示的NTD表面没有任何透明度。属于神经节苷脂结合域（GBD）的氨基酸残基Q-134至S-162表示为绿色球体。与单个GM1分子相比，神经节苷脂二聚体为NTD形成更大的吸引表面。在上述（d）观点中，NTD与神经节苷脂的锚定作用尤为明显。由于氯喹也与GM1的糖类部分相互作用，它的存在将明显掩盖NTD的大部分登陆表面，防止病毒附着在宿主细胞的质膜上。

3.6. SARS-CoV-2与宿主细胞质膜的潜在协同作用：神经节苷脂在脂筏中的关键作用

综上所述，这些数据强烈支持SARS-CoV-2双受体/附着模型的概念，RBD结构域参与ACE-2受体识别，NTD界面负责在细胞表面发现富含神经节苷脂的着陆区（脂筏）。

这种双受体模型与SARS-CoV-2 S蛋白的拓扑结构一致，在图8考虑到这个模型，我们研究了CLQ和CLQ-OH的潜在作用，根据分子模型数据，这两种药物对唾液酸和神经节苷脂都有很高的亲和力。

图8

SARS-CoV-2棘突蛋白对神经节苷脂和血管紧张素转换酶-2（ACE-2）的双重识别。病毒蛋白显示两个不同的结构域，其尖端可用于不同类型的相互作用。受体结合域与ACE-2受体结合，N末端结构域（NTD）与质膜富含神经节苷脂的结构域结合。脂筏是富含神经节苷脂（黄色）和胆固醇（蓝色）的膜域，为在感染过程的第一步充分定位病毒S蛋白提供了一个完美诱人的界面。这些结构和分子模型研究表明，NTD的氨基酸残基111–162形成一个功能性神经节苷脂结合域，氯喹和羟基氯喹可以有效阻止其与脂筏的相互作用。

3.7. CLQ和CLQ-OH抗病毒作用的分子机制：阻止SARS-CoV-2 S蛋白进入细胞表面神经节苷脂

为了确定CLQ和CLQ-OH是否可以防止严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2与质膜神经节苷脂的粘附，将最初的NTD–GM1复合物与药物–GM1复合物叠加(图9). 为了提高清晰度，神经节苷脂在图9这种叠加表明，NTD和药物（本例中为CLQ-OH）与GM1结合时共享相同的空间位置，因此GM1不能同时结合病毒蛋白和药物。这是因为NTD和药物（CLQ和CLQ-OH）与GM1结合的机制类似，由二元功能相互作用控制：氢键和几何完美的CH-π堆积相互作用。在NTD的情况下，氢键涉及Asn-167，而CH-π堆积由Phe-135的芳香环介导图6（b） ●●●●。一方面，Asn-167与GM1的GalNAc残基建立了氢键网络。另一方面，Phe-135的扁平芳香环堆积在GM1的Glc残基的循环上。在CLQ和CLQ-OH的情况下，药物的含氮环堆积在Glc环上图4（c） ●●●●。注意，Phe-135（红色）和CLQ-OH（绿色）环位于相同位置(图9). 另一个CLQ-OH分子覆盖神经节苷脂糖部分的尖端，与GalNAc神经节苷酯相互作用图4（b） ●●●●。当NTD与神经节苷脂结合时，Asn-137的侧链就位于这个确切的位置(图9). 因此，一旦两个CLQ-OH（或两个CLQ）分子与神经节苷脂结合图4（e，f），完全阻止SARS-Cov-2 S蛋白与同一神经节苷脂的任何结合。克服这种空间位阻不相容性所需的能量估计为几百kJ.mol−1，这太高了，无法发生。

图9

羟基氯喹（CLQ-OH）的作用机制。与GM1结合的N末端结构域（NTD）与两个CLQ-OH分子相互作用叠加在GM1上。模型仅显示NTD和两个CLQ-OH分子（而不是GM1，以提高清晰度）。（a，b）堆积在GM1葡萄糖循环上的F-135芳香环（红色）与同样通过CH-π堆积机制与GM1结合的芳香CLQ-OH环（绿色）重叠。NTD的N-137残基与GM1的N-乙酰氨基半乳糖残基相互作用，但这种相互作用在CLQ-OH存在下不会发生，因为GM1的这一部分完全被药物掩盖。（c，d）NTD表面（紫色）与结合到GM1的两个CLQ-OH分子的叠加，说明当两个CLQ-OH分子已经与神经节苷脂相互作用时，阻止NTD结合到GM1的空间不可能。

3.8. 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型和相关冠状病毒的序列比对分析：关键氨基酸残基神经节苷脂结合结构域的进化

由于CLQ和CLQ-OH是SARS-CoV-2感染的潜在治疗方法，因此重要的是检查被确定为对神经节苷脂结合至关重要的氨基酸残基在临床分离物中是否保守。来自不同地理来源（包括亚洲和美国）的11株SARS-CoV-2临床分离株的111–162结构域的比对如所示图10该区域包含本报告中确定的神经节苷脂结合域，所有氨基酸都是完全保守的。有趣的是，该基序构建得像一个巨大的共有神经节苷脂结合域：一个中央区域显示关键芳香残基（Phe-135）和两端的基本残基（Lys-113和Arg-158）。在分隔这一典型三联体的每段中间，有一个N-糖基化位点（Asn-122和Asn-149）。最后这些区域并不直接参与神经节苷脂结合，因此与这些天冬酰胺残基相连的低聚糖可以完美地插入神经节苷糖的糖头组之间。

