LncRNA PCAT-1通过海绵miR-508-3p调控ANXA10表达促进ESCC进展

MiRNAs、小干扰RNA（siRNAs）、质粒和细胞转染

miRNAs包括miR-508模拟物（miR-mimics）、抑制剂（miR抑制剂）和相应的阴性对照物（NC；mimics NC和抑制剂NC），PCAT1和加扰siRNA的siRNAs购自Ribobio（中国广州）。过度表达PCAT-1（pcDNA3.1-PCAT-1）或annexin A10（ANXA10；pcDNA3.1-ANXA10）的载体购自GenePharma（中国上海）。使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，Carlsbad，USA）进行用miRNA、siRNA或质粒转染的细胞。

细胞增殖试验

细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析（Sigma-Aldrich）用于测量ESCC细胞的增殖。简单地说，100μL细胞悬浮液（5 x 10^三将细胞/mL）加入96-well板中，分别培养24、48、72和96h。然后，将10μL CCK-8试剂添加到每个孔中，并在37°C下孵育2小时。使用微板分光光度计（Thermo Fisher Scientific）在450 nm处测量光密度。

细胞迁移和侵袭检测

使用来自康宁（美国康宁）的transwell插入物进行细胞侵袭检测。在分析之前，用50μL Matrigel涂敷膜（孔径为8μm）（30μg/孔；BD Biosciences，San Jose，USA）。开始分析时，ESCC细胞（1 x 10⁶细胞/mL）再次悬浮在100μL无FBS培养基中，并接种到24孔板中的跨孔插入物的上室中。下室用含10%FBS的600μL培养基填充。37°C孵育24 h后，将位于跨孔膜下表面的入侵细胞固定并用结晶紫染色。细胞的图像是用尼康显微镜和数码相机记录下来的。

采用伤口愈合试验进行细胞迁移。简单地说，细胞密度为1 x 10⁶将细胞/mL接种到6孔板中，使其生长至80%汇合形成单层。用200μL移液管尖端划过微孔中心的细胞单层，用培养基轻轻冲洗微孔两次，去除分离的细胞。再培养48小时后，清洗细胞并固定。这些细胞的图像是用配备了数码相机的尼康显微镜记录下来的。

荧光素酶报告分析

在pGL3载体（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）荧光素酶基因下游扩增并克隆PCAT-1基因和ANXA10 3非翻译区（3 UTR）中的结合位点，产生宽型质粒（PCAT-1-WT和ANXA103 UTR-WT）。在质粒PCAT-1-WT的基础上，通过定点突变获得含有突变种子区的质粒（PCAT-1-MUT和ANXA10 3ʹUTR-MUT）。使用Lipofectamine 2000将KYSE150细胞与各自的miRNA和荧光素酶报告载体共转染。根据制造商的说明书（Promega），使用双荧光素酶报告物测定系统进行荧光素酶测定。

逆转录和定量实时PCR

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen）分离总RNA。使用相同数量的总RNA（1μg），使用PrimeScript RT Master Mix Kit（中国大连TaKaRa-Bio）通过逆转录合成cDNA。使用ABI 7900系统（ABI）在95°C下进行实时PCR，持续30秒，然后进行40个95°C循环，持续5秒，60°C循环30秒^-ΔΔCt该方法用于数据的相对量化，所有值均归一化为U6或GAPDH（视情况而定）。

Western Blot分析

为了相对量化ANXA10蛋白的表达，用10%SDS-PAGE将等量（20μg）的蛋白溶解并转移到PVDF膜上（Bio-Rad，CA，USA）。在5%非脂肪乳中封闭1小时后，PVDF膜与ANXA10（细胞信号技术，丹佛，美国）一级抗体在4°C下稀释至5%非脂肪奶中培养过夜。然后，在室温下将膜与辣根过氧化物酶偶联二级抗体（细胞信号技术）孵育2 h。化学发光信号通过ChemiDoc XRS凝胶文件系统（Bio-Rad）开发和检测。GAPDH被用作负荷控制。

裸鼠肿瘤异种移植模型

SCID小鼠（6周龄）取自北京维他河实验动物科技有限公司（中国北京）。简单地说，通过将sh-control和sh-PCAT-1 KYSE150细胞注射到小鼠右侧，在雄性SCID小鼠体内建立异种移植瘤。每周监测肿瘤体积5周，按长×宽计算²/2.在处死时，取出肿瘤，称重并储存在−80°C下，以供进一步分析。本研究经南京医科大学附属淮安市第一人民医院机构动物护理与使用委员会批准。实验按照国家实验动物福利指南（中国科学技术部）进行。

PCAT-1作为ceRNA抑制miR-503-3p的表达

使用StarBase在线分析工具，发现miR-508-3p可能与PCAT-1结合，推测结合位点如图2A为了研究miR-508-3p和PCAT-1之间的相互作用，使用miR-508-3p模拟物和抑制剂来操纵其在ESCC细胞中的表达。在KYSE150单元中，如所示图2BmiR-508-3p模拟物和抑制剂分别成功地增加和降低了miR-508-13p的相对表达水平。双荧光素酶报告子分析表明，含有PCAT-1-WT而非PCAT-1-MUT的报告子的荧光素素酶活性与KYSE150细胞中miR-508-3p的表达呈负相关(图2C和​和D）。天). 因此，KYSE150细胞中PCAT-1的相对表达也与miR-508-3p的表达呈负相关(图2E). 另一方面，miR-508-3p的相对表达水平分别通过PCAT-1的过度表达和敲除而下调和上调(图2F–小时). 此外，如所示图2IPCAT-1的过度表达也导致KYSE150细胞的增殖增加。在miR-508-3p模拟物的存在下，KYSE150细胞增殖的增加减少。同样，PCAT-1的过度表达增加了KYSE150细胞的侵袭和迁移，miR-508-3p模拟物逆转了这种增加(图2J和​和KK（K）).