图10

SARS-CoV-2棘突蛋白神经节苷脂结合域（GBD）的氨基酸序列比对。（a） 临床SARS-CoV-2分离株与参考序列（6VSB_a，片段111-162）一致。参与GM1结合的氨基酸残基用红色表示。作为糖基化位点的两个天冬酰胺残基用黄色突出显示。（b） 人类和动物病毒与SARS-CoV-2的比对（6VSB_A，片段111-162）。缺失以绿色突出显示，参与神经节苷脂结合的残基的氨基酸变化以蓝色突出显示，GBD的保守残基以红色突出显示，作为糖基化位点的天冬酰胺残基以黄色突出显示。

人们还注意到，NTD的神经节苷脂结合域在蝙蝠RaTG13中完全保守，这表明蝙蝠冠状病毒与目前世界各地流行的人类分离物之间存在密切关系。然而，该基序在其他蝙蝠和人类相关冠状病毒中略有不同(图10)这表明最近的一种进化，至少可以部分解释为什么SARS-CoV-2比以前特征的人类冠状病毒更具传染性。

4 讨论

与糖蛋白和神经节苷脂相关的唾液酸被广泛的病毒用作细胞进入的受体和/或附着因子[10]这些病毒包括影响呼吸道的主要人类病原体，如流感[21]和冠状病毒[22，23]唾液酸细胞表面结构的附着由属于病毒尖峰的受体结合蛋白介导。对于冠状病毒，这种功能由S糖蛋白实现[9，24]SARS-CoV和SARS-CoV-2与ACE-2蛋白相互作用，ACE-2蛋白质已被确定为病毒传染性的关键决定因素[8]然而，考虑到与SARS-CoV相比SARS-CoV-2的传播性增加，仅与ACE-2结合可能不足以确保上呼吸道的强烈感染。因此，SARS-CoV-2可能还与其他细胞表面附着因子结合，例如唾液酸糖蛋白和神经节苷脂。与这一概念相一致，研究表明，神经氨酸酶处理后细胞表面唾液酸的耗竭抑制了MERS-CoV进入人气道细胞[25]这些数据提供了唾液酸在人类冠状病毒附着中发挥关键作用的直接证据，拓宽了阻止SARS-CoV-2复制的治疗选择，SARS-CoV 2是导致新冠肺炎大流行的原因。

很少有药物显示出持续的抗病毒效果在体外以及SARS-CoV-2感染患者的疗效报告[3，12]其中，CLQ很有意思，因为它的化学结构是基于阳离子氮原子和芳香环的组合。这两种特征被证明是蛋白质识别唾液酸和神经节苷脂的关键决定因素[20，26]建模方法已成功用于破译蛋白质-糖相互作用的各种分子机制，从而解释病毒的相互作用[27]、细菌[28]，薄膜[13]和淀粉样蛋白[20]与细胞表面糖脂结合。该电子策略用于揭示CLQ和CLQ-OH对抗SARS-CoV-2感染的抗病毒机制的分子机制。首先，研究表明，CLQ和CLQ-OH很容易与唾液酸结合，具有高亲和力，包括冠状病毒识别的典型9-O-SIA亚型[23]接下来，发现CLQ和CLQ-OH也与含唾液酸的神经节苷脂结合。基于这些数据，这些药物还可能识别糖蛋白的唾液酸残基。进一步的研究将有助于澄清这一点。

这项分子模型研究在SARS-CoV-2 S蛋白的NTD中发现了一种新型神经节苷脂结合域。神经节苷脂结合域由富含芳香族和碱性氨基酸残基的大平面界面组成。它包含52个氨基酸残基（111–162），比迄今为止所有线性神经节苷脂结合域都长[29]然而，新的SARS-CoV-2基序被组织成三个不同的区域，包括一个中心芳香结构域和两个末端基本结构域(图10). 因此，该基序显示了决定神经节苷脂最佳结合的典型特征（即CH-π堆积和静电相互作用）。

本研究的一个主要结果是证明CLQ和CLQ-OH显示的分子基团完全模拟了S蛋白与神经节苷脂结合的方式。两个CLQ（或两个CLQ-OH）分子可以同时与神经节苷脂GM1的极性头部基团结合。有趣的是，这些模拟表明CLQ-OH比CLQ更有效，这与报道的CLQ-OH对SARS-CoV-2的抗病毒活性增加一致[30]一旦与GM1结合，这些药物将阻止接触神经节苷脂的Glc和GalNAc单位，这两个单位分别是Phe-135和Asn-137的关键结合残基。这种氨基酸二元体，以及通过SARS-CoV-2尖峰介导神经节苷脂结合的所有其他残基，在世界各地的临床分离物中完全保守。它在蝙蝠RaTG13分离物中也很保守，这加强了蝙蝠传人的假设。从流行病学的角度来看，可以假设该基序的进化通过改善S-神经节苷脂相互作用增强了人类冠状病毒对呼吸道的粘附能力。

5 结论

鉴于全球卫生紧急情况，药物再利用显然是一种选择[2，3]然而，通过电子测试来确定任何潜在的抗SARS-CoV-2抗体破坏S蛋白与宿主细胞膜的相互作用的能力，可以节省大量时间。应用于RBD–ACE-2和NTD–神经节苷脂相互作用，这种分子模型方法将有助于选择那些可能干扰病毒颗粒最初附着到呼吸道表面上皮的药物。研究数据支持使用CLQ，并优先使用CLQ-OH作为SARS-CoV-2感染患者的初始治疗。

致谢

基金：没有。

竞争利益：未申报。

道德认可：不需要。

笔记

编辑：Jean-Marc Rolain

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文章来自国际抗菌剂杂志由以下人员提供爱思维尔