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图2

PCAT-1通过充当ceRNA抑制miR-503-3p的表达(A类)StarBase在线分析工具揭示的PCAT-1和miR-508-3p之间的推定结合位点。(B类)qRT-PCR检测转染不同miRNAs后KYSE150细胞中miR-508-3p的表达。(C、 D类)Dual-Luciferase Reporter分析系统在与各自的miRNAs和荧光素酶报告载体（PCAT-1-WT或PCAT-1-MUT）联合转染后，测定KYSE150细胞中的荧光素酶活性。(电子)qRT-PCR检测转染相应miRNAs后KYSE150细胞中PCAT-1的表达。(如果)用空载体（pcDNA3.1）或pcDNA3.1-PCAT-1转染KYSE150细胞后，用qRT-PCR测定PCAT-1的表达。(G公司)用空载体（pcDNA3.1）或pcDNA3.1-PCAT-1转染KYSE150细胞后，qRT-PCR测定miR-508-3p的表达。(H（H）)qRT-PCR测定转染si-NC或si-PCAT-1后KYSE150细胞中miR-508-3p的表达。(I–K型)CCK-8实验、跨孔侵袭实验和伤口愈合实验分别检测了与Vector+mimics NC、Vector+micros、PCAT-1+micros NC或PCAT-1+miR mimics共转染后KYSE细胞的增殖、侵袭和迁移能力。N=3*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。

PCAT-1通过作为miR-508-3p海绵调节ANXA10的表达来调节ESCC的进展

此外，使用StarBase在线分析工具，还发现miR-508-3p可能与ANXA10 3ʹUTR结合，推测结合位点如图3A。如所示图3B和​和C，C类双荧光素酶报告子分析表明，含有ANXA10 3ʹUTR-WT而非ANXA10 3UTR-MUT的报告子的荧光素酶活性与KYSE150细胞中miR-508-3p的表达呈负相关。此外，在KYSE150细胞中，miR-508-3p模拟物和抑制剂分别下调和上调ANXA10的mRNA和蛋白表达(图3D和​和E）。电子). 鉴于lncRNA PCAT-1和miR-508-3p之间的直接关系，还探讨了PCAT-1对ANXA10的调节。如所示图3F和​和G，G公司在敲除KYSE150细胞中的PCAT-1后，ANXA10的mRNA和蛋白表达均下调。此外，PCAT-1的过度表达导致ANXA10的mRNA和蛋白表达增加，这种增加在miR-508-3p模拟物的存在下也被逆转(图33H和​和我我).

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图3

PCAT-1通过作为miR-508-3p海绵调节ANXA10的表达来调节ESCC的进展。(A类)StarBase V3.0在线分析工具揭示的ANXA10 3ʹUTR和miR-508-3p之间的推定结合位点。(B、 C类)双荧光素酶报告子测定系统测定了与各自的miRNA和荧光素酶报告子载体（ANXA10 3 UTR-WT或ANXA10 3 UTR-MUT）共转染后KYSE150细胞中的荧光素酶活性。(D、 E类)qRT-PCR和Western blot分析测定了转染相应miRNAs后KYSE150细胞中ANXA10 mRNA和蛋白的表达水平。(F、 G公司)qRT-PCR和Western blot分析测定了转染si-NC或si-PCAT-1后KYSE150细胞中ANXA10 mRNA和蛋白的表达水平。(H、 我)qRT-PCR和Western blot分析测定了与Vector+mimics NC、PCAT-1+mimic NC或PCAT-1+miR mimics联合转染后KYSE150细胞中ANXA10 mRNA和蛋白的表达水平。(J、 K（K）)qRT-PCR和Western blot分析测定了转染pcDNA3.1（载体）或pcDNA3.1-ANXA10后KYSE150细胞中ANXA10 mRNA和蛋白的表达水平。(左旋-右旋)CCK-8实验、跨孔侵袭实验和伤口愈合实验分别检测了与Vector+mimics NC、Vector+si-NC、ANXA10+si-NC或ANXA10+si-PACT-1共转染后KYSE细胞的增殖、侵袭和迁移能力。N=3*P<0.05和**P<0.01。

转染pcDNA3.1-ANXA10后，ANXA10的mRNA和蛋白表达水平均上调(图3J和​和K）。K（K）). 更重要的是，如所示图3L，ANXA10的过度表达也导致KYSE150细胞的增殖增加，这种增加被PCAT-1敲除所逆转。此外，ANXA10过表达也刺激KYSE150细胞的侵袭和迁移，PCAT-1的敲除逆转了ANXA10的这种作用。

本研究得到南京医科大学附属淮安第一人民医院的支持。